Summary
يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لتحليل عبء تصلب الشرايين في الفئران. يمكن للمحققين استخدام هذا البروتوكول لمقارنة وفرة وموقع وحجم آفات تصلب الشرايين في الحيوانات المختلفة.
Abstract
الفئران المفرطة للدهون الناقصة Apolipoprotein E (Apoe) - أو مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة (Ldlr) هي النموذجان الأكثر استخداما لأبحاث تصلب الشرايين. يتم استخدامها لدراسة تأثير العوامل الوراثية المختلفة وأنواع الخلايا المختلفة على تكوين آفة تصلب الشرايين وكذلك اختبار تطوير علاجات جديدة. العزل ، واستئصال الشريان الأورطي بأكمله ، والقياس الكمي لآفات تصلب الشرايين الملطخة بالزيت الأحمر O هي طرق مورفومترية أساسية تستخدم لتقييم عبء تصلب الشرايين. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف طريقة جراحية محسنة خطوة بخطوة لتشريح وإصلاح الثقب والعزل والبقع والصورة وتحليل آفات تصلب الشرايين في الشريان الأورطي للفئران باستخدام Oil Red O. نظرا لأن الآفات التصلب الأذيني يمكن أن تتشكل في أي مكان في شجرة الأبهر بأكملها ، فإن طريقة تلطيخ الأبهر بالزيت الأحمر O بأكملها تتمتع بميزة تقييم اللويحات المحملة بالدهون في الشريان الأورطي بأكمله وجميع الفروع في فأر واحد. بالإضافة إلى تلطيخ الزيت الأحمر O ، يمكن استخدام الأبهر الكامل المعزول الطازج لمجموعة متنوعة من التجارب في المختبر وفي الجسم الحي وعزل الخلايا.
Introduction
عادة ما يحدث مرض الشريان التاجي، وهو سبب رئيسي للوفيات في الولايات المتحدة، بسبب تصلب الشرايين، وهي عملية تؤدي إلى تراكم اللويحات داخل جدران الشرايين1. تعد الفئران المعرضة لفرط شحميات الدم المعرضة لنقص Apoe و Ldlr أساسية لتحقيقات تصلب الشرايين ومضاعفاته وتطوير العلاجات2،3،4،5. يعد التحديد الكمي لآفات تصلب الشرايين من الشريان الأورطي في الوجه تحليلا مهما لنقطة النهاية لتقييم تأثير التلاعب الجيني في أنواع الخلايا المختلفة. كما أنه يساعد على دراسة العلاجات الجديدة المصممة للتأثير على بدء مرض تصلب الشرايين وتطوره وانحداره. يمكن أن تتشكل آفات تصلب الشرايين في أي مكان في الشريان الأورطي وفروعه (أي الشرايين العضدية والسباتية وتحت الترقوة في الصدر، وكذلك الشرايين الكلوية والحرقفية والفخذية الشائعة أسفل الحجاب الحاجز)6. يتطلب التقييم الشامل لعبء تصلب الشرايين والعلاج المناسب تقييم عبء المرض في مواقع مختلفة ، وهو تحد غالبا ما يتم تجاهله.
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحليل شامل لآفات تصلب الشرايين ، بدءا من الشريان الأورطي الكامل غير المفتوح والمضي قدما في إعداد الوجه ، في فأر واحد. يسمح تلطيخ الشريان الأورطي الكامل غير المفتوح بالزيت الأحمر O بإجراء تقييم سريع ونوعي للويحات المحملة بالدهون في الشريان الأورطي بأكمله وفروعه ، بينما يوفر إعداد الوجه تقييما كميا لتوزيع آفة تصلب الشرايين في الشريان الأورطي للفأر.
