Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd
Summary
Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. Een eenvoudige methode om multimeric complexen te analyseren die door deze aaneenschakelingen worden gestabiliseerd is door niet-vermindert SDS-pagina analyse. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS.
Abstract
De structuren van vele proteïnen worden gestabiliseerd door covalente disulfide aaneenschakelingen. In recent werk is deze obligatie ook geclassificeerd als een post-translationele modificatie. Zo is het belangrijk om deze modificatie in levende cellen te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door een methode in twee stappen van niet-vermindert SDS-pagina analyse en formaldehyde het cross-linking. Deze methode in twee stappen is voordelig als de eerste stap aan het blootleggen multimeric complexen die door disulfide aaneenschakelingen worden gestabiliseerd toe te schrijven aan zijn technisch gemak en lage kosten van verrichting. Hier, de Human Bone Osteosarcoom Cell line U-2 OS wordt gebruikt om deze methode te illustreren door specifiek analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase.
Introduction
Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. In recent werk, deze band is ook geclassificeerd als een omkeerbare post-translationele modificatie, als een cysteïne-gebaseerde “redox switch” waardoor de modulatie van de eiwitfunctie, locatie en interactie1,2, 3,4. Zo is het belangrijk om deze wijziging te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door niet-vermindert SDS-pagina analyse5. SDS-pagina analyse is een techniek die in vele laboratoria wordt gebruikt, waar de resultaten kunnen worden verkregen en worden geïnterpreteerd snel, gemakkelijk, en met minimale kosten, en is voordelig over andere technieken die worden gebruikt om disulfide aaneenschakelingen zoals massaspectrometrie 6 te identificeren ,7 en circulaire dichroism8.
Een belangrijke stap in het bepalen of deze methode is een geschikte techniek om te helpen bij een studie is om grondig te onderzoeken de primaire sequentie van het eiwit van belang te verzekeren zijn er cysteïne residu (s) aanwezig. Een andere nuttige stap moet om het even welke vorige gepubliceerde kristalstructuren onderzoeken of een bioinformatica toepassing gebruiken om de driedimensionele structuur van de proteïne van belang te onderzoeken om te visualiseren waar het cysteïne residu (s) kan worden gevestigd. Als het residu (s) aanwezig is op de buitenkant kan het een betere kandidaat om een disulfide koppeling in plaats van een cysteïne residu begraven op de binnenkant van de structuur te vormen. Het is echter belangrijk op te merken dat eiwitten structurele veranderingen kunnen ondergaan op substraat interacties of eiwit-Eiwitinteracties waardoor deze residuen vervolgens worden blootgesteld aan het milieu ook.
Geïdentificeerde multimeric complexen kan vervolgens worden geverifieerd met chemische cross-linking met behulp van formaldehyde. Formaldehyde is een ideale cross-linker voor deze verificatie techniek als gevolg van de hoge cel permeabiliteit en korte cross-linking span van ~ 2-3 Å, zorgen voor de opsporing van specifieke eiwit-Eiwitinteracties9,10. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS11. Dit protocol kan echter worden aangepast voor andere cel lijnen, weefsels en organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier geschetste methode geeft een rechttoe rechtaan protocol voor de analyse van multimeric complexen gestabiliseerd door disulfide verbanden. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere cellen cultuurlijnen, weefsels en organismen waardoor een breed scala van toepassingen.
Een belangrijke stap in deze procedure is ervoor te zorgen dat de disulfide verbanden geen gevolg zijn van de extractie procedure. Elke vrije cysteïne residuen kunnen worden geblokkeerd met behulp van iodoa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij waarderen de inspanningen naar voren gebracht door Dr Jennifer Fischer voor de reiniging van de dUTPase polyclonal antilichaam en Kerri Ciccaglione voor al haar inspanningen om te helpen dit manuscript te bewerken. Dit onderzoek werd deels ondersteund door een subsidie van de New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
- Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
- Groitl, B., Jakob, U. Thiol-based redox switches. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).
- Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
- Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
- Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
- Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
- Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
- Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
- Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
- Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
