Summary
本文报告，在TIVA培养基中加入Y-27632可以显著提高成人皮肤组织中黑色素细胞的产生。
Abstract
原发性黑色素细胞与皮肤组织的分离和培养在生物研究中非常重要，已广泛应用于临床应用。通过传统方法从皮肤组织中隔离原发性黑色素细胞通常需要大约 3 到 4 周才能充分通过。更重要的是，使用的组织通常是新生儿前皮，从成人组织中有效分离原发性黑色素细胞仍然是一个挑战。我们最近开发了一种新的黑色素细胞分离方法，将Y-27632（一种Rho激酶抑制剂）添加到初始培养基48小时。 与常规方案相比，这种新方法显著提高了黑色素细胞的产量，缩短了从前皮组织中分离黑色素细胞的时间。我们现在更详细地描述这种新方法，使用成人表皮来有效地培养原发性黑色素细胞。重要的是，我们表明，从这种新方法编写的成人组织中获得的黑色素细胞可以正常工作。这一新协议将显著有利于研究色素沉着缺陷黑色素瘤使用原发性黑色素细胞准备从容易访问的成人皮肤组织。
Introduction
本研究的目标是开发一种简单有效的方案，将黑色素细胞从成人皮肤的表皮中分离，用于生物研究和临床应用。黑色素细胞位于皮肤和毛囊的基底表皮中，通过产生黑色素1，在皮肤和头发色素沉着中发挥重要作用。表皮黑色素细胞产生的皮肤色素沉着作为紫外线辐射过滤器，减少/防止DNA损伤皮肤基础细胞2。黑色素细胞在皮肤中的异常增殖是很常见的，例如在良性neve（摩尔）的形成中，其中黑色素细胞有可能转化为致癌生长，然后是细胞衰老3。
自1957年以来，人类原发性黑色素细胞的分离和随后的培养已经成为可能4，但自1982年以来，才有一种有效的方法，可以从表皮5中重现人类黑色素细胞的培养。将原发性黑色素细胞与表皮分离的传统方法涉及两步酶消化。简言之，皮肤最初被消化与脱皮，以分离表皮从真皮，然后表皮消化与三普辛产生悬浮液含有黑色素细胞和角蛋白细胞，然后可以有选择地生长在不同的介质。目前，初始培养通常需要大约3至4周的时间，黑色素细胞使用传统方法达到汇合，这很可能是由于它们的分离效率低。因此，增加成人皮肤组织最初生产的黑色素细胞对实验室研究和临床应用都很有帮助。
许多生长因子，其中多数已被证明由角蛋白细胞分泌（例如，+-MSH，ACTH，bFGF，NGF，ET-1，GM-CSF，HGF，LIF和SCF）5-8，调节哺乳动物黑色5-8素细胞的分化和增殖。在没有喂食层的情况下，缺乏这些生长因子导致黑色素细胞的增殖减少，其凋亡增加9。角蛋白细胞作为馈生细胞和黑色素细胞的共培养可导致黑色素细胞增殖加速和凋亡减少。然而，共培养方法不仅需要更多的皮肤组织来准备角蛋白细胞，这是不实际的，但也不有效工作，因为黑色素细胞所需的培养条件不偏向角蛋白细胞生长，反之亦然。
先前的研究已经报道，将Y-27632，一种 ROCK抑制剂，加入生长介质，可以提高人类原发性表皮细胞从皮肤组织10-14-的产量。因此，测试人类原发性黑色素细胞的分离是否会受益于Y-27632的存在是很有趣的。事实上，Y-27632加入接种TIVA介质15，其中含有TPA，IBMX，Na3VO4和3dbcAMP，显著提高了4原发性黑色素细胞在初始培养体16中从包皮组织分离的产量。与传统协议相比，这种新协议在提高黑色素细胞16的产量方面效率显著提高。因此，本协议在此前的研究16的基础上，详细描述了使用成人皮肤组织的新方法，以促进其在基础和应用生物学研究中的应用。
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Protocol
本协议中成人年金组织的使用已获人类研究伦理委员会（第2015120401号，日期：2015年5月12日）批准。
注：在无菌环境中执行以下所有程序，以防止细胞和培养物受到污染。