تستخدم هذه التقنية فئران عمرها 8 أسابيع مع حذف TGFβR2 خاص بخلايا العضلات الملساء على خلفية Apoe-/- hyperlipidemic (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; أبو-/-; يشار إليها فيما يلي باسم الفئران TGFβR2iSMC-Apoe) وعناصر التحكم في القمامة Apoe-/- (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; أبو-/-; يشار إليها فيما يلي باسم Apoe-/- الفئران). يتم الاحتفاظ بالحيوانات لمدة 16 أسبوعا على نظام غذائي عالي الكوليسترول عالي الدهون (HCHFD) كمواد دراسة7. عند إنهاء الدراسة ، يتم تلطيخ الأبهر الكامل غير المفتوح وتصويره (بما في ذلك جميع الفروع الرئيسية) باستخدام Oil Red O للتقييم النوعي للويحات المحملة بالدهون. يتم قطع الشريان الأورطي عن طريق إعداد الوجه ، ويتم تصوير جميع آفات تصلب الشرايين وتحديدها كميا. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة تطور آفة تصلب الشرايين في نماذج الفئران Apoe-/- أو Ldlr-/- فرط شحميات الدم وتوسيعه ليشمل تطبيقات بيولوجيا الأوعية الدموية العامة المتعلقة بالشريان الأورطي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء الفئران mT / mG (رقم المخزون 007676) ، و Apoe-/- (رقم المخزون 002052) من مختبر جاكسون. كانت الفئران Myh11-CreERT2 هدية من ستيفان أوفرمان (متوفرة من مختبر جاكسون كمخزون رقم 019079). تم الحصول على الفئران Tgfbr2fl / fl من هارولد ل. موسى (جامعة فاندربيلت). تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية باستخدام بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ييل.
1. الفئران
- إنتاج MYH11-CreERT2 ؛ mT / mGf / f ؛ أبو-/- و MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- الفئران كما هو موضح سابقا7. تولد سلالات متحولة إلى خلفية C57BL/6J لأكثر من عشرة أجيال.
ملاحظة: يوفر خط الماوس Myh11-CreERT2 Cre أداة قوية لدراسة دور خلايا العضلات الملساء في توازن الأوعية الدموية وأمراض الأوعية الدموية. يتم إدخال أليل Cre في كروموسوم Y. وبالتالي ، فإن الفئران الإناث لا تعبر عن هذا البناء.
2. التنميط الجيني للفئران ، تحريض تاموكسيفين ، وتغذية النظام الغذائي عالي الدهون عالي الكوليسترول
- إجراء التنميط الجيني للفأر باستخدام الحمض النووي لأذن الفأر وتحليل PCR. يجب عزل الحمض النووي لأذن الفأر باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي للدم والأنسجة (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وترد في الجدول 1 قائمة بمواد الاشعال لتفاعل البوليميراز المتسلسل.
- حث إعادة تركيب Cre-Lox عن طريق حقن تاموكسيفين عند 1 ملغ / يوم i.p. لمدة 5 أيام في MYH11-CreERT2 البالغ من العمر 6 أسابيع ؛ mT / mGf / f ؛ أبو-/- و MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- ذكر الفئران.
- حث تصلب الشرايين عن طريق وضع الفئران الذكور البالغة من العمر 8 أسابيع (بعد أسبوعين من علاج تاموكسيفين) على نظام غذائي HCHF (40 ٪ من الدهون سعرة حرارية ، 1.25 ٪ من الكوليسترول ، 0 ٪ حمض الكوليك) لمدة 16 أسبوعا.
3. إعداد الكواشف وأدوات التشريح
- إعداد محلول Stock Oil Red O: قم بإذابة 1 جم من الزيت الأحمر O في 100 مل من كحول الأيزوبروبيل.
- إعداد محلول الزيت الأحمر O العامل: امزج 24 مل من محلول Oil Red O مع 16 مل من dH2O. قم بتصفية الزيت الأحمر المخفف O مع مرشحات حقنة معقمة 0.45 ميكرومتر (الحل جيد فقط لمدة 1-2 ساعة).
- 60٪ إعداد الكحول الأيزوبروبيل: مزيج 60 مل من الكحول الأيزوبروبيل مع 40 مل من dH2O.
- 4 ٪ الفورمالديهايد في إعداد 1x DPBS: تمييع 10 مل من الفورمالديهايد 16 ٪ في 30 مل من 1x DPBS.
