Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Grafen kabinet af kemisk faste pattedyr celler til flydende fase elektron mikroskopi

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

Præsenteret her er en protokol for mærkning membran proteiner i pattedyr celler og belægning prøven med grafen til flydende fase scanning transmission elektron mikroskopi. Prøvernes stabilitet mod skader forårsaget af stråling kan også undersøges med denne protokol.

Abstract

En protokol er beskrevet for at undersøge den menneskelige epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) i den intakte plasmamembran af brystkræftceller ved hjælp af scanning transmission elektron mikroskopi (STEM). Celler i pattedyr brystkræft celle linje SKBR3 blev dyrket på silicium mikrochips med silicium nitride (SiN) vinduer. Cellerne blev kemisk fastgjort, og HER2 proteiner blev mærket med quantum dot nanopartikler (QDs), ved hjælp af en to-trins biotin-streptavidin bindende protokol. Cellerne blev belagt med flerlags grafen for at opretholde en hydreret tilstand og for at beskytte dem mod elektronstråleskader under STEM. For at undersøge stabiliteten af prøverne under elektronstrålebestråling blev der udført et dosisserieforsøg. Grafenbelagte og ikke-coatede prøver blev sammenlignet. Beam induceret skade, i form af lyse artefakter, dukkede op for nogle ikke-coatede prøver ved øget elektron dosis D, mens ingen artefakter dukkede op på belagte prøver.

Introduction

Analyse af membranproteinfunktion er afgørende for cellebiologisk forskning og for udvikling af lægemidler. En klasse af vigtige eksperimenter indebærer undersøgelse af membran protein positioner i celler. Disse oplysninger kan bruges til at udlede konklusioner om samling af proteiner i proteinkomplekser og deres specifikke placeringer i plasmamembranen, som via dynamisk samling og demontering driver en bred vifte af cellulære funktioner. Blandt andre teknikker anvendes lysmikroskopi (LM) og elektronmikroskopi (EM) til at studere proteinfunktioner i celler. LM tillader analyse af hele celler i væske; opløsningen er dog begrænset til 200-300 nm for konventionel og op til 20 nm for superopløsningsfluorescensmikroskopi under praktiskeforhold 1,2. EM giver omkring 1 Å resolution3, men konventionelle prøve forberedelse kræver dehydrering, metal farvning for at forbedre billedkontrast, og indlejring i et monteringsstof, såsom harpiks, for transmission elektron mikroskopi (TEM)4. For at bevare biologiske prøver i et mere native-lignende miljø, kryo-EM teknikker kan bruges5,6. Prøverne fryses hurtigt til amorf is og sektionsbesnit, hvis det er nødvendigt. En anden mulighed er fryse-frakturering EM7.

EM teknikker til at studere membran proteiner i intakte celler i deres oprindelige, flydende tilstand er opstået i det seneste årti8,9,10,11. En rumlig opløsning på 2 nm blev opnået på kvanteprins (QD) mærkede membranproteiner i hele celler dyrket på en SiN-membran og omgivet af et lag grafen9.

Her er detaljer om en protokol for protein mærkning og grafen belægning9,12 beskrevet. Målet med denne protokol er at analysere den rumlige fordeling af HER2 i membranen af hele faste celler, samtidig med at cellerne bevares i hydreret tilstand. Belægning med grafen forhindrer tørring af cellerne i vakuum, og reducerer også strålingsskader13. Denne metode giver oplysninger om mærkede membranproteiner i den intakte plasmamembran, men metoden er ikke nyttig til at studere den cellulære ultrastruktur, som det normalt gøres med EM.

