Summary
Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å analysere aterosklerotisk byrde hos mus. Etterforskere kan bruke denne protokollen til å sammenligne overflod, plassering og størrelse på aterosklerotiske lesjoner hos forskjellige dyr.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe)- eller lipoproteinreseptor med lav tetthet (Ldlr)-mangelfulle hyperlipidemiske mus er de to mest brukte modellene for ateroskleroseforskning. De brukes til å studere effekten av en rekke genetiske faktorer og forskjellige celletyper på aterosklerotisk lesjonsdannelse og samt teste utviklingen av nye terapier. Isolasjon, eksisjon av hele aorta og kvantifisering av oljerød O-farget aterosklerotiske lesjoner er grunnleggende morfometriske metoder som brukes til å evaluere aterosklerotisk byrde. Målet med denne protokollen er å beskrive en optimalisert, trinnvis kirurgisk metode for å dissekere, parfyme-fikse, isolere, flekke, bilde og analysere aterosklerotiske lesjoner i museortas med oljerød O. Fordi aterosklerotiske lesjoner kan dannes hvor som helst i hele aortatreet, har hele aorta Oil Red O-fargingsmetoden fordelen av å evaluere lipidbelastede plakk i hele aorta og alle grener i en enkelt mus. I tillegg til oljerød O-farging kan friske isolerte hele aortas brukes til en rekke in vitro- og in vivo-eksperimenter og celleisolasjoner.
Introduction
Koronararteriesykdom, en ledende årsak til dødelighet i USA, er vanligvis forårsaket av aterosklerose, en prosess som fører til oppbygging av plakk inne i arterielle vegger1. Hyperlipidemi-utsatte Apoe- og Ldlr-mangelfulle mus er sentrale for undersøkelser av aterosklerose og dens komplikasjoner og utvikling av terapier2,3,4,5. Kvantifisering av aterosklerotiske lesjoner fra en en face aorta er en viktig endepunktanalyse for å evaluere effekten av genetisk manipulasjon i forskjellige celletyper. Det bidrar også til å studere nye terapier designet for å påvirke aterosklerotisk sykdomsinitiering, progresjon og regresjon. Aterosklerotiske lesjoner kan dannes hvor som helst i aorta og dens grener (dvs. brachiocephalic, karotis og subklavisiske arterier i brystet, samt nyre-, vanlige iliac- og lårarterier under membranen)6. En omfattende evaluering av aterosklerosebyrde og hensiktsmessig terapi krever vurdering av sykdomsbyrde på forskjellige steder, en utfordring som ofte overses.
Denne protokollen beskriver hvordan du utfører en omfattende analyse av aterosklerotiske lesjoner, starter med en uåpnet hel aorta og fortsetter å en ansiktsforberedelse, i en enkelt mus. Uåpnet hel aorta olje rød O farging tillater rask, kvalitativ vurdering av lipid-ladede plakk i hele aorta og dens grener, mens en ansiktsforberedelse gir en kvantitativ vurdering av aterosklerotisk lesjonsfordeling i musen aorta.
Teknikken bruker 8 uker gamle mus med en jevn muskelcellespesifikk TGFβR2-sletting på Apoe-/- hyperlipidemisk bakgrunn (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; heretter referert til som TGFβR2iSMC-Apoe mus) og kull apoe-/- kontroller (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; heretter referert til som Apoe-/- mus). Dyrene holdes i 16 uker på et høyt kolesterol høyt fett diett (HCHFD) som studiematerialer7. Ved studieavslutning blir de uåpnede hele aortaene farget og avbildet (inkludert alle større grener) med Oljerød O for kvalitativ vurdering av lipidbelastede plakk. Aortaene er kuttet åpne via en ansiktsforberedelse, og alle aterosklerotiske lesjoner er avbildet og kvantifisert. Denne protokollen kan brukes til å studere aterosklerotisk lesjonsutvikling i Apoe-/- eller Ldlr-/- hyperlipidemimusmodeller og utvidet til generelle aortarelaterte vaskulære biologiapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mT/mG (lagernr. 007676) og Apoe-/- (lagernr. 002052) mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory. Myh11-CreERT2 mus var en gave fra Stefan Offermanns (tilgjengelig fra Jackson Laboratory som lager nr. 019079). Tgfbr2fl/fl mus ble hentet fra Harold L. Moses (Vanderbilt University). Alle dyreprosedyrer ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Mus
- Produser MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- og MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- mus som tidligere beskrevet7. Rasmutantstammer til C57BL / 6J-bakgrunnen i mer enn ti generasjoner.