- تنظيف جميع أدوات التشريح مع 70 ٪ من الإيثانول (الشكل 1).
4. القتل الرحيم (الشكل 2 أ)
- قياس وزن الفأر قبل القتل الرحيم.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين والزيلازين (كل ملليلتر يحتوي على 10 ملغ / مل الكيتامين و 2 ملغ / مل زيلازين).
- ضع الماوس في وضع ضعيف (جانب البطن وجها لوجه).
5. فتح تجويف الصدر والبطن وتروية القلب (الشكل 2B)
- تحضير حقنة 10 مل مع 10 مل من 1x DPBS. غطاء بإبرة 25 جم. سيتم استخدام المحقنة لطرد القلب.
- امسك الجلد باستخدام ملاقط (النمط 5) وقطعه بمقص ناعم من قاعدة البطن إلى أعلى الرقبة.
- افتح جدار البطن أسفل القفص الصدري.
- ارفع القص باستخدام ملاقط (النمط 5) واقطع الحجاب الحاجز ، ثم اقطع القفص الصدري لكشف التجويف الصدري.
- قم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن للقلب.
- اندمج من خلال ثقب البطين الأيسر القمي عن طريق حقن 10 مل ببطء من 1x DPBS. بمجرد أن يتم فحصها بدقة ، يصبح لون الكبد والكلى بنيا فاتحا.
- نظف تجويف الصدر من الدم والسوائل الدخيلة باستخدام إسفنجة غير منسوجة لامتصاص المادة.
6. عزل الشريان الأورطي والفروع (الشكل 2 ج)
- قم بإزالة الأعضاء (أي الرئة والكبد والطحال والجهاز الهضمي والأعضاء التناسلية) وقطع الترقوة باستخدام ملاقط (النمط 5) ومقص دقيق مع ترك القلب والكلى والشريان الأورطي سليمة في الموقع.
ملاحظة: تأكد من عدم تهتك القلب أو أي أوعية دموية رئيسية. - ضع الماوس تحت المجهر المجسم.
- تشريح فروع الشريان الأورطي والشريان الأورطي بما في ذلك الشريان العضدي والشرايين السباتية والشرايين تحت الترقوة والشرايين الكلوية والشرايين الحرقفية الشائعة والشرايين الفخذية باستخدام ملاقط (النمط 4) ومقص الربيع.
ملاحظة: غطي الشريان الأورطي بإسفنجة مبللة وغير منسوجة لتجنب الجفاف أثناء تشريح فروع الشريان الأورطي. - تشريح بعناية وإزالة الأنسجة الدهنية والضام حول فروع الشريان الأورطي والشريان الأورطي باستخدام ملاقط (النمط 4) ومقص الربيع.
ملاحظة: نظرا لأن الالتهاب بارز في فأر فرط شحميات الدم تمدد الأوعية الدموية ، فمن الصعب إزالة الغدة الدرقية. احرص على عدم تمزيق أو تمزق فروع الشريان الأورطي والشريان الأورطي. هذه الخطوة تتطلب الممارسة والصبر.
7. تثبيت القلب والشريان الأورطي (الشكل 2D ، E)
- تحضير حقنة 10 مل مع 10 مل من الفورمالديهايد 4 ٪ في 1x من DPBS. غطاء بإبرة 25 جم.
تحذير: الفورمالديهايد خطير. اقرأ MSDS قبل العمل مع هذه المادة الكيميائية. ارتداء القفازات ونظارات السلامة وإنتاج حلول التخفيف داخل غطاء الدخان.
ملاحظة: 4٪ يتحلل محلول الفورمالديهايد بمرور الوقت. من المهم استخدام الفورمالديهايد الطازج بنسبة 4٪ للتثبيت. - إصلاح شجرة الأوعية الدموية من خلال ثقب البطين الأيسر القمي عن طريق حقن ببطء 10 مل من الفورمالديهايد 4٪.
