Mikrofluidisk produktion av lysolipidhaltiga temperaturkänsliga liposomer
Summary
Protokollet presenterar de optimerade parametrarna för att förbereda termokänsliga liposomer med hjälp av den förskjutna sillbensmikromixerns mikrofluidiksenhet. Detta gör också co-inkapsling av doxorubicin och indocyanin grön i liposomer och fototermisk-utlöst release av doxorubicin för kontrollerad / utlöst drog release.
Abstract
Det presenterade protokollet möjliggör en kontinuerlig förberedelse av lågtemperaturkänsliga liposomer (LTSLs), som kan ladda kemoterapeutiska läkemedel, såsom doxorubicin (DOX). För att uppnå detta injiceras en mikrofluidisk anordning för etanollipidoch ammoniumsulfat i en förskjuten sillbensmikromixer (SHM). Lösningarna blandas snabbt av SHM, vilket ger en homogen lösningsmedelsmiljö för liposomer självmontering. Samlade liposomer är först glödde, sedan dialyzed att ta bort kvarvarande etanol. En ammoniumsulfatpatgradient upprättas genom buffertutbyte av den externa lösningen genom att använda storleksuteslutningkromatografi. DOX laddas sedan på distans i liposomerna med hög inkapsling effektivitet (> 80%). Liposomerna erhålls är homogena i storlek med Z-genomsnittlig diameter på 100 nm. De kan temperaturutlöst burst release av inkapslade DOX i närvaro av mild hypertermi (42 °C). Indocyanin grön (ICG) kan också co-loaded i liposomerna för nära infraröd laser-utlöst DOX release. Den mikrofluidiska metoden säkerställer hög genomströmning, reproducerbar och skalbar beredning av LTSL.
Introduction
LTSL formulering är en kliniskt relevant liposomal produkt som har utvecklats för att leverera kemoterapi läkemedel doxorubicin (DOX) och möjliggör effektiv burst läkemedelsrelease på kliniskt uppnåelig mild hypertermi (T ≈ 41 °C)1. LTSL-formuleringen består av 1,2-dipalmitoyl- sn-glycero-3-fosphocholine (DPPC), lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfatidylcholine(MSPC; M står för “mono”) och PEGylated lipid 1,2-distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metoxi(polyetenglykol)-2000] (DSPE-PEG2000). Vid att nå fasen övergångstemperaturen (Tm ≈ 41 °C), lysolipidoch DSPE-PEG2000 tillsammans underlätta bildandet av membranporer, vilket resulterar i en bristning release av läkemedlet2. Beredningen av LTSLs använder främst en bulk top-down strategi, nämligen lipidfilm hydrering och extrudering. Det är fortfarande utmanande att reproducera stora partier med identiska egenskaper och i tillräckliga mängder för kliniska tillämpningar3.
Microfluidics är en framväxande teknik för att förbereda liposomer, som erbjuder avstikanlig nanopartikelstorlek, reproducerbarhet och skalbarhet3. När tillverkningsparametrarna är optimerade kan dataflödet skalas upp genom parallellisering, med egenskaper som är identiska med dem som bereds på bänkskala3,4,5. En stor fördel med mikrofluidik över konventionella bulktekniker är förmågan att hantera små vätskevolymer med hög kontrollerbarhet i tid och rum genom miniatyrisering, vilket möjliggör snabbare optimering, samtidigt som den arbetar på ett kontinuerligt och automatiserat sätt6. Produktion av liposomer med mikrofluidiska enheter uppnås genom en bottom-up nanoprecipitation strategi, vilket är mer tid och energieffektiva eftersom homogenisering processer såsom extrudering och ultraljudsbehandling är onödiga7. Typiskt, en organisk lösning (t.ex. etanol) av lipider (och hydrofoba nyttolast) blandas med en okhärbar icke-lösningsmedel (t.ex. vatten och hydrofil nyttolast). Eftersom det organiska lösningsmedlet blandas med icke-lösningsmedel reduceras lösligheten för lipiderna. Lipidkoncentrationen når så småningom en kritisk koncentration där nederbördsprocessen utlöses7. Nanoprecipitates av lipider växer så småningom i storlek och nära till en liposom. De viktigaste faktorerna som styr liposomernas storlek och homogenitet är förhållandet mellan icke-lösningsmedel och lösningsmedel (dvs. vatten- och organiskt flödesförhållande. FRR) och homogeniteten i lösningsmedelsmiljön under självmontering av lipider till liposomer8.