MERK: Myh11-CreERT2 Cre muselinje gir et kraftig verktøy for å studere rollen som glatte muskelceller i vaskulær homeostase og vaskulær patologi. Cre-allelen er satt inn i Y-kromosomet; Dermed uttrykker kvinnelige mus ikke denne konstruksjonen.
2. Mus genotyping, tamoxifen induksjon, og høyt kolesterol høyt fett diett fôring
- Utfør musegenotyping ved hjelp av musøre-DNA- og PCR-analyse. Musøre-DNA skal isoleres ved hjelp av dna-isolasjonssettet for blod og vev (Materialfortegnelse) i henhold til produsentens instruksjoner. PCR-primere er oppført i tabell 1.
- Induser Cre-Lox-rekombinasjon ved tamoksifeninjeksjon ved 1 mg/dag i.p. i 5 dager i 6 uker gamle MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- og MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- hannmus.
- Induser aterosklerose ved å plassere 8 uker gamle hannmus (2 uker etter tamoksifenbehandling) på en HCHF-diett (40% kcal fett, 1,25% kolesterol, 0% kolsyre) i 16 uker.
3. Reagenser og disseksjonsverktøy forberedelse
- Lagerolje Rød O løsningsforberedelse: oppløs 1 g oljerød O i 100 ml isopropylalkohol.
- Arbeidsolje Rød O løsningsforberedelse: Bland 24 ml lager OljeRød O-oppløsning med 16 ml dH2O. Filtrer den fortynnede oljerøde O-en med 0,45 μm sterile sprøytefiltre (løsningen er kun god i 1–2 timer).
- 60% isopropylalkoholpreparat: Bland 60 ml isopropylalkohol med 40 ml dH2O.
- 4% formaldehyd i 1x DPBS forberedelse: fortynne 10 ml 16% formaldehyd i 30 ml 1x DPBS.
- Rengjør alle disseksjonsverktøyene med 70 % etanol (figur 1).
4. Eutanasi (Figur 2A)
- Mål musens vekt før eutanasi.
- Euthanize musen ved intraperitoneal injeksjon av ketamin og xylazine (hver milliliter inneholder 10 mg / ml ketamin og 2 mg / ml xylazine).
- Plasser musen i liggende stilling (magesiden med forsiden opp).
5. Åpning av bryst- og bukhule og hjerteperfusjon (figur 2B)
- Forbered en 10 ml sprøyte med 10 ml 1x DPBS. Hette med en 25 G nål. Sprøyten vil bli brukt til å skylle hjertet.
- Hold opp huden med pinsett (stil 5) og kutt med fin saks fra bunnen av magen til toppen av nakken.
- Åpne bukveggen under ribbeina.
- Løft brystbenet med pinsett (stil 5) og kutt membranen, klipp deretter bort ribben for å eksponere thoracic hulrommet.
- Lag et lite snitt i hjertets høyre atrium.
- Perfuse gjennom den apikale venstre ventrikulær punktering ved å sakte injisere 10 ml 1x DPBS. Når det er grundig perfundert, blir leveren og nyrene lysebrune i fargen.
- Rengjør brysthulen av fremmed blod og væske ved å bruke en ikke-vevd svamp for å absorbere materialet.
6. Isolering av aorta og grener (figur 2C)
- Fjern organer (dvs. lunge, lever, milt og gastrointestinale og reproduktive organer) og kutt kragebenet ved hjelp av pinsett (stil 5) og fin saks mens du forlater hjertet, nyrene og aorta intakt in situ.
MERK: Pass på at du ikke snører hjertet eller noen store blodårer. - Plasser musen under et stereomikroskop.
- Disseker aorta- og aortagrener, inkludert brachiocephalic arterie, karotisarteri, subklavisiske arterier, nyrearteri, vanlige iliac arterier og lårarteriarteri ved hjelp av pinsett (stil 4) og vårsaks.
