Сочетая Неуменьшающие СДС-СТРАНИЧНЫЙ анализ и химические перекрестные ссылки для обнаружения Мультимерных комплексов, стабилизированных дисульфидными связями в клетках млекопитающих в культуре
Summary
Соединений дисульфида длиной были знаны, что стабилизировали структуру много протеинов. Простой метод анализа мультимерных комплексов, стабилизированных этими связями, заключается в неуменьшении анализа СДС-СТРАНИЧКА. Здесь, этот метод проиллюстрирован путем анализировать ядерную изоформу dUTPase от людской косточки остеосаркомы клетки линии U-2 OS.
Abstract
Структуры многих белков стабилизируются с помощью ковалентных дисульфидных связей. В последние работы, эта связь была также классифицируется как пост-поступательного модификации. Таким образом, важно уметь изучать эту модификацию в живых клетках. Простой метод для анализа этих цистеин стабилизировались мультимерные комплексы через двухступенчатый метод не снижения СДС-СТРАНИЧНЫЙ анализ и формальдегид кросс-ссылок. Этот двухступенчатый метод выгоден в качестве первого шага к выявлению мультимерных комплексов, стабилизированных дисульфидными связями из-за его технической легкости и низкой стоимости эксплуатации. Здесь, человеческая кость остеосаркомы клеточной линии U-2 OS используется для иллюстрации этого метода, специально анализируя ядерную Изоформа dUTPase.
Introduction
Соединений дисульфида длиной были знаны, что стабилизировали структуру много протеинов. В последние работы, эта связь также была классифицирована как обратимые после поступательного изменения, действуя как цистеин основе “редокс переключатель”, позволяющий модуляции функции белка, местоположение и взаимодействие1,2, 3,4. Таким образом, важно иметь возможность изучить эту модификацию. Простой метод для анализа этих цистеин стабилизированных мультимерные комплексы через несокращения СДС-PAGE анализ5. Анализ СДД-страниц является методом, используемым во многих лабораториях, где результаты могут быть получены и интерпретируются быстро, легко и с минимальными затратами, и выгодно по сравнению с другими методами, используемыми для выявления дисульфидных связей, таких как масс-спектрометрия6 ,7 и круговой дихроизм8.
Одним из важных шагов в определении, если этот метод является подходящим методом для оказания помощи в исследовании является тщательное изучение первичной последовательности белка интерес застраховать есть цистеин остаток (ы) настоящее время. Еще одним полезным шагом является исследование каких-либо предыдущих кристаллических структур опубликованы или использовать Биоинформатика приложения для изучения трехмерной структуры белка интерес для визуализации, где остаток цистеина (ы) могут быть расположены. Если остаток (ы) присутствует на внешней поверхности это может быть лучшим кандидатом для формирования дисульфидной связи, а не цистеин остаток похоронен на внутренней стороне структуры. Тем не менее, важно отметить, что белки могут подвергнуться структурным изменениям после подложных взаимодействий или белков белка взаимодействий, позволяющих эти остатки затем становятся подвержены воздействию окружающей среды, а также.
Выявленные мультимерные комплексы можно затем проверить с помощью химического скрещиывания, используя формальдегид. Формальдегид является идеальным кросс-Linker для этого технику проверки из-за высокой проницаемости клеток и коротких кросс-ссылок пролета ~ 2-3 е, обеспечивая обнаружение специфических белок-белковых взаимодействий9,10. Здесь, этот метод иллюстрируется путем анализа ядерного Изоформа dUTPase из человеческой кости остеосаркомы клеточной линии U-2 OS11. Однако, этот протокол может быть адаптирован для других клеточных линий, тканей и организмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, изложенная здесь, дает прямой протокол для анализа мультимногомерных комплексов, стабилизированных через дисульфидные связи. Этот протокол может быть легко адаптирован к другим клеточных линий культуры, тканей и организмов, позволяющих для широкого спектра применений.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с благодарностью оцениваем усилия, выдвинутые д-р Дженнифер Фишер для очистки поликлональных антител dUTPase и Керри Чиккалион за все ее усилия, чтобы помочь редактировать эту рукопись. Это исследование было частично поддержано грантом фонда здоровья Нью-Джерси (Грант #PC 11-18).
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
- Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
- Groitl, B., Jakob, U. Thiol-based redox switches. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).
- Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
- Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
- Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
- Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
- Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
- Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
- Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
- Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
