Produção microfluida de liposomos sensíveis à temperatura contendo lisolipóides
Summary
O protocolo apresenta os parâmetros otimizados para a preparação de liposomos termosensíveis usando o dispositivo microfluido de microfluidos de micromixer herringbone escalonado. Isso também permite o coencapsulamento de doxorubicina e verde indocianina nos liposomos e a liberação fototérmica de doxorubicina para liberação controlada/desencadeada de drogas.
Abstract
O protocolo apresentado permite uma preparação contínua de alto desempenho de liposomos sensíveis à baixa temperatura (LTSLs), capazes de carregar drogas quimioterapêuticas, como a doxorubicina (DOX). Para isso, uma mistura lipídica imócida e uma solução de sulfato de amônio são injetadas em um microfluido microfluido de micromisturador de arenque escalonado (SHM). As soluções são rapidamente misturadas pelo SHM, fornecendo um ambiente solvente homogêneo para a auto-montagem dos liposomos. Os liposós coletados são primeiro amassados, depois marcados para remover o etanol residual. Um fato de amônio pH-gradiente é estabelecido através da troca tampão da solução externa usando cromatografia de exclusão de tamanho. O DOX é então carregado remotamente nos liposomos com alta eficiência de encapsulamento (> 80%). Os liposós obtidos são homogêneos em tamanho com diâmetro médio Z de 100 nm. Eles são capazes de liberação de explosão desencadeada pela temperatura do DOX encapsulado na presença de hipertermia leve (42 °C). O verde indocianina (ICG) também pode ser co-carregado nos liposomos para liberação DOX quase infravermelha. A abordagem microfluida garante uma preparação de alto nível, reprodutível e escalável das LTSLs.
Introduction
A formulação ltsl é um produto lipossômico clinicamente relevante que foi desenvolvido para fornecer a droga quimioterapêutica doxorubicina (DOX) e permite uma liberação eficiente de medicamentos estourados em hipertermia leve clinicamente alcançável (T ◗ 41 °C)1. A formulação LTSL consiste em 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosphocholine (DPPC), o lisolipide 1-stearoyl-2-hidroxi-sn -glicero-3-fosfatidylcholine (MSPC; M significa “mono”) e lipídio PEGylated 1,2-distearoyl-sn -glicero-3-phosphoetanolamina-N-[methoxy(polietileno glicol)-2000] (DSPE-PEG2000). Ao atingir a temperatura de transição de fase (Tm ◗ 41 °C), o lisolipide e o DSPE-PEG2000 juntos facilitam a formação de poros de membrana, resultando em uma liberação estourada da droga2. A preparação das LTSLs usa principalmente uma abordagem de cima para baixo em massa, ou seja, hidratação de filme lipídico e extrusão. Continua sendo desafiador preparar reprodutivelmente grandes lotes com propriedades idênticas e em quantidades suficientes para aplicações clínicas3.
Microfluidoé uma técnica emergente para preparar liposomos, oferecendo tamanho de nanopartículas não capazes, reprodutibilidade e escalabilidade3. Uma vez otimizados os parâmetros de fabricação, o throughput poderá ser ampliado pela paralefila, com propriedades idênticas às preparadas na escala de banco3,4,5. Uma grande vantagem dos microfluidos em relação às técnicas convencionais de granel é a capacidade de lidar com pequenos volumes líquidos com alta controladorabilidade no espaço e no tempo através da miniaturização, permitindo uma otimização mais rápida, enquanto opera de forma contínua e automatizada6. A produção de liposós com dispositivos microfluidos é alcançada por uma abordagem de nanoprecipitação inferior, que é mais tempo e eficiência energética porque processos de homogeneização como extrusão e sonsonação são desnecessários7. Normalmente, uma solução orgânica (por exemplo, etanol) de lipídios (e carga hidrofóbica) é misturada com um não solvente insustentável (por exemplo, água e carga hidrofilônica). À medida que o solvente orgânico se mistura com o não solvente, a solubilidade para os lipídios é reduzida. A concentração lipídica eventualmente atinge uma concentração crítica na qual o processo de precipitação é acionado7. Nanoprecipitados de lipídios eventualmente crescem em tamanho e se fecham em um liposós. Os principais fatores que regem o tamanho e a homogeneidade dos liposomos são a razão entre o não solvente e o solvente (ou seja, relação de fluxo aquoso-orgânico; FRR) e a homogeneidade do ambiente solvente durante a automontagem dos lipídios em liposomos8.
