הפקת מיקרופלואידים של Lysolipid המכילים טמפרטורה רגישה ליפוזומים
Summary
הפרוטוקול מציג את הפרמטרים אופטימיזציה עבור הכנת ליפוזומים תרמיים באמצעות המכשיר מיקרו מיקרופלולה המתלא. זה גם מאפשר משותף של דוקסורוביצין ו indocyanine ירוק ליפוזומים ושחרור פוטותרמי המופעל של דוקסורוביצין עבור שליטה מבוקרת/תרופה שהופעלה.
Abstract
הפרוטוקול המוצג מאפשר הכנה רציפה בתפוקה גבוהה של ליפוזומים בטמפרטורה נמוכה (LTSLs), המסוגלים לטעון תרופות כימותרפיות, כגון דוקסורוביצין (חמצון). כדי להשיג את זה, תערובת השומנים ethanolic ואת הפתרון אמוניום גופרתי מוזרק לתוך המכשיר מיקרופלוהעצם הסטה (SHM) מיקרומטר. הפתרונות מעורבבים במהירות על ידי SHM, מתן סביבת הממס הומוגנית עבור הרכבה עצמית ליפוזומים. ליפוזומים שנאספו מושקעים. לאחר מכן כדי להסיר אתנול שיורית מעבר הדרגתי של אמוניום גופרתי מבוסס באמצעות חילופי מאגרים של הפתרון החיצוני באמצעות כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל. לאחר מכן, החמצון נטען מרחוק לתוך היפוזומים עם יעילות כימוס גבוהה (> 80%). ליפוזומים שהתקבלו הם הומוגנית בגודל עם קוטר Z ממוצע של 100 ננומטר. הם מסוגלים לשחרר את הטמפרטורה שחרור פרץ של חמצון כושל בנוכחות מכת חום קלה (42 ° c). Indocyanine ירוק (ICG) יכול גם להיות שיתוף טעון ליפוזומים עבור שחרור בלייזר קרוב-אינפרא אדום המופעל. הגישה המיקרופלואידיc מבטיחה תפוקה גבוהה, הכנה מדרגית ומדרגיים של LTSLs.
Introduction
הניסוח ltsl הוא המוצר הרלוונטי קלינית ליפוזומבית שפותחה כדי לספק את התרופה כימותרפיה דוקסורוביצין (חמצון) ומאפשר שחרור התרופה יעיל התפוצצות ב מכת חום מתון השגה (T ≈ 41 ° c)1. הניסוח של LTSL מורכב מ-1, 2-dipalmitoyl-sn-בגליקו-3-פוספולינולינה (dppc), הליסולפיד 1-stearoyl-2-הידרוxy-sn-גליליאו-3-פוספוליטיולין (mspc; M מייצג “מונו”) ו PEGylated השומנים 1, 2-distearoyl-sn-גליקו-3-פוספואנתאנאואמין-N-[מתיקסי (פוליאתילן גליקול)-2000] (dspe-יתד2000). עם ההגעה לטמפרטורת המעבר שלב (Tm ≈ 41 ° c), lysolipid ו dspe-יתד2000 יחד להקל על היווצרות של נקבוביות הממברנה, וכתוצאה מכך שחרור פרץ של הסם2. הכנת ה-LTSLs משתמשת בעיקר בגישה מלמעלה-למטה, כלומר לחות ושחול השומנים. זה נשאר מאתגר להיות מוכן להכין אצוות גדולות עם מאפיינים זהים בכמויות מספיקות עבור יישומים קליניים3.
Microfluidics מיקרופלואידיקה היא טכניקה מתפתחים להכנת ליפוזומים, המציעה ננו-חלקיק size, מדרגיות ויכולת הרחבה3. לאחר שפרמטרי הייצור ממוטבים, ניתן לשנות את התפוקה באמצעות מקביליזציה, עם מאפיינים זהים לאלה המוכנים בסולם הספסל3,4,5. היתרון העיקרי של מיקרופלואידיקה מעל טכניקות בצובר קונבנציונאלי היא היכולת להתמודד עם כרכים נוזליים קטנים עם ישור גבוהה בחלל וזמן באמצעות המזעור, המאפשר אופטימיזציה מהירה יותר, תוך הפעלה באופן רציף ואוטומטי6. ייצור ליפוזומים עם התקנים מיקרופלואידים מושגת על ידי גישה nanoprecipitation מלמטה למעלה, שהיא יותר זמן ואנרגיה יעילה בגלל תהליכי המגון כגון שחול וsonication מיותרים7. בדרך כלל, פתרון אורגני (למשל אתנול) של שומנים (ו מטען הידרופובי) מעורבב עם miscible non-ממס (למשל מים ומטען הידרופילי). כמו הממס האורגני תערובות עם non-ממס, מסיסות עבור השומנים מופחת. ריכוז השומנים מגיע בסופו של דבר לריכוז קריטי שבו מופעל תהליך המשקעים7. Nanoprecipitates של שומנים בסופו של דבר לגדול בגודל וקרוב ליפוכמה. הגורמים העיקריים המסדירים את הגודל וההומוגניות של הליזומים הם היחס בין הבלתי ממס לבין הממס (כלומר יחס שיעור הזרימה מימית לאורגני; FRR) ואת ההומוגניות של סביבת הממס במהלך הרכבה עצמית של שומנים ליפוזומים8.