ملاحظة: يتداخل تثبيت الفورمالديهايد مع العديد من التطبيقات النهائية ، مثل زراعة الخلايا ، وتحليل FACS ، وتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. تخطي هذه الخطوة إذا كان سيتم استخدام الشريان الأورطي لأي من هذه التطبيقات. - نظف تجويف الصدر من أي سائل غريب باستخدام إسفنجة غير منسوجة لامتصاص المادة.
- افصل القلب عن الشريان الأورطي عن طريق الإمساك بالقلب باستخدام ملاقط (النمط 4) واستخدام مقص زنبركي دقيق التشريح.
ملاحظة: لإجراء تلطيخ في الوجه بالزيت الأحمر O بعد هذه الخطوة ، يوصى بقطع الشريان الأورطي مفتوحا في الموقع بدلا من خارج الجسم الحي والمتابعة إلى القسم 8. هذا يجعل من السهل على الشريان الأورطي في الوجه الاستلقاء بشكل مسطح. - عزل واستئصال الشريان الأورطي وكبيره من 1 مم فوق الشريان السباتي إلى نهاية الشريان الفخذي باستخدام ملاقط (النمط 4) ومقص الربيع.
- انقل الوعاء إلى طبق بتري شمعي أو أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل واملأه ب 1x DPBS حتى يغطي الشريان الأورطي.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
8. تلطيخ الزيت الأحمر O وتصوير الشريان الأورطي الكامل غير المفتوح (الشكل 3)
- قم بتثبيت الوعاء على طبق بتري من الشمع باستخدام دبابيس دقيقة (الشكل 3A).
- شطف السفينة مرة واحدة مع 1x DPBS.
- صب 25 مل من محلول الزيت الأحمر الطازج O في طبق بتري (الشكل 3B).
ملاحظة: (1) الأيزوبروبانول خطير وسائل قابل للاشتعال. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. (2) يمكن أن يترسب محلول Oil Red O بسهولة. يمكن أن تتداخل الجسيمات المترسبة مع التلطيخ اللاحق. من المهم إزالة الراسب عن طريق تصفية محلول Oil Red O من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر قبل الاستخدام. (3) من الأفضل تحضير محلول Oil Red O الطازج والتخلص من أي محلول غير مستخدم. (4) بالإضافة إلى Oil Red O ، السودان الرابع هو مركب كيميائي آخر يستخدم لتلطيخ الدهون والدهون الثلاثية والبروتينات الدهنية. ومع ذلك ، فقد حل Oil Red O تدريجيا محل السودان IV لأن اللون الأحمر الذي ينتجه Oil Red O أكثر كثافة وبالتالي يمكن أن يجعل الدهون أسهل بكثير في الرؤية. - قم بتلطيخ الشريان الأورطي لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). سوف يقوم الزيت الأحمر O بتلطيخ البلاك الغني بالدهون باللون الأحمر ، تاركا المناطق الأخرى التي لا تحتوي على البلاك شاحبة اللون.
- يغسل مرة واحدة لمدة 20 دقيقة مع 60٪ ايزوبروبانول في RT.
ملاحظة: الإفراط في الشطف يمكن أن يزيل البلاك. - شطف الشريان الأورطي 3x مع dH2O لمدة 5 دقائق لإزالة الأيزوبروبانول.
- تحت المجهر المجسم، نظف بلطف جميع الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية حول الشريان الأورطي باستخدام ملاقط (النمط 4) ومقص زنبركي (الشكل 3C، D).
ملاحظة: من المهم تنظيف جميع الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية حول الشريان الأورطي وفروعه بعد التلطيخ ، لأن الأنسجة الدهنية حول الأوعية الدموية الملطخة باللون الأحمر O يمكن أن تنتج خلفية خاطئة وتتداخل مع قياس البلاك وتحديد مساحة اللويحات. تأكد من عدم إزالة جزء من جدار الأبهر. املأ طبق الشمع ب dH2O حتى يغطي الشريان الأورطي الملون أثناء التنظيف. هذه الخطوة تتطلب الممارسة والصبر. - انقل الوعاء إلى شريحة مجهر زجاجية نظيفة.
