Microfluïde productie van lysolipidenhoudende temperatuurgevoelige liposomen
Summary
Het protocol presenteert de geoptimaliseerde parameters voor de voorbereiding van thermogevoelige liposomen met behulp van de gespreide visgraat micromixer microfluidics apparaat. Dit maakt het ook mogelijk co-inkapseling van doxorubicin en indocyanine groen in de liposomen en de fotothermale geactiveerde release van doxorubicin voor gecontroleerde / getriggerde drug release.
Abstract
Het gepresenteerde protocol maakt een continue voorbereiding met hoge doorvoer mogelijk van lage temperatuurgevoelige liposomen (LTSLs), die chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen laden, zoals doxorubicin (DOX). Om dit te bereiken, worden een ethanolisch lipidenmengsel en ammoniumsulfaatoplossing geïnjecteerd in een gespreide visgraatmicromixer (SHM) microfluïdisch apparaat. De oplossingen worden snel gemengd door de SHM, het verstrekken van een homogene oplosmiddel omgeving voor liposomen zelfassemblage. Verzamelde liposomen worden eerst ingeannealed, vervolgens dialyseerd om resterende ethanol te verwijderen. Een ammoniumsulfaatpH-gradiënt wordt vastgesteld door bufferuitwisseling van de externe oplossing met behulp van grootteuitsluitingschromatografie. DOX wordt dan op afstand geladen in de liposomen met een hoge inkapseling efficiëntie (> 80%). De verkregen liposomen zijn homogeen in grootte met Z-gemiddelde diameter van 100 nm. Ze zijn in staat om door de temperatuur geactiveerde burst-release van ingekapselde DOX in aanwezigheid van milde hyperthermie (42 °C). Indocyanine groen (ICG) kan ook worden meegeladen in de liposomen voor bijna-infrarood laser-triggered DOX release. De microfluïde benadering zorgt voor een hoge doorvoer, reproduceerbare en schaalbare voorbereiding van LTSLs.
Introduction
LTSL-formulering is een klinisch relevant liposomale product dat is ontwikkeld om het chemotherapeutische medicijn doxorubicin (DOX) te leveren en maakt het mogelijk om een efficiënt burst-medicijn vrij te laten bij klinisch haalbare milde hyperthermie (T ∙ 41 °C)1. De LTSL formulering bestaat uit 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC), de lysolipide 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosphatidylcholine (MSPC; M staat voor “mono”) en PEGylated lipide 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-PEG2000). Bij het bereiken van de faseovergangstemperatuur (Tm ∙ 41 °C) vergemakkelijken de lysolipide en DSPE-PEG2000 samen de vorming van membraanporiën, wat resulteert in een burst-afgifte van het medicijn2. De voorbereiding van LTSLs maakt voornamelijk gebruik van een bulk top-down benadering, namelijk lipide film hydratatie en extrusie. Het blijft een uitdaging om grote partijen met identieke eigenschappen en in voldoende hoeveelheden voor klinische toepassingen te bereiden3.
Microfluidics is een opkomende techniek voor het voorbereiden van liposomen, het aanbieden van tunable nanodeeltjes grootte, reproduceerbaarheid, en schaalbaarheid3. Zodra de productieparameters zijn geoptimaliseerd, kan de doorvoer worden opgeschaald door parallelisatie, met eigenschappen die identiek zijn aan die welke zijn voorbereid op bankschaal3,4,5. Een groot voordeel van microfluidica ten opzichte van conventionele bulktechnieken is de mogelijkheid om kleine vloeibare volumes met een hoge controleerbaarheid in ruimte en tijd te verwerken door middel van miniaturisatie, waardoor een snellere optimalisatie mogelijk is, terwijl het op een continue en geautomatiseerde manier werkt6. De productie van liposomen met microfluïde apparaten wordt bereikt door een bottom-up nanoneerslagbenadering, die meer tijd en energie-efficiënt is omdat homogenisatieprocessen zoals extrusie en sonicatie overbodig zijn7. Typisch, een organische oplossing (bijvoorbeeld ethanol) van lipiden (en hydrofobe payload) wordt gemengd met een verkeerde niet-oplosmiddel (bijvoorbeeld water en hydrofiele payload). Naarmate het organische oplosmiddel zich mengt met het niet-oplosmiddel, wordt de oplosbaarheid voor de lipiden verminderd. De lipideconcentratie bereikt uiteindelijk een kritische concentratie waarbij het neerslagproces wordt geactiveerd7. Nanoprecipitates van lipiden groeien uiteindelijk in omvang en sluiten in een liposoom. De belangrijkste factoren voor de grootte en homogeniteit van de liposomen zijn de verhouding tussen het niet-oplosmiddel en oplosmiddel (d.w.z. water-naar-organische stroomsnelheidverhouding; FRR) en de homogeniteit van het oplosmiddel milieu tijdens de zelfassemblage van lipiden in liposomen8.