1. 准备工作
- 在含有 10 mL 磷酸盐缓冲液 （PBS） 的 15 mL 管中收集包皮手术中的新鲜成人包皮组织，并储存在 4 °C 中。
注：切除后24小时内将组织分离至下文详细操作。 - 准备试剂和培养剂。
- 准备 3% P/S（青霉素/链霉素）作为洗涤溶液。将 50 mL 的 PBS 与 1.5 mL 的青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 mg/L） （P/S） 混合。
- 准备酶消化的终止溶液（中和溶液）。补充1%P/S，10%胎儿牛血清（FBS）到DMEM介质。
- 准备TIVA培养黑色素细胞：哈姆的F12;10% FBS;1x P=S=谷氨酰胺;50 纳克/mL 12-O-tetradecanoyl磷-13-醋酸盐（TPA）;1 x 10-4 M 3-乙丁基-1-甲基苯丙胺 （IBMX）;1 μM Na3VO4;1 x 10-3 M N-6，2°-O-dibutyryladenosine-3+，5°-循环单磷酸盐（dbcAMP）。
2. 传统方法
- 皮肤组织预处理
- 用10 mL的75%乙醇（酒精）冲洗一次成人的年金组织一次，然后用10 mL的洗涤液（3%P/S）冲洗两次，每次冲洗5分钟。
注：如果有很多血液，在开始时用 10 mL 的 PBS 清洗浴皮组织。所有洗涤都用100毫米细胞培养皿烹制。 - 用手术刀片刮除每个包皮组织，以去除100毫米细胞培养盘盖中皮下脂肪组织和松散的结缔组织。
注：使用手术刀刮走脂肪层，直到只有薄表皮和密集的真皮保留。 - 将每个成人的表皮转移到另一个 100 mm 的培养皿中，皮毛侧向下。
注：使用手术刀刀片将每个成人爱皮组织切成 3-4 mm 宽的条，使脱毛工作更高效。 - 将 2.5 mg/mL diss 添加到每个 100 mm 培养皿中，配以成人外皮组织，并在 4 °C 下孵育 16 至 20 小时。
注：每克组织用10mL的解液消化。
- 用10 mL的75%乙醇（酒精）冲洗一次成人的年金组织一次，然后用10 mL的洗涤液（3%P/S）冲洗两次，每次冲洗5分钟。
- 表皮与成人爱皮组织的分离
- 消化16至20小时后，使用钳子将表皮与真皮分离。用一个钳子抓住组织皮肤边缘的一侧，用另一个钳子抓住表皮部分的相应位置，轻轻剥下表皮。
- 用洗涤液（3% P/S）清洗表皮 3 倍，然后将表皮转移到管中。
- 将 5 mL 的 0.05% 三辛加入管中，在 37 °C 的水浴中孵育 30 分钟，使表皮淹没。
注：摇动管子，确保表皮在孵化前完全浸入水中。
- 原细胞的收集和培养
- 添加等量的端接溶液（10% FBS，1% P/S 在 DMEM 中），以中和 trypsin 并移液溶液上下 10-15 次，以分离表皮细胞。
- 通过 100 μm 网状过滤器将电池悬浮液插入新的 50 mL 管中，以清除碎屑。
- 在200 x g下离心5分钟。
- 去除上一提液，加入10 mL的接种TIVA介质，重新给细胞。
- 将重新暂停的细胞播种到100毫米培养皿中。
- 37°C 培养箱中的培养，具有 5% CO2。
- 每 2 天更换一次介质。
- 当细胞达到80%的汇合时，通过细胞。
3. 新方法
注：新方法中组织制备和消化的过程与上述常规方法相同，唯一的区别是分离的新鲜细胞在含有10μM Y-27632的TIVA介质中重新产生。
- 播种两天后，用不带 Y-27632 的正常 TIVA 介质替换介质。之后，新方法与传统方法之间的培养条件是相同的。
4. 细胞传通
- 取出 TIVA 介质，然后用 PBS 冲洗每个培养皿两次。
- 每100毫米细胞培养盘加入2 mL 0.05%的三辛。
