Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture
Summary
Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Une méthode simple pour analyser les complexes multimères stabilisés par ces liaisons est une analyse SDS-PAGE non réductrice. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS.
Abstract
Les structures de nombreuses protéines sont stabilisées par des liaisons disulfures covalentes. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-traductionnelle. Ainsi, il est important de pouvoir étudier cette modification dans les cellules vivantes. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est par une méthode en deux étapes d’analyse SDS-PAGE non réductrice et de réticulation du formaldéhyde. Cette méthode en deux étapes est avantageuse comme première étape pour découvrir les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures en raison de sa facilité technique et de son faible coût de fonctionnement. Ici, la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS est utilisée pour illustrer cette méthode en analysant spécifiquement l’isoforme nucléaire de dUTPase.
Introduction
Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-translationnelle réversible, agissant comme un “commutateur redox” à base de cystéine permettant la modulation de la fonction de protéine, de l’emplacement et de l’interaction1,2, 3,4. Il est donc important de pouvoir étudier cette modification. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est de ne pas réduire l’analyse SDS-PAGE5. L’analyse SDS-PAGE est une technique utilisée dans de nombreux laboratoires, où les résultats peuvent être obtenus et interprétés rapidement, facilement et avec des coûts minimes, et est avantageux par rapport aux autres techniques utilisées pour identifier les liaisons disulfure telles que la spectrométrie de masse6 ,7 et dichroïsme circulaire8.
Une étape importante pour déterminer si cette méthode est une technique appropriée pour aider dans une étude est d’examiner attentivement la séquence primaire de la protéine d’intérêt pour s’assurer qu’il y a des résidus de cystéine (s) présents. Une autre étape utile est de rechercher toutes les structures cristallines précédentes publiées ou d’utiliser une application de bioinformatique pour explorer la structure tridimensionnelle de la protéine d’intérêt pour visualiser où le résidu de cystéine (s) peut être localisé. Si le ou les résidus sont présents sur la surface extérieure, il peut être préférable de former un lien disulfure plutôt qu’un résidu de cystéine enterré à l’intérieur de la structure. Cependant, il est important de noter que les protéines peuvent subir des changements structurels sur des interactions de substrat ou des interactions protéine-protéine permettant à ces résidus d’être alors exposés à l’environnement aussi bien.
Les complexes multimères identifiés peuvent ensuite être vérifiés avec un réticulation chimique à l’aide de formaldéhyde. Le formaldéhyde est un lien de croisement idéal pour cette technique de vérification en raison de la perméabilité cellulaire élevée et de la courte portée croisée de ~ 2-3 Å, assurant la détection d’interactions protéine-protéine spécifiques9,10. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS11. Cependant, ce protocole peut être adapté pour d’autres lignées cellulaires, tissus et organismes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici donne un protocole direct pour l’analyse des complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures. Ce protocole peut facilement être adapté à d’autres lignées de culture cellulaire, des tissus et des organismes permettant une large gamme d’applications.
Une étape importante dans cette procédure est de s’assurer que les liaisons disulfure ne sont pas une conséquence de la procédure d’extraction. Tous les résidus de cystéine libre peuvent êt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous apprécions avec gratitude les efforts déployés par le Dr Jennifer Fischer pour la purification de l’anticorps polyclonaux dUTPase et Kerri Ciccaglione pour tous ses efforts pour aider à éditer ce manuscrit. Cette recherche a été partiellement appuyée par une subvention de la New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
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