- احصل على صور مجهرية رقمية باستخدام كاميرا متصلة بمجهر ضوئي. احفظ الصور عالية الدقة، ويفضل أن يكون ذلك بتنسيق ملف الصور (TIFF) (الشكل 3E).
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. لمنع الشريان الأورطي من الجفاف ، انقل الوعاء إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل واملأه ب 1x DPBS حتى يغطي الشريان الأورطي. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
9. تصاعد الشريان الأورطي في الوجه (الشكل 4 ، الشكل 5)
- انقل الوعاء إلى طبق بتري الشمع واملأه ب 1x DPBS حتى يغطي الشريان الأورطي.
- قطع الشرايين السباتية تحت الترقوة في قوس الأبهر والشرايين الحرقفية في الشريان الأورطي البطني 1-2 مم بعد التشعبات. قطع الشرايين الكلوية. (الشكل 4 ألف)
- قطع طوليا إعداد الشريان الأورطي على طول الانحناء الداخلي (الشكل 4B1) والشرايين الحرقفية وحدها (الشكل 4B2) مع مقص زنبركي تشريحي دقيق.
- اقطع الفروع الثلاثة للقوس الأبهري (أي الترشيح ، الشريان السباتي المشترك الأيسر ، الشريان تحت الترقوة الأيسر) على طول الانحناء الأكبر حتى المستوى الأساسي للانحناء الداخلي (x-mark) (الشكل 4B3-B8) باستخدام مقص زنبركي تشريحي دقيق.
- قم بتثبيت الشريان الأورطي بشكل مسطح (جانب التجويف وجها لوجه) في طبق شمعي مع دبابيس دقيقة وتطبيق 1x DPBS حتى يغطي الشريان الأورطي لمنعه من الجفاف (الشكل 4C).
ملاحظة: (1) من المهم جعل الشريان الأورطي الملفوف مسطحا وتثبيته على وجهه دون التمدد. ستستغرق هذه الخطوة بضعة أيام اعتمادا على شدة تصلب الشرايين. (2) بالنسبة للشريان الأورطي من Apoe-/- أو Ldlr-/- ، يوصى بتثبيت الشريان الأورطي بشكل مسطح لمدة 24 ساعة. (3) يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - نظف شرائح المجهر الزجاجي باستخدام 70٪ من الإيثانول ومساحات المهام الحساسة (الشكل 5A).
- انقل الشريان الأورطي إلى شريحة مجهر زجاجية نظيفة وضع 15 قطرة من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) على شريحة مجهر زجاجية نظيفة أخرى (الشكل 5B).
- ضع شريحة المجهر الزجاجي بعناية مع مركب OCT فوق الشريان الأورطي وتجنب محاصرة فقاعات الهواء على الشريحة (الشكل 5C).
- قم بتسمية الشرائح بأسماء العينات (الشكل 5D).
ملاحظة: يمكن تخزين شرائح الشريان الأورطي المثبتة في الوجه في غرفة الرطوبة عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
10. التصوير وتحديد كمية الآفة للشريان الأورطي في الوجه (الشكل 6)
- احصل على صور مجهرية رقمية باستخدام كاميرا متصلة بمجهر ضوئي. احفظ الصور عالية الدقة، ويفضل أن يكون ذلك بتنسيق ملف الصور (TIFF) (الشكل 6A).
- انقل صور الشريان الأورطي الكامل الملطخ بالوجه إلى جهاز كمبيوتر مجهز ببرنامج ImageJ.
- في ImageJ ، حدد أداة "التحديد الحر" وقم بوضع دائرة حول جميع اللوحات الملطخة بالألوان باللون الأحمر الزيتي يدويا (بقع حمراء مكثفة) أثناء الضغط على مفتاح "Alt" (لجهاز الكمبيوتر الذي يعمل بنظام Windows) أو مفتاح "Shift" (لنظام التشغيل Mac). ثم انقر فوق "قياس" في قائمة "تحليل" لعرض مناطق الآفة في نافذة النتيجة (الشكل 6B على اليسار).
