लाइसोलिपिड युक्त तापमान-संवेदनशील लिपोसोम्स का माइक्रोफ्लूइडिक उत्पादन
Summary
प्रोटोकॉल कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिडर माइक्रोफ्लूइडिक्स डिवाइस का उपयोग करके थर्मोसेंसिटिव लिपोसोम तैयार करने के लिए अनुकूलित मापदंडों को प्रस्तुत करता है। यह लिपोसोम्स में डोक्सोरुबिसिन और इंडोसाइनाइन ग्रीन के सह-एन्कैप्सुलेशन और नियंत्रित/ट्रिगर दवा रिलीज के लिए डोक्सोरुबिसिन की फोटोथर्मल-ट्रिगर रिलीज की अनुमति देता है ।
Abstract
प्रस्तुत प्रोटोकॉल कम तापमान-संवेदनशील लिपोसोम (एलटीएसएल) की उच्च-थ्रूपुट निरंतर तैयारी को सक्षम बनाता है, जो डोक्सोरुबिसिन (डॉक्स) जैसी कीमोथेरेपी दवाओं को लोड करने में सक्षम हैं। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, एक इथेनॉल लिपिड मिश्रण और अमोनियम सल्फेट समाधान को एक कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिक्सर (एसएचएम) माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में इंजेक्ट किया जाता है। समाधान तेजी से एसएचएम द्वारा मिश्रित कर रहे हैं, liposomes स्वयं विधानसभा के लिए एक सजातीय विलायक वातावरण प्रदान करते हैं । एकत्र किए गए लिपोसोम पहले एनेल किए जाते हैं, फिर अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए डायलाइज़ किए जाते हैं। आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके बाहरी समाधान के बफर एक्सचेंज के माध्यम से अमोनियम सल्फेट पीएच-ग्रेडिएंट स्थापित किया जाता है। इसके बाद डॉक्स को उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता (>80%) के साथ लिपोसोम ्स में दूरस्थ रूप से लोड किया जाता है। प्राप्त किए गए लिपोसोम आकार में समरूप होते हैं, जिनका आकार 100 एनएम के जेड-औसत व्यास के साथ होता है। वे हल्के हाइपरथर्मिया (42 डिग्री सेल्सियस) की उपस्थिति में समझाए गए डॉक्स के तापमान-ट्रिगर फट रिलीज में सक्षम हैं। इंडोसाइनाइन ग्रीन (आईसीजी) को निकट अवरक्त लेजर-ट्रिगर डॉक्स रिलीज के लिए लिपोसोम में सह-लोड किया जा सकता है। माइक्रोफ्लूइडिक दृष्टिकोण एलटीएसएल की उच्च-थ्रूपुट, प्रजनन योग्य और स्केलेबल तैयारी सुनिश्चित करता है।
Introduction
एलटीएसएल फॉर्मूलेशन एक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक लिपोसोमल उत्पाद है जिसे कीमोथेरेपी दवा डोक्सोरुबिसिन (डीओएक्स) देने के लिए विकसित किया गया है और चिकित्सकीय रूप से प्राप्य हल्के हाइपरथर्मिया (T, 41 डिग्री सेल्सियस)1पर कुशल फट दवा रिलीज की अनुमति देता है। एलटीएसएल फॉर्मूलेशन में 1,2-डिपलपिटोल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीपीपीसी), लाइसोलिपिड 1-स्टीरॉयल-2-हाइड्रोक्सी- एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फेटिडिलचोलिन (एमएसपीसी; एम “मोनो”) और PEGylated लिपिड 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[मेथोक्सी (पॉलीथीन ग्लाइकोल)- 2000] (DSPE-PEG2000)के लिए खड़ा है। चरण संक्रमण तापमान (टीएम 41 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंचने पर, लिसोलिपिड और डीएसपीई-खूंटी2000 एक साथ झिल्ली छिद्रों के गठन की सुविधा प्रदान करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप दवा 2 की फट रिलीजहोतीहै। LTSLs की तैयारी मुख्य रूप से एक थोक शीर्ष नीचे दृष्टिकोण का उपयोग करता है, अर्थात् लिपिड फिल्म जलयोजन और निष्कासन । समान गुणों वाले बड़े बैचों को पुन: उत्पन्न करना और नैदानिकअनुप्रयोगोंके लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है ।