MERK: Dekk aorta med en våt, ikke-vevd svamp for å unngå dehydrering mens du dissekerer aortagrenene. - Disseker og fjern forsiktig adventitial fett og bindevev rundt aorta- og aortagrenene ved hjelp av pinsett (stil 4) og vårsaks.
MERK: Siden betennelse er fremtredende i aneurisme hyperlipidemi musen, er det vanskelig å fjerne adventitia. Vær forsiktig så du ikke eller hakker aorta- og aortagrenene. Dette trinnet krever øvelse og tålmodighet.
7. Fiksering av hjerte og aorta (figur 2D, E)
- Forbered en 10 ml sprøyte med 10 ml 4% formaldehyd i 1x DPBS. Hette med en 25 G nål.
FORSIKTIG: Formaldehyd er farlig. Les MSDS før du arbeider med dette kjemikaliet. Bruk hansker og vernebriller og produser fortynningsløsningene inne i en avtrekkshette.
MERK: 4 % formaldehydløsning forringes over tid. Det er viktig å bruke nylaget 4% formaldehyd for fiksering. - Fest det vaskulære treet gjennom apical venstre ventrikulær punktering ved å sakte injisere 10 ml 4% formaldehyd.
MERK: Formaldehydfiksering forstyrrer flere nedstrømsapplikasjoner, for eksempel cellekultur, FACS-analyse og encellet RNA-sekvenseringsanalyse. Hopp over dette trinnet hvis aorta skal brukes for noen av disse programmene. - Rengjør brysthulen i fremmed væske med en ikke-vevd svamp for å absorbere materialet.
- Skill hjertet fra aorta ved å holde hjertet med pinsett (stil 4) og bruk mikro-dissekerende vårsaks.
MERK: For å utføre en ansiktsolje Rød O-farging etter dette trinnet, anbefales det å kutte aorta åpen in situ i stedet for ex vivo og fortsette til avsnitt 8. Dette gjør det enkelt for en face aorta å ligge flatt. - Isoler og sluk aorta og dens hoved fra 1 mm over halspulsåren til enden av lårarterien ved hjelp av pinsett (stil 4) og vårsaks.
- Overfør fartøyet til en voks Petri-tallerken eller 1,5 ml mikrosenterrør og fyll med 1x DPBS til den dekker aorta.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
8. Oljerød O-farging og avbildning av uåpnet hel aorta (figur 3)
- Fest beholderen på en petriskål med minutienpinner (figur 3A).
- Skyll beholderen én gang med 1x DPBS.
- Hell 25 ml fersk oljerød O-oppløsning i Petri-retten (figur 3B).
MERK: (1) Isopropanol er farlig og en brennbar væske. Bruk riktig personlig verneutstyr. (2) Oljerød O-løsning kan lett utløses. De utfelte partiklene kan forstyrre etterfølgende farging. Det er viktig å fjerne bunnfallet ved å filtrere oljerød O-oppløsningen gjennom et 0,45 μm filter før bruk. (3) Det er best å tilberede fersk oljerød O-oppløsning og kaste ubrukt oppløsning. (4) I tillegg til Oil Red O er Sudan IV en annen kjemisk forbindelse som brukes til farging av lipider, triglyserider og lipoproteiner. Imidlertid har Oil Red O gradvis erstattet Sudan IV fordi den røde fargen produsert av Oil Red O er mer intens og dermed kan gjøre fett mye lettere å se. - Flekk aorta i 60 min ved romtemperatur (RT). Olje Rød O vil flekk lipidrik plakk rød, slik at andre ikke-plakk som inneholder områder blek i fargen.
- Vask en gang i 20 min med 60% isopropanol ved RT.
MERK: Skylling over kan destaine plakket. - Skyll aorta 3x med dH2O i 5 min for å fjerne isopropanol.
- Under et stereomikroskop rengjør forsiktig alt perivasculært fettvev rundt aorta ved hjelp av pinsett (stil 4) og vårsaks (figur 3C, D).