ملاحظة: هناك العديد من المزالق لتحديد كمية آفات تصلب الشرايين: (1) أي قطع صغيرة من الدهون الظهورية الملطخة التي ظلت متصلة بالشريان الأورطي من الخطوة 8.7 يمكن أن تسفر عن خلفية خاطئة وتتداخل مع تحديد كمية اللويحات. (2) إزالة جزء من جدار الأبهر أو إتلاف الشريان الأورطي من الخطوتين 6.4 و 8.7 يمكن أن تتداخل مع تحديد كمية اللويحات. (3) يمكن أن تتداخل الفقاعات والطيات التي تشكلت في الشريان الأورطي بعد التركيب (الخطوة 9.8) مع تحديد كمية اللويحات. و (4) لوحة تصلب الشرايين هي ظاهرة ثلاثية الأبعاد ، وقد لا تعكس القياسات التي يتم إجراؤها في مستوى 2D المدى الحقيقي للوحة. بالإضافة إلى تحليل منطقة لوحة الشريان الأورطي en face ، يوصى بتحليل حجم اللويحات في جذر الأبهر والشريان العضدي العضدي والشريان الأورطي الصاعد والشريان الأورطي البطني بشكل منفصل8. - ضع دائرة حول خط الحدود الخارجي للشريان الأورطي وانقر فوق "قياس" في قائمة "تحليل" لعرض منطقة الشريان الأورطي في نافذة النتيجة (الشكل 6B على اليمين).
- تصدير كافة القياسات إلى ملف Excel.
- احسب نسبة مساحة البلاك من إجمالي مساحة الشريان الأورطي وقم بتطبيع القيمة كنسبة مئوية من إجمالي مساحة سطح الزيت الأحمر O.
- احسب نسبة مساحة البلاك في 8-10 فئران Apoe-/- و 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe. اعرض البيانات كمتوسط ± SEM (الشكل 6C).
- قم بإجراء اختبار t للطالب غير المقترن للتحليل الإحصائي لنسبة بيانات منطقة اللوحة مقارنة بمجموعة ماوس أخرى. ضع في اعتبارك الاختلافات في القيم المتوسطة على أنها معنوية عند p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول ، تم تحليل آفات تصلب الشرايين في الفئران TGFβR2iSMC-Apoe بعد 4 أشهر على نظام غذائي HCHF 7. بالإضافة إلى تصلب الشرايين واسع النطاق ، طورت هذه الفئران تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري والبطني ، كما ذكر سابقا. بالمقارنة مع الفئران Apoe-/- ، أظهرت جدران الأبهر للفئران TGFβR2iSMC-Apoe تصلب الشرايين الشديد ، مما يجعل من الصعب تشريح الآفات (الشكل 2C ، D ، E). بالإضافة إلى ذلك ، فإن تمدد الأوعية الدموية واسع النطاق بشكل خاص أسفل الشريان الأورطي فوق الكلوي ، مما يذكرنا إلى حد كبير بتمدد الأوعية الدموية الأبهري البشري المتقدم.
ويبين الشكل 3E صورة تلطيخ ممثل غير مفتوح لزيت الشريان الأورطي الأحمر O من ماوس TGFβR2iSMC-Apoe الذي يغذيه HCHFD. تظهر الصورة فأر TGFβR2iSMC-Apoe الذي طور تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصاعد والبطني، وتظهر تكوين آفة تصلب الشرايين المتسارع في فروع الشريان الأورطي (هنا، الشريان العضدي، الشريان السباتي، الشرايين تحت الترقوة، الشرايين الحرقفية، الشرايين الفخذية، والشرايين الكلوية).
يوضح الشكل 6A صورة تلطيخ اللون الأحمر O للوجه ل Apoe-/- و TGFβR2iSMC-Apoe. بالمقارنة مع مجموعة Apoe-/- ، أظهرت الفئران TGFβR2iSMC-Apoe تضخما حادا في تمدد الأوعية الدموية واستطالة ملحوظة للشريان الأورطي بأكمله.
الشكل 1: أدوات التشريح المستخدمة في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بروتوكول خطوة بخطوة لاستئصال الشريان الأورطي من الفئران في النظام الغذائي لسداسي كلور حلقي الهكسان (HCHF).
