非还原 SDS-PAGE 分析与化学交联相结合, 检测培养基细胞中的多物质配合物, 以确认培养中的多物质配合
Summary
长期以来, 人们一直知道二硫化的联系可以稳定许多蛋白质的结构。通过非还原 SDS-PAGE 分析, 是分析通过这些联系稳定的多聚体复合物的一种简单方法。本文通过对人骨骨肉瘤细胞系 U-2 OS 的 dUTPase 核等形态的分析, 说明了该方法的应用。
Abstract
许多蛋白质的结构是通过共价二硫连接稳定的。在最近的工作中, 这种债券也被归类为翻译后的修改。因此, 能够研究活细胞中的这种修饰是很重要的。通过两步法进行非还原 SDS-PAGE 分析和甲醛交联, 是分析这些半胱氨酸稳定多聚体复合物的一种简单方法。这种两步法由于技术简单、运行成本低, 有利于发现通过二硫化连接稳定的多质配合物的第一步。在这里, 通过对 utpase 核等形式的具体分析, 用人骨骨肉瘤细胞系 U-2 os 对该方法进行了说明。
Introduction
长期以来, 人们一直知道二硫化的联系可以稳定许多蛋白质的结构。在最近的工作中, 这种键也被归类为可逆的翻译后修饰, 作为一个基于 cystein 的 “氧化还原开关”, 允许调节蛋白质功能, 位置和相互作用1,2, 3,4。因此, 能够研究这种修改是很重要的。通过非还原 SDS-PAGE 分析 5, 是分析这些半胱氨酸稳定多聚类复合物的一种简单方法。SDS-PAGE 分析是许多实验室使用的一种技术, 在这种技术中, 可以快速、轻松、以最低的成本快速获得和解释结果, 并且比用于识别质谱等二硫联系的其他技术更有利. ,7和圆形二色 8.
确定这种方法是否是有助于研究的适当技术的一个重要步骤是彻底检查感兴趣的蛋白质的主要序列, 以确保存在半胱氨酸残留物。另一个有用的步骤是研究任何以前发表的晶体结构或使用生物信息学应用来探索感兴趣的蛋白质的三维结构, 以可视化半胱氨酸残渣可能位于何处。如果残渣存在于外部表面, 它可能是一个更好的候选物, 以形成一个二硫化链接, 而不是半胱氨酸残留物埋在结构内部。然而, 重要的是要注意的是, 蛋白质可能会在底物相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用时发生结构性变化, 从而使这些残留物也暴露在环境中。
然后, 可以用化学交联法使用甲醛来验证已鉴定的多聚体配合物。甲醛是这种验证技术的理想交联剂, 因为细胞渗透率高, 交联跨度短, 约 2-3, 确保检测特定的蛋白质-蛋白质相互作用9,10。本文通过对人骨骨肉瘤细胞系 U-2 OS 11 的核异态分析, 说明了该方法的应用.然而, 该协议可适用于其他细胞系、组织和生物。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文概述的方法为通过二硫连接稳定的多聚体配合物的分析提供了一种直接的协议。该协议可以很容易地适应其他细胞培养系、组织和生物, 允许广泛的应用。
这一过程中的一个重要步骤是确保二硫连接不是提取过程的结果。任何游离半胱氨酸残留物都可以使用碘乙酰胺13阻止。这种烷基化剂通过其硫醇基团与半胱氨酸残基共价结合, 阻止新二硫醚键的形成?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢詹妮弗·费舍尔博士为纯化 dUTPase 多克隆抗体和 Kerri Ciccaglione 所做的努力, 为帮助编辑这份手稿所做的一切努力。这项研究得到了新泽西卫生基金会赠款的部分支持 (赠款 #PC 11-18)。
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
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