Graphene er den tyndeste nanomateriale kendt, og består af en enkelt kulstof atom tyk krystallinsk ark arrangeret i en honeycomb gitter14. Det har unikke egenskaber, herunder høj fleksibilitet og mekanisk styrke. Nyere forskning har vist, at defekt grafen er uigennemtrængelig for gasser og væsker, men defekter tillader brintpermeation15. Denne lækage kan reduceres ved hjælp af multilag graphene som anvendes her. Tolagsgrafen har for nylig vist sig at være nyttig som en støtte til kryo-EM-prøver, hvilket forbedrer homogeniteten af det tynde islag sammenlignet med grafenoxid, hvor der kun kan dannes uuniformlag16. Grafen viste sig også at reducere stråleskader af biologiske prøver under væskefasetransmission elektronmikroskopi13,17. Som et eksemplarisk eksperiment blev HER2 udtrykt i pattedyrs brystkræftcellelinje SKBR3 mærket med QDs18 og dens rumlige fordeling registreret ved hjælp af STEM. Celler blev seedet på en Si mikrochip med en elektron gennemsigtig SiNmembran 19. Mikrochipperne blev valgt som en støtte, da de er robuste, kompatible med LM og EM, og hele mærkningsproceduren kan udføres direkte på mikrochip19. Efter vedhæftet celle blev HER2 mærket med en totrinsmærkningsprotokol20. For det første blev en biotinyleret anti-HER2 antistofmetisk forbindelse21 knyttet til HER2. Cellerne blev derefter kemisk fastgjort for at forhindre etiket-induceret receptor klyngedannelse, og for at øge stabiliteten af den cellulære ultrastruktur. Streptavidin-belagte QD'er blev efterfølgende knyttet til HER2-antistof mimetiske kompleks. Det lyse fluorescenssignal og den elektrontætte kerne af QD'erne tillod korrelativ fluorescens- og elektronmikroskopi (CLEM)20. CLEM er især nyttigt, fordi cellulære områder af interesse for STEM analyse kan vælges fra oversigten fluorescens mikroskopi billeder fremhæve lokalisering af HER2 på cellerne. Celler blev analyseret ved fluorescensmikroskopi for at identificere cellulære områder med høje HER2-niveauer. Derefter blev et 3-5 lag tykt ark grafen overført til cellerne til belægning9,22. Efterfølgende blev prøven monteret i en EM-prøveholder. STEM-data blev anskaffet ved hjælp af den ringformede mørke feltdetektor (ADF), der giver oplysninger om den rumlige fordeling af HER2 på celleoverfladen i forhold til celleoverfladens placering, men giver ingen oplysninger om cellens ultrastruktur. For at bestemme prøvens stabilitet under bestråling af elektronstråle blev prøverne undersøgt ved stigende dosis (D) i en billedserie. Forskellen mellem grafenbelagte og ikke-coatede prøver blev undersøgt. Flere former for strålingsskader blev evalueret.

Den protokol, der er beskrevet her, bruger HER2 overudseende pattedyr brystkræft celle linje SKBR3 som en model system til målretning HER223. Protokollen omfatter fremstilling af en grafenbelagt prøve og en lignende prøve, men uden grafenbelægning til sammenligning. Forsøget er udarbejdet i to eksemplarer, da SiN vinduet kan bryde en gang hvert stykke tid, og for at opnå en eksperimentel dublet i de fleste tilfælde. Det samlede udbytte af metoden er højt, hvilket betyder, at mikrochips med graphene-dækkede celler normalt opnås med en usædvanlig fejl, selv om ikke hele SiN-vinduet kan være dækket med grafen i alle tilfælde. Dubletter er ikke beskrevet i protokollen.

Mærkningsprotokollen (trin 1-5) kan sammenlignes med protokollen for mærkning af den epidermale vækstfaktorreceptor i COS7 fibroblastceller, der tidligere eroffentliggjort 24; der henvises til nærmere oplysninger i dette papir om håndtering af mikrochips og brugen af brøndpladerne. Følgende protokol er optimeret til mærkning HER2, grafen belægning9,og undersøge stråling tolerance af prøven.