A mistura eficiente de fluidos em microfluidos é, portanto, essencial para a preparação de liposomos homogêneos, e vários designs de misturadores foram empregados em diferentes aplicações9. O micromixer de arenque escalonado (SHM) representa uma das novas gerações de misturadores passivos, o que permite um alto rendimento (na faixa de mL/min) com um fator de diluição baixa. Isso é superior aos dispositivos tradicionais de mistura hidrodinâmica microfluida8,10. O SHM tem ranhuras de arenque padronizadas, que rapidamente misturam fluidos por advection caótico9,11. A pequena escala de tempo de mistura de SHM (< 5 ms, menos do que a escala típica de tempo de agregação de 10-100 ms) permite que a auto-montagem lipídica ocorra em um ambiente solvente homogêneo, produzindo nanopartículas com distribuição uniforme de tamanho3,12.
A preparação de LTSLs com microfluidos não é, no entanto, tão simples em relação às formulações liposômicas convencionais devido à falta de colesterol8, sem as quais as bicamadas lipídicas são suscetíveis à interdigitação induzida pelo etanol13,14,15. Até agora, o efeito do etanol residual apresenta durante a produção microfluida de liposomos não foi bem compreendido. A maioria das formulações relatadas são inerentemente resistentes à interdigitação (contendo colesterol ou lipídios insaturados)16, que ao contrário das LTSLs são saturadas e sem colesterol.
O protocolo aqui apresentado usa o SHM para preparar LTSLs para a entrega de medicamentos de liberação desencadeada pela temperatura. No método apresentado, garantimos que os LTSLs preparados microfluidos são nano-size (100 nm) e uniforme (dispersidade < 0,2) por dispersão dinâmica de luz (DLS). Além disso, encapsulamos o DOX usando o método de gradiente de sulfato de amônio transmembrana (também conhecido como carregamento remoto)17 como uma validação da integridade do bicamada lipídico LTSL. O carregamento remoto do DOX requer o liposome para manter um gradiente pH para alcançar alta eficiência de encapsulamento (EE), o que é improvável que aconteça sem um bicamada lipídico intacto. Neste método apresentado, distinto a partir de protocolos típicos de preparação liposófica microfluida, é necessário um passo de annealing antes que o etanol seja removido para habilitar a capacidade de carregamento remoto; ou seja, para restaurar a integridade do bicamada lipídico.
Como mencionado anteriormente, cargas hidrofoficas e hidrofóbicas também podem ser introduzidas às soluções iniciais para o encapsulamento simultâneo de cargas durante a formação de LTSLs. Como prova de conceito, o verde indocianina (ICG), um corante fluorescente quase infravermelho aprovado pela FDA, que também é um agente fototérmico promissor, é introduzido na mistura lipídica inicial e co-carregado com sucesso nas LTSLs. Um laser de 808 nm é usado para irradiar as LTSLs carregadas do DOX/ICG e induzir com sucesso a liberação de explosão fototérmica desencadeada pelo aquecimento do DOX dentro de 5 minutos.
Todos os instrumentos e materiais estão disponíveis comercialmente, prontos para uso e sem a necessidade de personalização. Uma vez que todos os parâmetros para formulação de LTSLs foram otimizados, seguindo este protocolo, pesquisadores sem conhecimento prévio de microfluidos também poderiam preparar as LTSLs, que servem como base de um sistema de entrega de drogas termosensíveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado descreve a preparação de liposós sensíveis à temperatura baixa (LTSLs) usando um micromixer de arenque escalonado (SHM). A formulação LTSL10 permite a liberação de rajadas desencadeadas pela temperatura da doxorubicina dentro de 5 minutos a uma temperatura hipertermrmica clinicamente atingível de 42 °C. O verde indocianina (ICG) também pode ser co-carregado para aquecimento fototérmico desencadeado pela liberação do DOX. O método se baseia em: (i) auto-montagem de fosfolipidas em l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) e ao Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas (EPSRC) (EP/M008657/1) pelo financiamento.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Referências
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