MERK: Det er viktig å rengjøre alt perivasculært fettvev rundt aorta og dens grener etter farging, fordi oljerødt O-farget perivasculært fettvev kan gi falsk bakgrunn og forstyrre plakkmorfometri og plakkområde kvantifisering. Pass på at du ikke fjerner en del av aortaveggen. Fyll voksfatet med dH2O til det dekker den fargede aortaen under rengjøring. Dette trinnet krever øvelse og tålmodighet. - Overfør fartøyet til et rent glassmikroskopsklie.
- Anskaffe digitale mikrografer ved hjelp av et kamera som er koblet til et lysmikroskop. Lagre bilder med høy oppløsning, helst i kodet bildefilformat (TIFF) (figur 3E).
MERK: Protokollen kan settes på pause her. For å forhindre at aorta tørker, overfør fartøyet til et 1,5 ml mikrosenterrør og fyll med 1x DPBS til det dekker aorta. Oppbevars ved 4 °C.
9. En ansikts aorta montering (Figur 4, Figur 5)
- Overfør fartøyet til en voks Petri-tallerken og fyll med 1x DPBS til den dekker aorta.
- Sever karotis, subklave arterier av aorta buen og iliac arterier i abdominal aorta 1-2 mm etter bifurkasjoner. Kutt nyrearteriene. (Figur 4A)
- Skjær langsgående opp aortapreparatet langs den indre krumningen (figur 4B1) og alene iliac arterier (figur 4B2) med mikro-dissekerende vårsaks.
- Klipp opp de tre grenene av aortabuen (dvs. innominere, venstre vanlige karotis, venstre subklave arterie) langs større krumning til grunnnivået av indre krumning (x-mark) (Figur 4B3-B8) med mikro-dissekerende vårsaks.
- Fest aortaen flat (lumen side opp) i en voksfat med minutienpinner og påfør 1x DPBS til den dekker aorta for å forhindre at den tørker (figur 4C).
MERK: (1) Det er viktig å gjøre den opprullede aortaen flat og feste den med ansiktet uten å strekke. Dette trinnet vil ta noen dager, avhengig av alvorlighetsgraden av aterosklerose. (2) For aortas fra Apoe-/- eller Ldlr-/- dyr anbefales det å feste aorta flat i 24 h. (3) Protokollen kan settes på pause her. - Rengjør glassmikroskopet med 70 % etanol og delikate oppgaveviskere (figur 5A).
- Overfør aortaen til et rent glassmikroskopsklie og legg 15 dråper optimal skjæretemperatur (OCT) på en annen ren glassmikroskopsklie (figur 5B).
- Plasser glassmikroskopet forsiktig med OCT-forbindelsen over aorta og unngå å fange luftbobler på lysbildet (figur 5C).
- Merk lysbildene med eksempelnavn (figur 5D).
MERK: De monterte aortasklier kan oppbevares i fuktighetskammeret ved 4 °C i flere måneder.
10. Bildebehandling og lesjons kvantifisering av en ansiktsaorta (figur 6)
- Anskaffe digitale mikrografer ved hjelp av et kamera som er koblet til et lysmikroskop. Lagre bilder med høy oppløsning, helst i tiff-format (tagged image file format) (figur 6A).
- Overfør bilder av en ansikt farget hele aorta til en datamaskin utstyrt med ImageJ programvare.
- I ImageJ velger du verktøyet "Frihåndsvalg" og sirkler rundt all oljerød O-farget plakett manuelt (intense røde flekker) mens du trykker på "Alt" -tasten (for Windows PC) eller "Shift" -tasten (for Mac). Klikk deretter på "Mål" i "Analyser" -menyen for å vise lesjonsområder i resultatvinduet (figur 6B venstre).
MERK: Det er flere fallgruver av kvantifisering av aterosklerotiske lesjoner: (1) små biter av farget adventitialt fett som forblir festet til aorta fra trinn 8.7 kan gi falsk bakgrunn og forstyrre plakk kvantifisering; (2) fjerning av en del av aortaveggen eller skade aorta fra trinn 6.4 og 8.7 kan forstyrre plakk kvantifisering; (3) bobler og folder dannet i aorta etter montering (trinn 9.8) kan forstyrre plakk kvantifisering; og (4) aterosklerotisk plakk er et 3D-fenomen, og målinger utført i et 2D-plan gjenspeiler kanskje ikke plakkets sanne omfang. I tillegg til analyse av aortaplakkområdet, anbefales det å analysere plakkstørrelse i aortaroten, brachiocephalic arterien, stigende aorta og abdominal aorta separat8. - Sett ring rundt den ytre kantlinjen på aortaen og klikk "Mål" i "Analyser" -menyen for å vise aortaområdet i resultatvinduet (figur 6B høyre).