Protocol

1. Rengøring af mikrochips og belægning med poly-L-lysin (PLL) og fibronectin-lignende protein (FLP)

  1. Placer to mikrochips med en SiN membran (2,0 x 2,6 mm) i 50 ml acetone. Håndter mikrochipsene omhyggeligt med den flade side opad. Undgå at bryde kanterne ved hjælp af fladnæbt pincet. Undgå at berøre mikrochipsens øverste overflade ved håndtering med pincet for at forhindre brud på SiN-vinduet.
    BEMÆRK: Man kan også bruge polytetrafluorethylen belagt eller carbon tip pincet for at forhindre skader på mikrochips.
  2. Vask spånerne i 2 min. ved forsigtigt at ryste bægeret, så mikrochipsene ikke væltes.
  3. Mikrochipsene overføres til 50 ml ethanol og vaskes i 2 min. ved forsigtigt at ryste bægerglasset. Sørg for, at overførslen er hurtig, så den overskydende acetone ikke tørrer ind.
  4. Vask mikrochipsene med 50 ml vand i 10 min.
  5. Dyp mikrochipsene i et frisklavet bægerglas på 20 ml ethanol.
  6. Placer mikrochips på et renrumsvæv til tørring.
  7. Plasma rengør mikrochipsene med 11,5 sccm O2 og 35 sccm Ar ved 70 mTorr og radiofrekvens (RF)-mål på 50 W i 5 min.
  8. Placer mikrochips i en laminar flow hætte til steril celle arbejde.
  9. Forbered en opløsning på 0,01% PLL i vand. Der klargøres en opløsning på 15 μg/ml FLP i fosfatbufferet saltvand (PBS).
  10. Forbered en 24 brøndplade under laminar flowhætten, og fyld 5 brønde individuelt med 1 ml af løsningerne i følgende rækkefølge: godt 1 – PLL; godt 2 – vand; godt 3 – vand; godt 4 – FLP; godt 5 - PBS og godt 6 - PBS.
    BEMÆRK: Udbet vasketrin ved at dyppe en mikrochip i den angivne 24 eller 96 brønd i et par sekunder ved hjælp af en pincet. Udfør inkubationstrin ved at inkubere mikrochipsene i 24 eller 96 brønden i den angivne opløsning for angivet tid og temperatur. Overfør mikrochipsene til en anden brønd inden for få sekunder.
  11. Mikrochips i PLL-opløsningen inskuberes i 5 min. Vask derefter mikrochipsene i vand to gange.
  12. Inkuber mikrochipsene i FLP i 5 min. Vask derefter mikrochipsene i PBS to gange.
  13. Begge mikrochips overføres til brønde (en for hver mikrochip) af en ny 96 brøndplade fyldt med 50 μL serumfrit medium til cellesåning.
  14. Mikrochipsene skal kues ved 37 °C og 5 % CO2, indtil cellesuspensionen er forberedt.

2. Såning celler på SiN membran mikrochips

  1. Opsæt alle forsyninger og udstyr i en laminar flow hætte for at sikre sterilt arbejde.
  2. Vask brystkræftcellelinjen, SKBR3, i en cellekulturkolbe med vækstmedium én gang. Brug Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM), der indeholder 10% føtal kalveserum (FCS), og 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEA'er) som vækstmedium.
  3. Cellerne inkuberes med 1 ml af celleløsningen, indtil cellerne løsnes fra kolben.
  4. Der tilsættes 5 ml vækstmedium til de fritliggende celler i kolben. Denne suspension overføres til et centrifugerør.
  5. Pipette 20 μL af cellesuspensionen til et hæmocytometer for at opnå cellekoncentrationen. Brug følgende formel.
    Equation 1.
  6. Forbered en dispergeret cellesuspension på 2,5 x 105 celler/ml. Den nødvendige mængde af den forberedte cellesuspension beregnes ved at:
    Equation 2
    og fyld op med vækstmedium til den ønskede volumen.
  7. Der tilsættes 100 μL af cellesuspensionen til de to brønde i en 96 brøndplade, der indeholder PLL- og FLP-belagte mikrochips med SiN-membranen opad, og 50 μL serumfrit medium, så hver brønd indeholder 25.000 celler.
  8. Pladen inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 5 min. for at vente på, at cellerne fastgøres til mikrochippen.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt kan cellerne løsne sig fra mikrochippen, fordi de endnu ikke har overholdt den.
  9. Kontroller tætheden af cellerne på mikrochippen med et omvendt mikroskop. Sørg for, at cellerne dækker vinduet med tilstrækkelig plads til at flade ud og overholde (se figur 1A).
    BEMÆRK: Der kan tilføjes flere celler på dette tidspunkt, hvis det er nødvendigt.
  10. Mikrochipsene overføres til nye brønde, der indeholder 200 μL vækstmedium, og inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 natten over.
  11. Om eftermiddagen næste dag overføres begge mikrochips til serumfrit medium (serumsultmedium), hvis cellerne er fladet ud og klæbet til et visuelt inspiceret sammenløb (dvs. den del af vinduesområdet, der er dækket af celler) på ca. 2/3 (se figur 1B). Skift til serumfrit medium efter behov for at bringe cellerne i en defineret starttilstand efter behov til sammenligning mellem forskellige eksperimenter25.
  12. Inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 natten over.
    BEMÆRK: Vær opmærksom på, at cellemængderne kan variere alt efter vækstrater og cellemorfologi for andre cellelinjer.

