Producción microfluídica de liposomas sensibles a la temperatura que contienen lysolipido
Summary
El protocolo presenta los parámetros optimizados para preparar liposomas termosensibles utilizando el dispositivo de microfluidos de micromezcladores de espiga escalonado. Esto también permite la co-encapsulación de doxorubicina y verde indocyanina en los liposomas y la liberación fototérmica-activada de doxorubicina para la liberación controlada / desencadenada de fármacos.
Abstract
El protocolo presentado permite una preparación continua de alto rendimiento de liposomas sensibles a la baja temperatura (LTSL), que son capaces de cargar fármacos quimioterápicos, como la doxorubicina (DOX). Para lograresto, se inyecta una mezcla de lípidos etanólicos y una solución de sulfato de amonio en un dispositivo microfluídico escalonado de espiga (SHM). Las soluciones son mezcladas rápidamente por el SHM, proporcionando un ambiente solvente homogéneo para el autoensamblaje de liposomas. Los liposomas recogidos primero se recocidos, luego se dializar para eliminar el etanol residual. Se establece un gradiente de pH de sulfato de amonio mediante el intercambio tampón de la solución externa mediante la cromatografía de exclusión de tamaño. El DOX se carga de forma remota en los liposomas con alta eficiencia de encapsulación (> 80%). Los liposomas obtenidos son homogéneos en tamaño con diámetro medio Z de 100 nm. Son capaces de liberar por ráfaga salpicada por temperatura de DOX encapsulado en presencia de hipertermia leve (42 oC). El verde indocyanina (ICG) también se puede cocargar en los liposomas para la liberación DOX casi infrarroja activada por láser. El enfoque microfluídico garantiza una preparación de LTSL de alto rendimiento, reproducible y escalable.
Introduction
La formulación de LTSL es un producto liposomal clínicamente relevante que se ha desarrollado para suministrar el fármaco quimioterapéutico doxorubicina (DOX) y permite la liberación eficiente del fármaco de ráfaga a hipertermia suave clínicamente alcanzable (T a 41 oC)1. La formulación LTSL consta de 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), el lisolípido 1-esteasinoylo-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (MSPC; M significa “mono”) y el lípido PEGylated 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000). Al llegar a la temperatura de transición de fase (Tm a 41 oC), el lisolípido y el DSPE-PEG2000 facilitan conjuntamente la formación de poros de membrana, lo que resulta en una liberación por ráfaga del fármaco2. La preparación de LTSL utiliza principalmente un enfoque de arriba hacia abajo a granel, a saber, la hidratación y la extrusión de película lipídica. Sigue siendo difícil preparar de forma reproducible grandes lotes con propiedades idénticas y en cantidades suficientes para aplicaciones clínicas3.
Microfluílica es una técnica emergente para la preparación de liposomas, que ofrece un tamaño de nanopartículas ajustable, reproducibilidad y escalabilidad3. Una vez optimizados los parámetros de fabricación, el rendimiento podría ampliarse mediante paralelización, con propiedades idénticas a las preparadas a escala de banco3,4,5. Una de las principales ventajas de los microfluidos sobre las técnicas convencionales a granel es la capacidad de manejar pequeños volúmenes de líquidos con alta capacidad de control en el espacio y el tiempo a través de la miniaturización, permitiendo una optimización más rápida, mientras que opera de manera continua y automatizada6. La producción de liposomas con dispositivos microfluídicos se logra mediante un enfoque de nanoprecipitación de abajo hacia arriba, que es más eficiente en tiempo y energía porque los procesos de homogeneización como la extrusión y la sonicación son innecesarios7. Por lo general, una solución orgánica (por ejemplo, etanol) de lípidos (y carga útil hidrófoba) se mezcla con un no disolvente miscible (por ejemplo, agua y carga útil hidrófila). A medida que el disolvente orgánico se mezcla con el no disolvente, se reduce la solubilidad de los lípidos. La concentración de lípidos finalmente alcanza una concentración crítica en la que se activa el proceso de precipitación7. Los nanoprecipitados de lípidos eventualmente crecen en tamaño y se cierran en un liposoma. Los principales factores que rigen el tamaño y la homogeneidad de los liposomas son la relación entre la relación no solvente y el disolvente (es decir, la relación de caudal acuoso-orgánico; FRR) y la homogeneidad del entorno solvente durante el autoensamblaje de lípidos en liposomas8.