هذا من فأر TGFβR2iSMC-Apoe يبلغ من العمر 24 أسبوعا يتم تغذيته لمدة 4 أشهر على نظام غذائي عالي الكوليسترول عالي الدهون (HCHF). (A) فأر تحت تخدير الكيتامين / الزيلين. تشير الخطوط المتقطعة إلى مكان قطع الجلد. (ب) تشريح الفأر للكشف عن التجاويف الصدرية والبطنية. (ج) الإزالة الدقيقة للأعضاء الداخلية (أي الرئة والكبد والطحال والجهاز الهضمي والأعضاء التناسلية) يليها تعرض الشريان الأورطي للفأر تحت مجهر تشريح. (د) الإزالة الدقيقة للأنسجة الضامة على طول الشريان الأورطي بأكبر قدر ممكن من النظافة. (ه) صورة الشريان الأورطي الكامل المعزول مع الفروع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بروتوكول خطوة بخطوة لتلطيخ وتصوير زيت الشريان الأورطي الأحمر O غير المفتوح.
(أ) تثبيت الشريان الأورطي بأكمله بفروع على طبق بتري بالشمع. (ب) تغطية الشريان الأورطي بمحلول تلطيخ أحمر زيتي O. (ج) رسم توضيحي للشريان الأورطي بأكمله بعد تلطيخ الزيت الأحمر O. (د) رسم توضيحي للشريان الأورطي الكامل الملون بالزيت الأحمر O بعد التنظيف. (ه) صور فوتوغرافية مجهرية تمثيلية للشريان الأورطي الكامل الملون بالزيت الأحمر O لفئران TGFβR2iSMC-Apoe بعد 4 أشهر من اتباع نظام غذائي بسداسي كلور حلقي الهكسان (HCHF). (أ') صورة تكبير عالية للشريان الأورطي الصاعد من (أ)، و (ب) صورة تكبير عالية للشريان الأورطي البطني من (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد الشريان الأورطي في الوجه.
(أ، ب) يتم فتح شجرة الشرايين الملطخة بالزيت الأحمر O طوليا لتسطيح الشريان الأورطي للتصوير. تشير الخطوط المنقطة على طول جدار السفينة والأرقام إلى التخفيضات المتسلسلة التي يتم إجراؤها لفتح الأوعية. (ج) تقسيم الشريان الأورطي بالكامل طوليا وتثبيته على طبق بتري من الشمع على شكل حرف Y. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: بروتوكول خطوة بخطوة لتركيب الشريان الأورطي في الوجه.
(أ) التنظيف اللطيف لشرائح المجهر الزجاجي بنسبة 70٪ من الإيثانول والتجفيف باستخدام مناديل مخبرية نظيفة. (ب) تطبيق مركب OCT على سطح شريحة مجهر زجاجي واحدة ، ثم نشر الشريان الأورطي في الوجه بشكل مسطح على شريحة المجهر الزجاجية الأخرى. (ج) وضع لطيف لشريحة المجهر الزجاجي مع مركب OCT أعلى عينة الشريان الأورطي في الوجه. (د) وضع علامات على الشريحة باسم العينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: بروتوكول خطوة بخطوة لتصوير الشريان الأورطي في الوجه وتحديد كمية آفة تصلب الشرايين.
