Микрофлюидическое производство лизолипид-содержащих температурно-чувствительных липосом
Summary
Протокол представляет оптимизированные параметры для подготовки термочувствительных липосом с помощью ступенчатой елочка микромиксер microfluidics устройства. Это также позволяет совместно инкапсуляции доксорубицина и индоцианина зеленый в липосомы и фототермальных триггеров выпуска доксорубицина для контролируемого / триггерного выпуска препарата.
Abstract
Представленный протокол обеспечивает высокую пропускную способность непрерывной подготовки низкотемпературно чувствительных липосом (LTSL), которые способны загружать химиотерапевтические препараты, такие как доксорубицин (DOX). Для этого этаноличная липидная смесь и раствор сульфата аммония вводятся в пошатнувшийся микромиксер елочки (SHM). Решения быстро смешиваются SHM, обеспечивая однородную платежеспособную среду для самосборки липосом. Собранные липосомы сначала анзанываются, затем диализуются для удаления остаточного этанола. Аммоний сульфат рН-градиент устанавливается путем буферного обмена внешнего раствора с помощью хроматографии исключения размера. DOX затем удаленно загружается в липосомы с высокой эффективностью инкапсуляции (No gt; 80%). Полученные липосомы однородны по размеру с диаметром 100 нм. Они способны температурного всплеска высвобождение инкапсулированных DOX в присутствии легкой гипертермии (42 градусов по Цельсию). Индоцианин зеленый (ICG) также может быть совместно загружен в липосомы для ближнего инфракрасного лазерного триггера DOX релиз. Микрофлюидный подход обеспечивает высокую пропускную, воспроизводимую и масштабируемую подготовку LTSLs.
Introduction
LTSL формулировка является клинически значимым липосомным продуктом, который был разработан для доставки химиотерапевтического препарата доксорубицин (DOX) и позволяет эффективно ежефтом препарат высвобождение при клинически достижимой мягкой гипертермии (Т З 41 КК)1. Формулировка LTSL состоит из 1,2-дипалмитоила-сна -глицеро-3-фосфохолина (ДППК), лисолипида 1-стеароил-2-гидрокси –sn-glycero-3-фосфатидилхолин (MSPC; M означает “моно”) и PEGylated липид 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-метокси (полиэтиленгликоль)-2000″ (DSPE-PEG2000). По достижении фазы переходной температуры (Tм З 41 КК), лисолипид и DSPE-PEG2000 вместе облегчить образование мембранных пор, в результате чего взрыв релиз препарата2. При подготовке LTSLs в основном используется объемный подход сверху вниз, а именно гидратация липидной пленки и экструзия. По-прежнему сложно подготовить большие партии с идентичными свойствами и в достаточном количестве для клинического применения3.
Microfluidics является новой техникой для подготовки липосом, предлагая tunable размер наночастиц, воспроизводимость, и масштабируемость3. После оптимизации производственных параметров пропускная часть может быть уменьшена путем параллелизации, при этом свойства идентичны тем, которые подготовлены на скамейке3,4,5. Основным преимуществом микрофлюитики по сравнению с обычными методами навалом является способность обрабатывать небольшие объемы жидкости с высокой управляемостью в пространстве и времени через миниатюризацию, что позволяет быстрее оптимизации, при работе в непрерывной и автоматизированной манере6. Производство липосом с микрофлюидными устройствами достигается за счет подхода нанопрейности снизу вверх, который является более эффективным временем и энергоэффективностью, поскольку гомогенизации процессов, таких как экструзия и sonication являются ненужными7. Как правило, органический раствор (например, этанол) липидов (и гидрофобной полезной нагрузки) смешивается с неверным нерастворимым (например, вода и гидрофильные полезные нагрузки). По мере того как органический растворитель смешивается с нерастворимым, растворимость липидов уменьшается. Концентрация липидов в конечном итоге достигает критической концентрации, при которой процесс осадков срабатывает7. Нанопромицираты липидов в конечном итоге растут в размерах и закрываются в липосому. Основными факторами, определяющими размер и однородность липосом, являются соотношение между неплатежеспособным и растворителем (т.е. соотношение скорости между органическим потоком; FRR) и однородность платежеспособной среды при самосборке липидов в липосомы8.