माइक्रोफ्लूइडिक्स लिपोसोम तैयार करने, tunable नैनोकण आकार, प्रजनन क्षमता, और स्केलेबिलिटी3की पेशकश के लिए एक उभरती हुई तकनीक है। एक बार विनिर्माण मापदंडों को अनुकूलित करने के बाद, थ्रूपुट को समानता द्वारा बढ़ाया जा सकता है, बेंच स्केल3,4,5पर तैयार संपत्तियों के समान गुण। पारंपरिक थोक तकनीकों पर माइक्रोफ्लूइडिक्स का एक प्रमुख लाभ लघुकरण के माध्यम से अंतरिक्ष और समय में उच्च नियंत्रणक्षमता के साथ छोटे तरल मात्रा को संभालने की क्षमता है, जो निरंतर और स्वचालिततरीकेसे काम करते हुए तेजी से अनुकूलन की अनुमति देता है। माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों के साथ लिपोसोम का उत्पादन एक बॉटम-अप नैनोप्रिमिटन दृष्टिकोण द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो अधिक समय और ऊर्जा कुशल है क्योंकि एक्सट्रूजन और सोनिकेशन जैसी समरूपता प्रक्रियाएं अनावश्यक7हैं। आमतौर पर, लिपिड (और हाइड्रोफोबिक पेलोड) का एक कार्बनिक समाधान (जैसे इथेनॉल) को एक गलत गैर-सॉल्वेंट (जैसे पानी और हाइड्रोफिलिक पेलोड) के साथ मिलाया जाता है। जैसे-जैसे ऑर्गेनिक सॉल्वेंट नॉन सॉल्वेंट के साथ मिक्स होता है, वैसे-वैसे लिपिड के लिए घुलनशीलता कम हो जाती है। लिपिड एकाग्रता अंततः एक महत्वपूर्ण एकाग्रता तक पहुंच जाती है जिस पर वर्षा प्रक्रिया7शुरू हो जाती है । लिपिड के नैनोप्रिपिट अंततः आकार में बढ़ते हैं और एक लिपोसोम में बंद हो जाते हैं। लिपोसोम्स के आकार और एकरूपता को नियंत्रित करने वाले मुख्य कारक गैर-विलायक और विलायक (यानी जलीय-से-कार्बनिक प्रवाह दर अनुपात) के बीच अनुपात हैं; FRR) और लिपिड्स की आत्म-असेंबली के दौरान सॉल्वेंट वातावरण की एकरूपता8।
इसलिए सजातीय लिपोसोम तैयार करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक्स में कुशल तरल पदार्थ मिश्रण आवश्यक है, और मिक्सर के विभिन्न डिजाइनों को विभिन्न अनुप्रयोगों9में नियोजित किया गया है। कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिक्सर (एसएचएम) निष्क्रिय मिक्सर की नई पीढ़ियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, जो कम कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ उच्च थ्रूपुट (एमएल/मिन की सीमा में) को सक्षम बनाता है। यह पारंपरिक माइक्रोफ्लूइडिक हाइड्रोडायनामिक मिक्सिंगउपकरण8,10से बेहतर है । एसएचएम ने हेरिंगबोन खांचे को पैटर्न किया है, जो अराजक अभिवृद्धि9,11द्वारा तरल पदार्थ ों को तेजी से मिलाते हैं। एसएचएम (< 5 एमएस, 10-100 एमएस के ठेठ एकत्रीकरण समय पैमाने से कम) का शॉर्ट मिक्सिंग टाइमस्केल लिपिड सेल्फ असेंबली को समरूप सॉल्वेंट वातावरण में होने की अनुमति देता है, जो एक समान आकार वितरण3,12के साथ नैनोकणों का उत्पादन करता है ।