- Eksporter alle mål til en Excel-fil.
- Beregn forholdet mellom plakkareal fra det totale aortaområdet og normaliser verdien som prosentandelen av det totale oljerøde O-overflatearealet.
- Beregn forholdet mellom plakkareal i 8-10 Apoe-/- og 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe mus. Presentere dataene som gjennomsnittlig ± SEM (figur 6C).
- Utfør en uparret student t-test for statistisk analyse av forholdet mellom plakkområdedata sammenlignet med en annen musegruppe. Vurder forskjellene i gjennomsnittsverdier som signifikante ved p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen ble aterosklerotiske lesjoner i TGFβR2iSMC-Apoe mus analysert etter 4 måneder på en HCHF diett7. I tillegg til omfattende aterosklerose utviklet disse musene både thorax og abdominale aortaaneurisme, som tidligere rapportert. Sammenlignet med Apoe-/- mus viste TGFβR2iSMC-Apoe mus aortavegger alvorlig aterosklerose, noe som gjorde det vanskelig å dissekere lesjonene (figur 2C, D,E). I tillegg er aneurisme spesielt omfattende under suprarenal aorta, som minner sterkt om avanserte humane aortaaneurisme.
Et representativt uåpnet aorta oljerødt O-fargebilde fra HCHFD-matet TGFβR2iSMC-Apoe-mus er vist i figur 3E. Bildet viser en TGFβR2iSMC-Apoe mus som utviklet både stigende og abdominal aorta aneurisme, og det viser akselerert aterosklerotisk lesjon dannelse i aorta grener (her, brachiocephalic arterien, karotis arterier, subklave arterier, iliac arterier, lårarteri og nyrearteri).
Figur 6A viser bildet av Apoe-/- og TGFβR2iSMC-Apoe-mus. Sammenlignet med Apoe-/-gruppen viste TGFβR2iSMC-Apoe-mus alvorlig aneurisme og markert forlengelse av hele aorta.
Figur 1: Disseksjonsverktøy som brukes i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvis protokoll for eksisjon av aorta fra mus på HCHF-diett.
Dette er fra en 24-ukers gammel TGFβR2iSMC-Apoe mus matet i 4 måneder på et høyt kolesterol høyt fett (HCHF) diett. (A) Mus under ketamin / xylenbedøvelse. Stiplede linjer angir hvor huden skal kuttes. (B) Disseksjon av musen for å eksponere thorax- og bukhulene. (C) Forsiktig fjerning av indre organer (dvs. lunge, lever, milt og gastrointestinale og reproduktive organer) etterfulgt av eksponering av museaorta under et disseksjonsmikroskop. (D) Forsiktig fjerning av bindevevet langs aorta så rent som mulig. (E) Bilde av den isolerte hele aorta med grener. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Trinnvis protokoll for uåpnet aorta rød O-farging og avbildning.
(A) Pinning av hele aorta med grener på en voks Petri parabolen. (B) Tildekking av aorta med oljerød O fargingsoppløsning. (C) Illustrasjon av hele aorta etter oljerød o farging. (D) Illustrasjon av oljerød O-farget hel aorta etter rengjøring. (E) Representative fotomikrografer av oljerød O-farget hel aorta av TGFβR2iSMC-Apoe mus etter 4 måneder på en HCHF diett. (a') Bilde av høy forstørrelse av stigende aorta fra (a) og (b') bilde av abdominal aorta fra (b). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Trinnvis protokoll for aortaforberedelse.
(A,B) Arterielt tre farget med oljerød O åpnes i lengderetningen for å flate ut aorta for avbildning. Stiplede linjer langs karveggen og tall indikerer sekvensielle kutt som er laget for å åpne fartøyene. (C) Langsgående splittet og festet hele aorta på en voks Petri parabolen i en Y-form. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Trinnvis protokoll for aortamontering.
