Combinando análise de SDS-PAGE não redutora e reticulação química para detectar complexos multiméricos estabilizados por ligações de dissulfeto em células de mamíferos na cultura

Summary

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Um método simples para analisar complexos multimérica estabilizados por estas ligações é através da análise de SDS-PAGE não-reduzindo. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS.

Abstract

As estruturas de muitas proteínas são estabilizadas através de ligações de dissulfeto covalente. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação em células vivas. Um método simples para analisar estes complexos multimérica cisteína-estabilizados é através de um método de duas etapas de não-reduzindo a análise SDS-PAGE e o cross-linking do formaldehyde. Este método de duas etapas é vantajoso como o primeiro passo para desvendar complexos multiméricos estabilizados por ligações dissulfeto devido à sua facilidade técnica e baixo custo de operação. Aqui, a linha celular do osteosarcoma do osso humano U-2 ósmio é usada para ilustrar este método analisando especificamente o isoforma nuclear de dUTPase.

Introduction

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional reversível, atuando como um “interruptor redox” baseado em cisteína, permitindo a modulação da função protéica, localização e interação^{1,2, 3,4}. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação. Um método simples para analisar esses complexos multiméricos estabilizados com cisteína é através da análise de SDS-PAGE não redutora⁵. A análise de SDS-PAGE é uma técnica usada em muitos laboratórios, onde os resultados podem ser obtidos e interpretados rapidamente, fàcilmente, e com custos mínimos, e são vantajosos sobre outras técnicas usadas para identificar ligações do dissulfide tais como a espectrometria maciça^{6 ,7} e Dicroísmo circular⁸.

Uma etapa importante em determinar se este método é uma técnica apropriada a ajudar em um estudo é examinar completamente a seqüência preliminar da proteína do interesse para segurar lá é resíduo do cisteína (s) atual. Outro passo útil é Pesquisar quaisquer estruturas de cristais anteriores publicadas ou usar uma aplicação de Bioinformática para explorar a estrutura tridimensional da proteína de interesse para visualizar onde os resíduos de cisteína podem ser localizados. Se o resíduo (s) está presente na superfície exterior pode ser um candidato melhor para formar uma ligação dissulfeto em vez de um resíduo de cisteína enterrado no interior da estrutura. No entanto, é importante notar que as proteínas podem sofrer alterações estruturais em interações de substrato ou interações proteína-proteína, permitindo que esses resíduos, em seguida, tornar-se exposto ao ambiente também.

Os complexos multimérica identificados podem então ser verificados com cross-linking químico usando o formaldehyde. O formaldehyde é um cross-linker ideal para esta técnica da verificação devido à permeabilidade elevada da pilha e à extensão cross-linking curta de ~ 2-3 Å, assegurando a deteção de interações específicas da proteína-proteína^9,10. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS¹¹. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para outras linhas celulares, tecidos e organismos.

Protocol

1. bloqueando os resíduos de cisteína livre usando Iodoacetamida Cresça as pilhas U-2 do ósmio em um prato de 6 cm2 a 50%-a confluência de 60% no meio essencial mínimo com glicose elevada que contem o soro bovino fetal de 10% e o piruvato de sódio de 1% em 37 ° c em 5% co2. Fazer um estoque fresco de 10 mM iodoacetamida apenas antes de usar, em seguida, descartar qualquer reagente não utilizado. Adicione a iodoacetamida de concentração final de 0,1 mM diretam…

Representative Results

A dUTPase nuclear forma uma articulação dissulfeto intermolecular formando uma configuração de dímero estável através da interação de dois resíduos de cisteína posicionados no terceiro aminoácido de cada proteína monomérica11. Isto é demonstrado na Figura 1a, B. Para garantir que essa articulação dissulfeto não foi uma interação não específica devido a anormalidades migratórias no ambiente não r…

Discussion

O método esboçado aqui dá um protocolo reto-forward para a análise de complexos multimérica estabilizados através dos LINKAGES do dissulfide. Este protocolo pode facilmente ser adaptado a outras linhas da cultura de pilha, tecidos e organismos permitindo uma escala de aplicações larga.

Um passo importante neste procedimento é garantir que as ligações dissulfeto não são uma consequência do procedimento de extração. Qualquer resíduo de cisteína livre pode ser bloqueado usando i…

Materials

16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090