注：摇动盘子，确保消化酶和菜底之间充分接触。 - 在37°C培养箱中消化2分钟。
- 使用显微镜检查细胞，并确保大多数细胞与细胞培养皿分离。
注：轻轻敲按盘子，释放细胞以四舍五入，并在溶液中浮动。延长消化时间，如果大多数细胞没有暂停后，攻丝，但不超过5分钟。 - 通过添加2 mL的终止溶液，将黑色素细胞转移到15 mL管中后，加入2 mL的终止溶液，从而消除尝试素活性。在200 x g下离心5分钟。
- 在慢慢去除上经剂后，用10 mL的TIVA培养基重新暂停每个细胞颗粒，然后计算黑色素细胞的数量。
- 每100毫米细胞培养盘610 mL的TIVA培养皿中约有1 x 10 6黑色素细胞。
- 每 48 小时更新一次细胞培养培养。
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Representative Results
图 1显示了比较传统方法和新方法的示意图。新方法的组织制备和消化过程与传统方法的程序相同，唯一的区别是分离的细胞在10μM Y-27632存在的情况下在TIVA培养基10 mL中重新产生。播种两天后，用不带 Y-27632 的正常 TIVA 介质替换介质。将原发性黑色素细胞与皮肤组织分离的传统方法通常需要大约3至4周，黑色素细胞生长在足够数量通过，但更重要的是，组织通常来自新生儿，很难从成人皮肤组织分离原发性黑色素细胞。然而，使用新方法，从成人组织观察到的黑色素细胞的数量明显高于使用传统方法分离的黑色素细胞。在第3天、第6天和8天，使用传统方法和新方法将黑色素细胞从成人皮肤组织中隔离，因此采取了显微视图（图2A）。在这些微观视图中，新方法显著提高了黑色素细胞在第6天和8天的产量。然后，通过计算第3天、第6天和8天至少10个不同的微观场来量化褪黑细胞数。结果表明，使用新方法分离的黑色素细胞数量远高于在第6天和8天使用常规方法分离的黑色素细胞数量（图2B）。经过8天的培养，黑色素细胞被收获使用 trypsin，然后用一个自动细胞计数器在每个100毫米的菜计数，这揭示了新方法增加了约5倍的黑色素细胞产量（图2C）。在第9天，即传世一天后拍摄的微观视图显示，通过黑色素细胞正常增殖（图2D），基67染色证实了这一点（图2E）。
在隔离后的初始培养过程中，Y-27632的黑色素细胞的增产性已经通过上一本出版物16中对角蛋白细胞的调控而得到证明。如图3所示，Y-27632没有增加通过黑色素细胞的生长和增殖（图3A-B），也没有抑制黑色素细胞的凋亡（图3C-D）。然而，Y-27632显著增加了角蛋白细胞附着（图3E-H），也促进了它在黑色素细胞培养TIVA介质中存活（图3I）。要么与角蛋白细胞在Y-27632存在的情况下共同培养，要么从Y-27632治疗性角蛋白细胞中提取的调节介质可以显著促进黑色素细胞的生长（图3J）。
为了进一步描述使用新方法分离的黑色素细胞，MITF，一种特定的黑色素细胞标记，使用免疫荧光（IF）染色来分析在初始通传后检查黑色素细胞的纯度。图4A显示，在第1段表达MITF的细胞百分比接近100%，表明采用新方法第一次通过后获得纯黑色素细胞，与传统方法类似。为了测试使用新方法分离的黑色素细胞是否能正常工作，在体外用福斯科林（FSK）进行了2天的治疗，从而诱发了黑色素细胞的色素沉着水平（图4B）。综合起来，这些数据表明，使用新方法分离的黑色素细胞可以正常工作，并能产生色素。