Efficiënt mengen van vocht in microfluidica is daarom essentieel voor de bereiding van homogene liposomen, en verschillende ontwerpen van mixers zijn gebruikt in verschillende toepassingen9. Gespreide visgraat micromixer (SHM) vertegenwoordigt een van de nieuwe generaties passieve mixers, die een hoge doorvoer (in het bereik van mL / min) met een lage verdunningsfactor mogelijk maakt. Dit is superieur aan traditionele microfluïde hydrodynamische mengapparaten8,10. De SHM heeft patroon visgraat groeven, die snel mengen vloeistoffen door chaotische advection9,11. De korte mengtijdschaal van SHM (< 5 ms, minder dan de typische aggregatietijdschaal van 10-100 ms) maakt zelfassemblage van lipide mogelijk in een homogene oplosmiddelomgeving, waardoor nanodeeltjes met uniforme grootteverdeling3,12worden geproduceerd.
De bereiding van LTSLs met microfluidics is echter niet zo eenvoudig in vergelijking met conventionele liposomale formuleringen als gevolg van het gebrek aan cholesterol8, zonder welke lipide bilayers gevoelig zijn voor door ethanol geïnduceerde interdigitatie13,14,15. Tot nu toe is het effect van restethanol presenteert tijdens de microfluïde productie van liposomen niet goed begrepen. De meerderheid van de gerapporteerde formuleringen zijn inherent resistent tegen interdigitatie (met cholesterol of onverzadigde lipiden)16, die in tegenstelling tot LTSLs zijn zowel verzadigd en cholesterol-vrij.
Het protocol hierin gebruikt SHM om LTSLs voor te bereiden op de levering van door de temperatuur geactiveerde geneesmiddelen. In de gepresenteerde methode hebben we ervoor gezorgd dat de microfluïde-voorbereide LTSLs nanoformaat (100 nm) en uniform (dispersity < 0.2) zijn door dynamische lichtverstrooiing (DLS). Verder hebben we DOX ingekapseld met behulp van de transmembraan ammoniumsulfaatgradiëntmethode (ook bekend als remote loading)17 als validatie van de integriteit van de LTSL lipide bilayer. Het laden op afstand van DOX vereist dat het liposoom een pH-gradiënt behoudt om een hoge inkapselingsefficiëntie (EE) te bereiken, wat waarschijnlijk niet zal gebeuren zonder een intacte lipidebilaag. In deze gepresenteerde methode, onderscheidend van typische microfluïde liposoom voorbereiding protocollen, een annealing stap is vereist voordat de ethanol wordt verwijderd om de remote laadvermogen mogelijk te maken; d.w.z. om de integriteit van de lipidebilaag te herstellen.
Zoals eerder vermeld, kunnen hydrofiele en hydrofobe payloads ook worden geïntroduceerd in de eerste oplossingen voor de gelijktijdige inkapseling van payloads tijdens de vorming van LTSLs. Als proof-of-concept, indocyanine groen (ICG), een FDA-goedgekeurde nabij-infrarood fluorescerende kleurstof, die ook een veelbelovende fotothermische agent, wordt ingevoerd om de eerste lipide mengsel en met succes samen geladen in de LTSLs. Een 808 nm laser wordt gebruikt om de DOX/ICG-loaded LTSLs te bestralen en met succes te induceren fotothermische verwarming-geactiveerde burst release van DOX binnen 5 min.
Alle instrumenten en materialen zijn commercieel beschikbaar, gebruiksklaar en zonder de noodzaak van maatwerk. Aangezien alle parameters voor het formuleren van LTSLs zijn geoptimaliseerd, volgens dit protocol, onderzoekers zonder voorkennis van microfluidics kon ook de LTSLs, die dient als basis van een thermogevoelig drug delivery systeem voor te bereiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft de bereiding van lage temperatuurgevoelige liposomen (LTSLs) met behulp van een gespreide visgraatmicromixer (SHM). De LTSL10-formulering maakt het mogelijk om de temperatuur geactiveerde burst-release van doxorubicin binnen 5 minuten bij een klinisch haalbare hypertherische temperatuur van 42 °C. Indocyanine groen (ICG) kan ook worden meegeladen voor fotothermische verwarming veroorzaakt de release van DOX. De methode is gebaseerd op: i) zelfassemblage van fosfolipiden tot liposom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship), en de Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) voor financiering.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Referências
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Bioquímica. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA – Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