हालांकि, माइक्रोफ्लूइडिक्स के साथ एलटीएसएल की तैयारी कोलेस्ट्रॉल8की कमी के कारण पारंपरिक लिपोसोमल फॉर्मूलों की तुलना में सीधी नहीं है, जिसके बिना लिपिड बाइलेयर इथेनॉल-प्रेरित इंटरडिजिशन13,14,15के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। अब तक, लिपोसोमके माइक्रोफ्लूइडिक उत्पादन के दौरान अवशिष्ट इथेनॉल प्रस्तुत करने का प्रभाव अच्छी तरह से नहीं समझा गया है। रिपोर्ट किए गए अधिकांश योग स्वाभाविक रूप से इंटरडिजिशन (कोलेस्ट्रॉल या असंतृप्त लिपिड युक्त)16के लिए प्रतिरोधी हैं, जो एलटीएसएल के विपरीत संतृप्त और कोलेस्ट्रॉल मुक्त दोनों हैं।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल तापमान ट्रिगर-रिलीज दवा वितरण के लिए LTSLs तैयार करने के लिए SHM का उपयोग करता है । प्रस्तुत विधि में, हमने यह सुनिश्चित किया कि माइक्रोफ्लूइडिक-तैयार एलटीएसएल नैनो आकार (100 एनएम) और गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) द्वारा एक समान (फैलाव और एलटी; 0.2) हैं। इसके अलावा, हमने एलटीएसएल लिपिड बाइलेयर की अखंडता के सत्यापन के रूप में ट्रांसमेम्ब्रेन अमोनियम सल्फेट ग्रेडिएंट विधि (जिसे रिमोट लोडिंग के रूप में भी जाना जाता है)का उपयोग करके डॉक्स को समझाया। डॉक्स के रिमोट लोडिंग के लिए उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता (ईई) प्राप्त करने के लिए पीएच-ग्रेडिएंट बनाए रखने के लिए लिपोसोम की आवश्यकता होती है, जो एक अक्षुण्ण लिपिड बाइलेयर के बिना होने की संभावना नहीं है। इस प्रस्तुत विधि में, विशिष्ट माइक्रोफ्लूइडिक लिपोसोम तैयारी प्रोटोकॉल से विशिष्ट, रिमोट लोडिंग क्षमता को सक्षम करने के लिए इथेनॉल को हटाने से पहले एक एनिंगिंग कदम की आवश्यकता होती है; यानी लिपिड बाइलेयर की अखंडता को बहाल करने के लिए।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एलटीएसएलएस के गठन के दौरान पेलोड के एक साथ एन्कैप्सुलेशन के लिए हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक पेलोड को प्रारंभिक समाधानों के लिए भी पेश किया जा सकता है। एक सबूत के रूप में अवधारणा, इंडोसायनाइन ग्रीन (आईसीजी), एक एफडीए के पास अनुमोदित-अवरक्त फ्लोरोसेंट रंग, जो भी एक होनहार फोटोथर्मल एजेंट है, प्रारंभिक लिपिड मिश्रण के लिए पेश किया है और सफलतापूर्वक एलटीएसएलएस में सह लोड । एक ८०८ एनएम लेजर DOX/ICG-भरी हुई LTSLs किरणित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और सफलतापूर्वक 5 मिनट के भीतर DOX के फोटोथर्मल हीटिंग ट्रिगर फट रिलीज प्रेरित ।
सभी उपकरण और सामग्री व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, तैयार-उपयोग के लिए, और अनुकूलन की आवश्यकता के बिना। चूंकि एलटीएसएल तैयार करने के लिए सभी मापदंडों को अनुकूलित किया गया है, इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, माइक्रोफ्लूइडिक्स की कोई पूर्व जानकारी वाले शोधकर्ता एलटीएसएल भी तैयार कर सकते हैं, जो थर्मोसेंसिटिव ड्रग डिलीवरी सिस्टम के आधार के रूप में कार्य करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिक्सर (एसएचएम) का उपयोग करके कम तापमान-संवेदनशील लिपोसोम (एलटीएसएल) की तैयारी का वर्णन करता है। LTSL10 फॉर्मूलेशन 42 डिग्री सेल्सियस के चिकित्सकीय प्राप्य ह?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रोस्टेट कैंसर यूके (सीडीएफ-12-002 फैलोशिप) और इंजीनियरिंग एंड फिजिकल साइंसेज रिसर्च काउंसिल (ईपीएसआरसी) (ईपीएसआरसी) (EP/M008657/1) को फंडिंग के लिए धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Referências
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