3. HER2 mærkning og fiksering

  1. Forbered løsningerne som beskrevet i supplerende tabel 1.
    1. Arbejd under laminar flow-hætten for at sikre sterilt arbejde. Brug en 96 brøndplade benævnt mærkningsplade I, og fyld 6 brønde pr. mikrochip med 200 μL af mærkningsplade I-opløsningerne: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, antistofmetisk, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Brug en række (et bogstav pr. række, f.eks. A1 til A6) af brøndpladen pr. mikrochip. Mærkepladen opvarmes til 37 °C.
    2. Under en røghætte skal der klargøres en 24 brøndplade kaldet fikseringsplade, og der fyldes 8 brønde pr. mikrochip med 500 μL af fikseringspladeopløsningerne: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS/glycin, PBS/BSA.
      FORSIGTIG: CB er akut giftig ved indånding eller oral indtagelse og er farlig for vandet. Arbejd under røghætten med passende beskyttelse, og bortskaf CB i henhold til sikkerhedsdatabladet (SDS). FA er ætsende og skadeligt for hud og sundhed. Arbejd under røghætten, og se SDS for at få oplysninger om håndtering og bortskaffelse.
    3. Der tilberedes en 96 brøndplade benævnt mærkningsplade II, og der fyldes 4 brønde pr. mikrochip med 200 μL af mærkningsplade II-opløsningerne: QDs, PBS/BSA, PBS/BSA.
      BEMÆRK: Her bruges en 24 brøndplade til bedre at se mikrochipsene i brøndene. Hvis du vil bruge mindre antistofmetisk (trin 3.2) og QDs (trin 3.4), skal du bruge 96 brøndplader til disse trin.
  2. Mærr her2 i cellerne.
    1. Når disse plader er klar, skal du begynde at mærke ved at placere mikrochipsene i brøndene i den første række af mærkningsplade 1.
    2. Mikrochipsene vaskes med PBS/BSA i den 96-brøndplade, der er mærket som mærkningsplade I.
    3. Der blokeres for uspecifike steder for at forhindre uspecifik binding af antistoffets mimetika ved inkubering med PBS/BSA/GS i 5 min. ved 37 °C og 5 % CO2.
    4. Inkuberes med 200 nM antistofmetisk i 10 min. ved 37 °C og 5% CO2.
    5. Vask mikrochip tre gange i PBS/BSA.
  3. Ret cellerne.
    1. Overfør mikrochipperne til 24 brøndfikseringspladen i røghætten.
      BEMÆRK: Der er ikke behov for sterilt arbejde herfra.
    2. Vask én gang med CB i et par sekunder.
    3. Fix celler med 3% FA i 10 min.
    4. Vask én gang med CB og tre gange med PBS.
    5. Bloker frie aldehydgrupper af FA ved inkubering med PBS-glycin i 2 min.
    6. Vask mikrochips med PBS-BSA én gang.
  4. Fastgør QD'erne.
    1. Flyt mikrochipsene til 96 brøndmærkningsplade II.
    2. Inkubere med 20 nM QD'er i 12 min.
    3. Mikrochipsene vaskes med PBS/BSA to gange.
    4. Opbevar mikrochipperne i en brønd, der indeholder PBS/BSA.

4. Lys mikroskopi af de faste celler

  1. Forbered en 3,5 cm diameter glas bund skål med 2 ml PBS / BSA opløsning.
  2. Tag de første mikrochips, placer den på hovedet (celler vender nedad) i glasbundskålen og placer skålen i fluorescensmikroskopet. Sænk mikrochippen langsomt ned i væsken for at undgå skader på cellerne.
  3. Ansk af differenskontrast (DIC) og fluorescensbilleder af hver mikrochip med et 40x mål og den relevante fluorescenskanal.
    BEMÆRK: Her anvendes en excitation bølgelængde på 540-580 nm og en udsender bølgelængde på 607-683 nm til at detektere QD655.
  4. Gentag proceduren for den anden mikrochip.