图1：新方法与传统方法的比较。该方案显示了传统方法与新隔离方法的比较。唯一的区别是，分离的新鲜细胞在10μM Y-27632存在的情况下，在10mL的TIVA介质中重新被重新暂停。播种两天后，介质被不带 Y-27632 的正常 TIVA 介质取代。新方法通常达到适合在第8天左右传传的黑色素细胞密度，而传统方法通常需要大约20天来增加足够的黑色素细胞来进行传传。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：新的隔离方法增加了原发性黑色素细胞的产生。（A） 由常规方法（上排）和新方法（下排）在初始接种后的第3天、第6天和8天准备的黑色素细胞的代表性图像。（B） 使用传统方法和新方法对黑色素细胞数进行量化，方法是在第3天、第6天和8天计算至少10个不同微观场（细胞数/视觉）中的黑色素细胞数。所有实验都是三倍进行的，结果表示为每个微观场的平均细胞数。（C） 培养8天后，使用三辛收获黑色素，用传统方法准备的黑色素细胞数量，用细胞计数板计算新方法。细胞数是经过三倍实验计算的，结果显示每100毫米培养皿的平均细胞数。（D） 使用自动细胞计数器计算黑色素细胞数量后，用传统方法或新方法准备的黑色素细胞被播种到新菜中，并在第9天拍摄显微照片。（E） 使用新方法在通道0或第1段分离的褪黑细胞被固定并染色为Ki67抗体（红色）和DAPI（核，蓝色）。（B-C），学生的 t-测试用于分析新方法与传统方法之间的差异 ， ** P < 0.01， ***P < 0.005。所有比例线代表 100 μm 。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：Y-27632通过调节角蛋白细胞来增强黑色素细胞的生长。（A） 纯黑色素细胞（第3条）用10μM Y-27632治疗12、24、48和60小时，通过CCK-8测定分析黑色素细胞的数量。（B） 纯黑色素细胞（第3条）用10μM Y-27632处理48小时，然后固定为Ki67染色。使用DAPI核染色表明的总活细胞中Ki67阳性细胞的百分比的定量。（C-D）纯黑色素细胞（第3条）用10μM Y-27632治疗48小时，然后被染色的凋亡细胞与附件V-FITC和碘化丙二，其次是FACS分析（C）或固定为调谐分析。（E） 胰蛋白酶消化后分离表皮用TIVA介质镀有或没有Y-27632（10μM），2天后用泛细胞素抗体（pan-ck）对角蛋白细胞进行免疫荧光分析。（F） Y-27632处理和控制菜肴中角蛋白细胞的定量，在总共500个细胞中，作为角蛋白细胞的百分比。（G） 纯通道3角蛋白细胞在TIVA介质中播种，有无Y-27632（10μM）。表皮细胞的图像在播种后一天显示。（H） Y-27632处理的附着角蛋白细胞的定量，从（G）中作为在总共5000个细胞中附着的细胞的百分比。（I） 纯通道3角蛋白细胞在Y-27632存在或不存在的情况下用TIVA介质镀上。微观图像在24小时（J） 左面板获得：等数纯通道3黑色素细胞镀与TIVA介质在4组，并添加（s）指示： 1） Y-27632 （10 μM 单独（图中的 Y），2） 通道 3 角蛋白细胞单独 ， 3） 角蛋白细胞和 Y-27632 （10 μM） （K+Y）， 和 4） 没有添加 （负控制， 康）。与负控制相比，黑色素细胞增殖的相对折叠变化通过计算电镀后 24 小时和 48 小时黑色素细胞的数量来确定。右面板：在电镀后 48 小时，从 4 组 3 黑色素细胞培养物获得有条件 TIVA 介质。然后，将相同数量的通道3黑色素细胞镀为4组，每组与一个条件介质。与负控制相比，黑色素细胞增殖的相对折叠变化通过计算电镀后 24 小时和 48 小时黑色素细胞的数量来确定。（A-J）所有实验已重复3次，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。pp图像中的所有条形表示 100 μm。这个数字已经修改了从Mi等人16。