Эффективное смешивание жидкости в микрофлюитике поэтому имеет важное значение для подготовки однородных липосом, и различные конструкции смесителей были использованы в различных приложениях9. Затененный микромиксора елочки (SHM) представляет собой одно из новых поколений пассивных смесителей, что обеспечивает высокую пропускную мощность (в диапазоне мл/мин) с низким коэффициентом разбавления. Это превосходит традиционные микрофлюидные гидродинамические устройства смешивания8,10. SHM имеет узорчатые канавки из елочки, которые быстро смешивают жидкости хаотическим адвакцией9,11. Короткая шкала времени смешивания SHM (Злт; 5 мс, меньше, чем типичная шкала времени агрегации 10-100 мс) позволяет липидной самосборки происходит в однородной среде растворителя, производя наночастицы с равномерной распределения размера3,12.
Подготовка LTSLs с микрофлюитики, однако, не так просто по сравнению с обычными липосомными составами из-за отсутствия холестерина8, без которых липидные двуслойки восприимчивы к этанол индуцированной интерцифровки13,14,15. До сих пор эффект остаточного этанола, представленного при микрофлюидном производстве липосом, не был хорошо понят. Большинство заявленных составов по своей сути устойчивы к межцифровой (содержащий холестерин или ненасыщенные липиды)16, которые в отличие от LTSLs являются как насыщенными, так и без холестерина.
Протокол, представленный в этом проекте, использует SHM для подготовки LTSL для доставки препарата с книжками с книжки с книжкой. В представленном методе мы обеспечили микрофлюидные ПОДГОТОВЛЕННЫе LTSLs нано-размера (100 нм) и однородны (дисперсия злитрона; 0.2) динамическим рассеянием света (DLS). Кроме того, мы инкапсулировали DOX с помощью метода градиента сульфата аммемов transmembrane (также известного как удаленная загрузка)17 в качестве подтверждения целостности липидного двухслойного LTSL. Удаленная загрузка DOX требует липосомы для поддержания рН-градиента для достижения высокой эффективности инкапсуляции (EE), что вряд ли произойдет без нетронутого липидного двухслойного. В этом представленном методе, отличительном от типичных протоколов подготовки микрофлюидных липосом, требуется шаг аннулирования, прежде чем этанол удаляется, чтобы обеспечить возможность удаленной загрузки; т.е. для восстановления целостности липидного двухслойного.
Как упоминалось ранее, гидрофильные и гидрофобные полезные нагрузки могут также быть введены в первоначальные решения для одновременной инкапсуляции полезных нагрузок при формировании ЛТЛ. В качестве доказательства концепции, индоцианин зеленый (ICG), FDA утвержденных ближнего инфракрасного флуоресцентного красителя, который также является перспективным фототермальным агентом, вводится в начальную липидную смесь и успешно совместно загружены в LTSLs. Лазер 808 нм используется для облучения LTSLs, загруженных DOX/ICG, и успешно индуцировать фототермический разрыв, вызванный нагреванием, в течение 5 минут.
Все инструменты и материалы доступны на коммерческой основе, готовы к использованию и без необходимости настройки. Поскольку все параметры для формулирования LTSLs были оптимизированы, после этого протокола, исследователи без предварительного знания микрофлюитики могли бы также подготовить LTSLs, который служит основой термочувствительной системы доставки лекарств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол описывает подготовку низкотемпературно чувствительных липосом (LTSLs) с использованием ступенчатой елочки micromixer (SHM). Формулировка LTSL10 позволяет высвобождение доксорубицина с температурой в течение 5 минут при клинически достижимой гипертермической температур?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Рака предстательной железы Великобритании (CDF-12-002 стипендий), и инженерных и физических наук научно-исследовательский совет (EPSRC) (EP/M008657/1) для финансирования.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Referências
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Bioquímica. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA – Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