ערבוב של נוזלים יעילים במיקרופלואידיקה, ולכן חיוני להכנת ליפוזומים אחידים, ועיצובים שונים של מיקסרים המועסקים ביישומים שונים9. מיקרומטר האדרה (SHM) מייצג אחד הדורות החדשים של מערבלי פאסיביים, המאפשרים תפוקה גבוהה (בטווח של mL/min) עם גורם דילול נמוך. זה מעולה למיקרו-פלואידיג הידרודינמי ערבוב התקנים8,10. SHM יש בדוגמת חריצים אדרה, אשר מערבבים במהירות נוזלים לפיכאוטי 9,11. ציר הזמן ערבוב קצר של shm (< 5 אלפיות הראשונה, פחות מקנה המידה האופייני התקופה של 10 – 100 ms) מאפשר הרכבה עצמית השומנים להתרחש בסביבה ממיסים הומוגנית, הפקת חלקיקים עם התפלגות גודל אחיד3,12.
הכנת ltsls עם microfluidigis, עם זאת, לא פשוט לעומת ניסוחים ליפוזומליים קונבנציונאלי בשל העדר כולסטרול8, ללא השומנים bilayers רגישים המושרה אתנול הנגרמת13,14,15. עד היום, ההשפעה של שיורית אתנול מציג במהלך ייצור מיקרופלואידים של ליפוזומים לא הבינו היטב. רוב הניסוחים המדווחים הם עמידים בפני מיסודם כדי להבדיל (המכיל כולסטרול או בלתי רווי שומנים)16, אשר בניגוד ltsls הן רווי ונטול כולסטרול.
הפרוטוקול המוצג במסמך זה משתמש ב-SHM כדי להכין את LTSLs עבור מסירת התרופות המופעלת באמצעות טמפרטורה. בשיטה המוצגת, אנו מובטחים את LTSLs המוכן למיקרופלואידים (100 ננומטר) ומדים (דיסטיבסיטה < 0.2) על ידי פיזור אור דינמי (DLS). יתרה מזו, אנו כילנו את החמצון באמצעות שיטת מעבר הצבע אמוניום גופרתי (הידוע גם כטעינה מרחוק)17 כאימות של השלמות של השומנים של ltsl. הטעינה מרחוק של החמצון דורש ליפוכמה כדי לשמור על הדרגתי pH כדי להשיג את היעילות אנקפסולציה גבוהה (EE), אשר סביר לקרות ללא שלמות השומנים שלמים. בשיטה זו הציג, במיוחד מפני ליפופלואידיג טיפוסי מסוימים פרוטוקולי הכנה, צעד ריפוי נדרש לפני האתנול מוסר כדי לאפשר את יכולת הטעינה מרחוק; i.e. כדי לשחזר את היושרה של bilayer השומנים.
כפי שהוזכר קודם לכן, ניתן להציג מטענים הידרופילי והידרופובי גם לפתרונות הראשוניים לעטיפת המים הסימולטני של מטענים במהלך היווצרות LTSLs. כהוכחה-of-קונספט, indocyanine ירוק (ICG), מאושר על ידי ה-FDA צבע פלורסנט באמצעות אינפרא אדום, שהוא גם סוכן פוטותרמי מבטיח, הוא הציג את תערובת השומנים הראשונית בהצלחה משותפת לתוך LTSLs. לייזר 808 ננומטר משמש לשחרור האנטי-והחמצון הטעון/ICG, ולגרום בהצלחה לשחרר את החימום התרמי המופעל בתוך 5 דקות.
כל המכשירים והחומרים זמינים באופן מסחרי, מוכן לשימוש וללא צורך בהתאמה אישית. מאז כל הפרמטרים לניסוח ltsls בעקבות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ידע מוקדם של מיקרופלואידיקה יכול גם להכין את ה-ltsls אשר משמש כבסיס למערכת שילוח התרופות התרמורגיש.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר את הכנת ליפוזומים בטמפרטורה נמוכה (LTSLs) באמצעות מיקרומטר העצם (SHM) הרציף. הניסוח LTSL10 מאפשר שחרור מופעל טמפרטורה פרץ של דוקסורוביצין בתוך 5 דקות בטמפרטורה ימותרפיה קלינית השגה של 42 ° c. Indocyanine ירוק (ICG) יכול גם להיות שותף טעון עבור חימום פוטותרמי עורר את שחרורו של חמצון. השי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לסרטן הערמונית בריטניה (CDF-12-002 מלגת), ואת המועצה למחקר פיסי מדעי הנדסה (EPSRC) (EP/M008657/1) עבור מימון.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Referências
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Bioquímica. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA – Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