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：使用新方法分离的黑色素细胞特征。（A） 使用新法或常规方法在黑色素细胞中对MITF（红色）的免疫荧光染色具有代表性的图像。DAPI 染色核（蓝色）。（B） 细胞颗粒是从使用新方法培养的黑色素细胞中收集的，并经过2天的处理，用福斯科林（FSK）或DMSO车辆作为控制（con）。所有比例线代表 100 μm 。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这里描述的协议是基于最近的出版物16。应注意以下关键步骤，以便采用新方法获得最佳效果。首先，成功分离表皮和真皮至关重要。使用手术刀刀片将成人的外皮组织切成 3-4 mm 宽的条，使脱毛工作更彻底、更容易地将表皮与真皮分离。其次，在分离这两层时，应避免真皮污染，因为皮肤纤维细胞也可以生长在黑色素细胞培养基中。第三，三是消化步骤应小于30分钟;否则，它会显著降低分离细胞的生存能力。
这种新方法显著缩短了黑色素细胞分离所需的时间。人类表皮黑色素产生黑色素，保护皮肤免受太阳照射损伤。艾辛格和马尔科从表皮5中提出了人类黑色素细胞培养的第一个实用方法。最重要的是，使用的组织通常来自新生儿，很难从成人皮肤组织中分离出原发性黑色素细胞。Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632显著提高表皮干细胞分离效率11-13。-13此外，我们还报告了一种方法，在Y-2763210，11的存在下，将人类原发性表皮细胞从皮肤组织中隔离。在此协议中，Y-27632被证明能有效提高原发性黑色素细胞的产量。使用传统方法具有较低的细胞恢复率，需要约3至4周的培养，黑色素细胞生长在足够的数量通过。这种新方法，其中Y-27632被添加到TIVA生长介质中，使黑色素细胞产量增加约五倍，获得的黑色素细胞可以正常增殖。我们还使用商业媒介测试了新方法，并发现了类似的结果。关于所涉及的机制，最近的一项研究表明，Y-27632对提高黑色素细胞分离效率的影响主要通过角蛋白细胞16发生。
重要的是，我们利用新方法获得了具有正常功能的纯黑色素细胞。通道1（P1）黑色素细胞几乎都染色为MITF表达表明，纯黑色素细胞获得后的第一个通道。具有高生长潜力的原发性黑色素细胞对于生物研究和临床应用非常重要。使用新方法分离的黑色素细胞，在用福斯科林（一种增加循环AMP水平的腺酸酯环酶的活化剂）治疗后，可以诱导到色素中，表明这些黑色素细胞可以正常工作，这对于研究色素沉着缺陷和黑色素瘤14是有用的。
总之，成功地建立了一种从成人皮肤组织中分离原发性黑色素细胞的高效方法。这种改进的方法有助于为生物研究和临床应用快速提供足够数量的黑色素细胞。
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Disclosures
所有作者都声明没有冲突利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家国家重点研究发展计划（2017YFA0104604）、国家自然科学基金总计划（81772093）、军事后勤研究项目（AWS17J005）、山东省自然科学基金重点项目（ZR2019ZD3）的支持。 6）和山东省重点研究发展计划（2019GSF108107）至X.W.广东基础与应用基础研究基金会（2019A1515110833）和山东大学基础研究基金（2019GN043）至J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
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