(أ) صور فوتوغرافية مصغرة للشريان الأورطي في الوجه من الفئران Apoe-/- و TGFβR2iSMC-Apoe بعد 4 أشهر من اتباع نظام غذائي لسداسي كلور حلقي الهكسان وملطخة بالزيت الأحمر O. (B) صور توضح عملية التحديد الكمي بمساعدة الحاسوب لآفات تصلب الشرايين. (ج) القياس الكمي لمنطقة الآفة: تشير النسبة المئوية لمنطقة الآفة إلى الزيت الأحمر الملطخ بالألوان على أنه ٪ من إجمالي سطح الأبهر. جميع البيانات المعروضة كمتوسط ± SEM (***p < 0.001 ؛ اختبار t للطالب ثنائي الذيل غير المقترن ؛ n = 9 للفئران Apoe-/- و n = 9 لفئران TGFβR2iSMC-Apoe). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| MYH11-CreERT2 | 5'-TGA CCC CAT CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA CAT CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| أبوي | 5'-علامة دول مجلس التعاون الخليجي CCG AGG هفوة AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-دول مجلس التعاون الخليجي CCG قانون GCA TCT-3' | ||
الجدول 1: التنميط الجيني التمهيدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتين الشحمي E (Apoe) ومستقبلات البروتين الدهني منخفضة الكثافة (Ldlr) الفئران الناقصة مفيدة لدراسة تطور وعلاج تصلب الشرايين. يمكن للمحققين تقييم تأثير الوراثة والتلاعب العلاجي على بدء الأمراض المرتبطة بتصلب الشرايين وتطورها وتراجعها باستخدام تلطيخ الزيت الأحمر O للشريان الأورطي بأكمله9. يعد تلطيخ زيت الشريان الأورطي الأحمر O وتحديد كمية الآفة نقطة النهاية القياسية الذهبية لأبحاث تصلب الشرايين. هذه التقنية غير مكلفة ولا تتطلب معدات خاصة10. ومع ذلك ، ليس من السهل الحصول على أنسجة ملونة باللون الأحمر الملون بالزيت عالية الجودة. استنادا إلى الخبرة السابقة ، هناك ثلاث خطوات حاسمة في هذا البروتوكول ، ويتطلب الإجراء بأكمله الممارسة والصبر. الخطوة الحرجة الأولى هي القدرة على تشريح وإزالة وتنظيف جميع الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية حول الشريان الأورطي وفروعه قبل وبعد تلطيخ الزيت الأحمر O (الشكل 2D ، الشكل 3C ، D). الخطوة الرئيسية الثانية هي إعداد محلول Oil Red O الطازج والمصفى . وأخيرا، من المهم أن يكون الشريان الأورطي ذو الوجه en مسطحا على طبق شمعي قبل تركيبه على شرائح المجهر الزجاجي (الشكل 4C، الشكل 5B، C).
بالمقارنة مع بروتوكولات تلطيخ Oil Red O الأخرى ، توفر هذه الطريقة تقييمات نوعية وكمية للويحات المحملة بالدهون في الشريان الأورطي غير المفتوح والشريان الأورطي في الوجه من فأر واحد. يوفر التقييم النوعي الأولي لتلطيخ الزيت الأحمر O غير المفتوح فكرة عامة عن توزيع البلاك وحجم البلاك في الشريان الأورطي ، وكذلك جميع الفروع قبل تحديد كمية الشريان الأورطي في الوجه. تتمثل قيود الدراسة في أن (1) مقارنة وتحليل لويحات تصلب الشرايين ثلاثية الأبعاد لا تعكس المدى الحقيقي لأحجام لويحات تصلب الشرايين ، (2) إن تحديد كمية آفة تصلب الشرايين يستغرق وقتا طويلا ، و (3) يتطلب التضحية بالحيوانات.
بعد عزل الشريان الأورطي بنجاح ، يمكن استخدامه لمجموعة واسعة من الفحوصات للدراسات الجزيئية. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه للدراسات الميكانيكية الحيوية والتحليل النسيجي لتوصيف مورفولوجيا الشريان الأورطي المهبلي11. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمستخدمين عزل الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء من الشريان الأورطي الكامل المعزول حديثا لزراعة الخلايا ، وتحليل FACS ، وتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. باختصار ، يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لتحليل عبء تصلب الشرايين في الفئران. يمكن للمحققين استخدام هذا البروتوكول لمقارنة وفرة آفة تصلب الشرايين وموقعها وحجمها بين الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من خلال منحة صغيرة مشتركة لاتحاد البيولوجيا مقدمة بموجب منحة المعاهد الوطنية للصحة P30AR070253 (P.-Y.C.) ، و HL135582 (M.S). نحن ممتنون ل R. Webber و L. Coon للحفاظ على الفئران المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J.
- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