(A) Skånsom rengjøring av glassmikroskopet glir med 70% etanol og tørking med rene laboratorieservietter. (B) Påføring av OCT-forbindelse på overflaten av ett glassmikroskopsklie, og deretter spredning av en face aorta flat på det andre glassmikroskopet. (C) Skånsom plassering av glassmikroskopet med OCT-forbindelse på toppen av aortaprøven. (D) Merking av lysbildet med eksempelnavnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Trinnvis protokoll for aortaavbildning og aterosklerotisk lesjonskvartifisering.
(A) Mikrofotografer av en ansikt aortas fra Apoe-/- og TGFβR2iSMC-Apoe mus etter 4 måneder på en HCHF diett og farget med Olje Rød O. (B) Bilder som illustrerer prosessen for dataassistert kvantifisering av aterosklerotiske lesjoner. (C) Kvantifisering av lesjonsområde: % lesjonsområde refererer til oljerød O-farget som en % av den totale aortaoverflaten. Alle data vist som gjennomsnittlig ± SEM (***p < 0,001; uparret to-tailed Student t-test; n = 9 for Apoe-/- mus og n = 9 for TGFβR2iSMC-Apoe mus). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| MYH11-CreERT2 | 5'-TGA CCC KATT CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA CAT CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| Apoe | 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3' | ||
Tabell 1: Genotyping primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) og lipoproteinreseptor med lav tetthet (Ldlr) mangelfulle mus er nyttige for å studere utvikling og behandling av aterosklerose. Etterforskere kan evaluere effekten av genetikk og terapeutiske manipulasjoner på ateroskleroserelaterte sykdommer initiering, progresjon og regresjon ved hjelp av Oljerød O farging av hele aorta9. Aorta Oil Red O farging og lesjon kvantifisering er gull standard endepunkt for aterosklerose forskning. Denne teknikken er billig og krever ikke spesialutstyr10. Det er imidlertid ikke lett å oppnå oljerødt O-farget vev av høy kvalitet. Basert på tidligere erfaring er det tre kritiske trinn i denne protokollen, og hele prosedyren krever øvelse og tålmodighet. Det første kritiske trinnet er evnen til å dissekere, fjerne og rengjøre alt perivasculært fettvev rundt aorta og dens grener før og etter oljerød o-farging (figur 2D, figur 3C, D). Det andre viktige trinnet er tilberedning av nylaget og filtrert OljeRød O-løsning. Til slutt er det viktig at en face aorta ligger flatt på en voksfat før montering på glassmikroskopet glir (figur 4C, figur 5B, C).
Sammenlignet med andre oljerøde O-fargingsprotokoller, gir denne metoden kvalitative og kvantitative vurderinger av lipid-ladede plakk i den uåpnede aorta og en ansikt aorta fra en enkelt mus. Den første kvalitative vurderingen av den uåpnede Oil Red O-fargingen gir en generell ide om plakkfordelingen og plakkstørrelsen i aorta, samt alle grenene før kvantifisering av en face aorta. Begrensninger i studien er at (1) 2D-sammenligning og analyse av 3D aterosklerotiske plakk ikke gjenspeiler den sanne omfanget av aterosklerotiske plakkvolumer, (2) aterosklerotisk lesjons kvantifisering er tidkrevende, og (3) det krever dyreoffer.
Etter at aorta er vellykket isolert, kan den brukes til et bredt utvalg av analyser for molekylære studier. For eksempel kan den brukes til biomekaniske studier og histologisk analyse for å karakterisere reginal aorta morfologi11. I tillegg kan brukere isolere endotelceller og glatte muskelceller fra nyisolerte hele aorta for cellekultur, FACS-analyse og enkeltcellet RNA-sekvenseringsanalyse. Oppsummert gir denne protokollen en trinnvis prosedyre for å analysere aterosklerotisk byrde hos mus. Etterforskere kan bruke denne protokollen til å sammenligne aterosklerotisk lesjonsoverflod, plassering og størrelse mellom dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av et Joint Biology Consortium Microgrant levert under NIH grant P30AR070253 (P.-Y.C.) og HL135582 (M.S.). Vi er takknemlige til R. Webber og L. Coon for å opprettholde musene som brukes i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J.
- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