Por lo tanto, la mezcla eficiente de fluidos en microfluidos es esencial para la preparación de liposomas homogéneos, y se han empleado diversos diseños de mezcladores en diferentes aplicaciones9. El micromezclador de espiga escalonada escalonada (SHM) representa una de las nuevas generaciones de mezcladores pasivos, lo que permite un alto rendimiento (en el rango de ml/min) con un factor de dilución bajo. Esto es superior a los dispositivos de mezcla hidrodinámicos microfluídicos tradicionales8,10. El SHM ha estampado ranuras de espina de arenque, que mezclan rápidamente fluidos por advección caótica9,11. La escala temporal de mezcla corta de SHM (< 5 ms, menor que la escala de tiempo de agregación típica de 10-100 ms) permite que el autoensamblaje de lípidos se produzca en un entorno solvente homogéneo, produciendo nanopartículas con distribución de tamaño uniforme3,12.
La preparación de LTSL con microfluidos no es, sin embargo, tan sencilla en comparación con las formulaciones liposomales convencionales debido a la falta de colesterol8,sin las cuales las bicapas lipídicas son susceptibles a la interdigitación inducida por etanol13,14,15. Hasta ahora, el efecto del etanol residual se presenta durante la producción microfluídica de liposomas no se ha entendido bien. La mayoría de las formulaciones notificadas son intrínsecamente resistentes a la interdigitación (que contiene colesterol o lípidos insaturados)16, que a diferencia de los LTSL están saturados y libres de colesterol.
El protocolo presentado aquí utiliza SHM para preparar LOS LTSL para la administración de fármacos de liberación activada por temperatura. En el método presentado, nos aseguramos de que los LTSL preparados microfluídicos sean de tamaño nanométrico (100 nm) y uniformes (dispersidad < 0.2) por dispersión dinámica de luz (DLS). Además, encapsulamos DOX utilizando el método de gradiente de sulfato de amonio transmembrana (también conocido como carga remota)17 como una validación de la integridad de la bicapa lipídica LTSL. La carga remota de DOX requiere que el liposoma mantenga un pH-gradiente para lograr una alta eficiencia de encapsulación (EE), que es poco probable que suceda sin una bicapa de lípidos intacta. En este método presentado, distintivo de los protocolos típicos de preparación de liposoma microfluídico, se requiere un paso de recocido antes de que se elimine el etanol para habilitar la capacidad de carga remota; es decir, para restaurar la integridad de la bicapa lipídica.
Como se mencionó anteriormente, las cargas útiles hidrófilas e hidrófobas también se pueden introducir en las soluciones iniciales para la encapsulación simultánea de cargas útiles durante la formación de LTSL. Como prueba de concepto, el verde indocyanina (ICG), un tinte fluorescente de infrarrojo cercano aprobado por la FDA, que también es un agente fototérmico prometedor, se introduce en la mezcla de lípidos inicial y se cocarga con éxito en los LTSL. Un láser de 808 nm se utiliza para irradiar los LTSL cargados por DOX/ICG e inducir con éxito la liberación de ráfaga sactivó el calentamiento fototérmico de DOX en un plazo de 5 minutos.
Todos los instrumentos y materiales están disponibles comercialmente, listos para usar y sin necesidad de personalización. Dado que se han optimizado todos los parámetros para la formulación de LTSL, siguiendo este protocolo, los investigadores sin conocimiento previo de microfluidos también podrían preparar los LTSL, que sirve como base de un sistema de administración de fármacos termosensibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado describe la preparación de liposomas sensibles a la baja temperatura (LTSL) utilizando un micromezclador de espiga escalonada (SHM). La formulación LTSL10 permite la liberación de doxorubicina activada por temperatura en 5 minutos a una temperatura hipertérmica clínicamente alcanzable de 42 oC. El verde indocyanina (ICG) también se puede cocargar para el calentamiento fototérmico desencadenado la liberación de DOX. El método se basa en: i) autoensamblaje de fosfolípidos en liposomas bajo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) y al Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC) (EP/M008657/1) por su financiación.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Referências
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