Effektiv vätskeblandning i mikrofluidik är därför avgörande för beredningen av homogena liposomer, och olika mönster av blandare har använts i olika tillämpningar9. Staggered sillben mikromixer (SHM) representerar en av de nya generationerna av passiva blandare, vilket möjliggör hög genomströmning (inom mL/min) med en låg utspädningsfaktor. Detta är överlägsen traditionella mikrofluidiska hydrodynamiska blandningsanordningar8,10. SHM har mönstrade sillben spår, som snabbt blanda vätskor genom kaotisk advection9,11. Den korta blandningstidsskalan för SHM (< 5 ms, mindre än den typiska aggregeringstidsskalan på 10–100 ms) gör att lipidsjälvmontering kan ske i en homogen lösningsmedelsmiljö, vilket producerar nanopartiklar med enhetlig storleksfördelning3,12.
Beredningen av LTSLs med mikrofluidik är dock inte lika enkelt jämfört med konventionella liposomala formuleringar på grund av bristen på kolesterol8, utan vilka lipidbilager är mottagliga för etanol-inducerad interdigitation13,14,15. Hittills har effekten av restetanol presenterar under den mikrofluidiska produktionen av liposomer inte har förståtts väl. Majoriteten av de rapporterade formuleringarna är i sig resistenta mot interdigitation (som innehåller kolesterol eller omättade lipider)16, som till skillnad från LTSLs är både mättade och kolesterolfria.
Protokollet som presenteras häri använder SHM för att förbereda LTSL för temperatur utlöst frisättning drogleverans. I den presenterade metoden såg vi till att de mikrofluidiska it-ltslärna är nanostora (100 nm) och enhetliga (spridning < 0,2) genom dynamisk ljusspridning (DLS). Dessutom inkapslade vi DOX med transmembraneammoniumsulfatgradientmetoden (även känd som fjärrbelastning)17 som en validering av integriteten hos LTSL lipidbilayer. Fjärrbelastning av DOX kräver liposomen för att upprätthålla en pH-gradient för att uppnå hög inkapsling effektivitet (EE), vilket är osannolikt att hända utan en intakt lipid bilayer. I denna presenterade metod, särskiljande från typiska mikrofluidiska liposom preparatprotokoll, krävs ett glödgningssteg innan etanolen tas bort för att möjliggöra fjärrladdningskapacitet; dvs. för att återställa lipidbilagrets integritet.
Som tidigare nämnts kan hydrofila och hydrofoba nyttolaster också introduceras till de ursprungliga lösningarna för samtidig inkapsling av nyttolaster under bildandet av LTSL. Som ett proof-of-concept, indocyanin grön (ICG), en FDA-godkänd nära infraröd fluorescerande färgämne, som också är en lovande fototermisk agent, introduceras till den ursprungliga lipidblandningen och framgångsrikt co-loaded i LTSLs. En 808 nm laser används för att bestråla DOX / ICG-laddade LTSLs och framgångsrikt inducera fototermisk uppvärmning-utlöst burst release av DOX inom 5 min.
Alla instrument och material är kommersiellt tillgängliga, färdiga att använda, och utan behov av anpassning. Eftersom alla parametrar för att formulera LTSL har optimerats, enligt detta protokoll, forskare utan förkunskaper om mikrofluidik kan också förbereda LTSLs, som fungerar som grund för en termostal läkemedel leveranssystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver beredningen av lågtemperaturkänsliga liposomer (LTSLs) med hjälp av en förskjuten fiskbensmikromixer (SHM). LTSL10-formuleringen möjliggör temperaturutlöst burst release av doxorubicin inom 5 minuter vid en kliniskt uppnåelig hypertermisk temperatur på 42 °C. Indocyanin grön (ICG) kan också co-loaded för fotovärme utlöste utsläpp av DOX. Metoden bygger på: i) självmontering av fosfolipider i liposomer under en homogeniserad lösningsmedelsmiljö som tillhandahålls…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship), och Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) för finansiering.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Referências
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Bioquímica. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA – Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
