リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産
Summary
このプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体装置を用いて、熱感知リポソームを調製するための最適化されたパラメータを提示する。また、リポソームへのドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封、および制御/誘発薬物放出のためのドキソルビシンの光熱誘発放出も可能になる。
Abstract
提示されたプロトコルは、ドキソルビシン(DOX)などの化学療法薬をロードすることができる低温感受性リポソーム(LTSLs)の高スループット連続調製を可能にする。これを達成するために、エタノール性脂質混合物および硫酸アンモニウム溶液を、ずらしたヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)マイクロ流体装置に注入する。この溶液は、SHMによって迅速に混合され、リポソームの自己集合体に均質な溶媒環境を提供する。収集されたリポソームは、まずアニールされ、次いで透析して残留エタノールを除去する。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、外部溶液のバッファー交換により硫酸アンモニウムpH勾配を確立します。その後、DOXは高いカプセル化効率(>80%)でリポソームに遠隔負荷されます。得られたリポソームは、Z平均直径100nmのサイズが均一である。それらは穏やかな温熱(42 °C)の存在の封入されたDOXの温度誘発の破裂解放が可能である。また、近赤外線レーザートリガDOX放出のために、インドシアニングリーン(ICG)をリポソームに共装することもできる。マイクロ流体アプローチにより、高スループット、再現性、拡張性に優れたLTSLの準備が可能になります。
Introduction
LTSL製剤は、化学療法薬ドキソルビシン(DOX)を送達するために開発された臨床的に関連するリポソーム製品であり、臨床的に達成可能な軽度の温熱療法(T≈ 41°C)1での効率的なバースト薬物放出を可能にする。LTSL製剤は、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、リソ脂質1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(MSPC;Mは「モノ」)およびPEGylatelated脂質1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000)を表す。相転移温度(Tm≈ 41°C)に達すると、リソリピッドとDSPE-PEG2000が共に膜細孔の形成を促進し、薬物2のバースト放出をもたらす。LTSLsの調製は、主にバルクトップダウンアプローチ、すなわち脂質膜水和および押出を使用する。臨床用途に十分な量と同じ特性を持つ大規模なバッチを再現可能に準備することは依然として困難です。
マイクロ流体はリポソームを調製する新しい技術であり、チューナブルナノ粒子サイズ、再現性、および拡張性3を提供する。製造パラメータが最適化されると、スループットは、ベンチスケール3、4、5で用意されたものと同じ特性で、並列化によってスケールアップすることができます。従来のバルク技術よりもマイクロ流体の主な利点は、小型化を通じて空間と時間の制御性が高い小さな液体量を処理する能力であり、6の連続的かつ自動化された方法で動作しながら、より速い最適化を可能にする。マイクロ流体デバイスを用いたリポソームの製造は、押出や超音波処理などの均質化プロセスが不要であるため、より時間とエネルギー効率が高いボトムアップナノ沈降アプローチによって達成される7。典型的には、脂質(例えばエタノール)の有機溶液(および疎水性ペイロード)は、混和性の非溶媒(例えば水および親水性ペイロード)と混合される。有機溶媒が非溶媒と混合すると、脂質に対する溶解度が低下する。脂質濃度は、最終的に沈殿プロセスが引き起こされる臨界濃度に達する7.最終的に脂質のナノ沈殿物は大きさに成長し、リポソームに近い。リポソームの大きさと均質性を左右する主な要因は、非溶媒と溶媒の比率(すなわち水性-有機流量比;;FRR)とリポソームへの脂質の自己集合中の溶媒環境の均質性を8にする。
マイクロ流体の効率的な混合は、したがって、均質なリポソームの調製に不可欠であり、および異なる用途9に使用されているミキサーの様々な設計。ずれたヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)は、低希釈因子で(mL /分の範囲で)高いスループットを可能にするパッシブミキサーの新世代の1つを表します。これは従来のマイクロ流体流体混合装置8、10に優れている。SHMは、カオスの対流9、11によって流体を迅速に混合するヘリンボーン溝をパターン化しました。SHMの短い混合タイムスケール(< 5 ms、典型的な凝集時間スケール10〜100 ms未満)は、均一な溶媒環境で脂質自己集合が起こり、均一なサイズ分布3、12のナノ粒子を生成することを可能にする。
しかし、マイクロ流体を用いたLTSLsの調製は、コレステロール8の欠如による従来のリポソーム製剤に比べてそれほど簡単ではなく、脂質二重層がエタノール誘発間桁化を受けやすい13、14、15ではない。これまで、リポソームのマイクロ流体生産時に生じる残留エタノールの効果は十分に理解されていなかった。報告された製剤の大半は、本質的に、LTSLsとは異なり、飽和およびコレステロールフリーである(コレステロールまたは不飽和脂質を含む)間桁に耐性である。
本明細書に提示されるプロトコルは、温度誘発放出薬物送達のためのLTSLsを準備するためにSHMを使用する。この方法では、マイクロ流体調製LTSLsをナノサイズ(100 nm)および動的光散乱(DLS)によって均一(分散度<0.2)にすることを確認しました。さらに、LTSL脂質二重層の完全性の検証として、膜貫通アンモニウム硫酸勾配法(遠隔負荷とも呼ばれる)17を用いてDOXを封入した。DOXのリモートローディングでは、リポソームが高いカプセル化効率(EE)を達成するためにpH勾配を維持する必要があり、これはそのままの脂質二重層なしで起こる可能性は低い。この提示された方法では、典型的なマイクロ流体リポソーム調製プロトコルとは異なって、エタノールを除去して遠隔ローディング能力を可能にするために、アニーリングステップが必要である。すなわち、脂質二重層の完全性を回復する。
前述のように、親水性および疎水性ペイロードは、LTSLsの形成中にペイロードを同時にカプセル化するための初期溶液にも導入することができる。概念実証として、有望な光熱剤でもあるFDA承認の近赤外蛍光色素であるインドシアニングリーン(ICG)が最初の脂質混合物に導入され、LTSLsに共装することに成功しました。808 nmレーザーはDOX/ICG搭載LTSLsを照射し、5分以内にDOXの光熱加熱誘発バースト放出を誘発するのに使用される。
すべての機器と材料は、市販され、すぐに使用でき、カスタマイズの必要はありません。LTSLを処方するためのすべてのパラメータが最適化されているので、このプロトコルに従って、マイクロ流体の予備知識を持たない研究者は、熱感知薬送達システムの基礎となるLTSLsを準備することもできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)を用いた低温感受性リポソーム(LTSLs)の調製を記述する。LTSL10製剤は42 °Cの臨床的に達成可能な高体温で5分以内にドキソルビシンの温度誘発バースト放出を可能にする。また、DOXの放出を引き起こした光熱加熱のために、インドシアニングリーン(ICG)を共装することもできる。この方法は、(i)SHM11におけるエ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、前立腺癌英国(CDF-12-002フェローシップ)、および工学物理科学研究評議会(EPSRC)(EP/M008657/1)に資金を提供してくれたことに感謝します。
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Referências
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