5. Efter fikseringen

  1. Udfør alle trin under røghætten.
  2. Fyld 6 brønde pr. mikrochip af en 96 brøndplade med 200 μL af postfikseringsopløsningerne:
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    FORSIGTIG: GA er farligt for vand, skadeligt for hud, åndedrætsorganerne og øjnene. Arbejd under røghætten, og se SDS for at få oplysninger om håndtering og bortskaffelse.
  3. Placer begge mikrochips i deres respektive brønde med cellerne opad.
  4. Vask én gang med CB.
  5. Fix celler med 2% GA i 10 min.
  6. Vask én gang med CB.
  7. Vask tre gange med PBS/BSA.
    BEMÆRK: Det første fikseringstrin med FA løser allerede den biologiske struktur, men der kan stadig forekomme et reduceret niveau af membranproteinspfusion, hvilket muligvis kan føre til etiketinduceret klyngedannelse på grund af tilstedeværelsen af flere streptavidiner pr. QD. Hold derfor tidspunktet for de eksperimentelle trin fra FA-fiksering til GA så kort som muligt for at minimere spredningen af proteinerne i membranen.
  8. Opbevares i PBS/BSA for at forhindre osmotiske stød og 0,02% natriumazid (NaN3)for at forhindre bakterievækst ved 4 °C, indtil grafenbelægningen i en ny brøndplade. Seal godt plade med paraffin film for at forhindre tørring. Mikrochips og celler er stabile i op til 2 uger, når de opbevares ved 4 °C.
    FORSIGTIG: NaN3 er farligt for vand og akut giftigt ved oral indtagelse, for hud og åndedrætsorganerne. Arbejd under røghætten, og se SDS for at få oplysninger om håndtering og bortskaffelse.

6. Rengøring og overførsel af grafen til saltkrystaller

  1. Poly(methyl methacrylat) (PMMA)-grafen fjernes fra PMMA-grafen-on-polymer (Figur 2A).
    1. Pipette et par dråber vand på polymeren omkring PMMA-grafen.
      BEMÆRK: Sørg for, at PMMA-grafen nemt kommer ud af den understøttende polymer, da den flyder på vandoverfladen.
    2. Nedsænk PMMA-grafen-on-polymer i vand med en vinkel på 30-45° for at frigive PMMA-grafen.
      BEMÆRK: Polymeren må kun være let betæt. Pipettering for meget vand på polymeren vil løfte op og muligvis folde PMMA-grafen.
  2. Ætse kobberbaserede forurenende stoffer ved hjælp af en natriumpersulfatopløsning (figur 2B).
    BEMÆRK: Kommerciel grafen dyrket på kobberfolie indeholder ofte kobberrester under mikrometeret, som kan fjernes med en kobberetchantopløsning22.
    1. Der klargøres en 50 ml opløsning på 0,42 M natriumpersulfat i vand.
    2. Overfør PMMA-grafen til natriumpersulfatopløsningen med grafensiden nedad ved hjælp af et standardglasslid. PMMA-graphene vil flyde oven på løsningen.
    3. Lad PMMA-grafen blive i natriumperulfatopløsningen natten over.
    4. Fjern PMMA-grafen fra natriumperulfatopløsningen, og placer den oven på rent vand ved hjælp af et glasrutsjebane. Lad det flyde på vandet i en halv time.
    5. Gentag det foregående trin i alt tre gange for at fjerne alle natriumpersulfatrester fra PMMA-grafen.
  3. PMMA-grafen overføres til en natriumchloridstallert (NaCl).
    1. Forbered en mættet opløsning af NaCl i vand i en petriskål.
    2. Overfør PMMA-grafen oven på NaCl-opløsningen med grafensiden nedad med et glasdias.
    3. Hold en NaCl krystal med pincet og afhente den flydende PMMA-graphene.
      BEMÆRK: Størrelsen af NaCl krystal bør være lidt større end størrelsen af PMMA-grafen for at undgå at folde fremspringende grafen på kanten af saltet eller komme i kontakt med grafen med pincet. I disse eksperimenter anvendes NaCl-krystal på 12 mm x 12 mm x 0,5 mm til opplukning af et 10 mm x 10 mm grafenark og understøtter det bagefter.
    4. Hold PMMA-graphene-on-salt lodret i 2 min for at lade overskydende vand flyde ud.
    5. Lad PMMA-grafen-on-salt tørre ved stuetemperatur i 30 minutter og bag det i en ovn ved 100 °C i 20 min for helt at fjerne vand.
  4. Fjern PMMA ved hjælp af en acetonevask( Figur 2C).
    1. Forvarm acetone i et glas petriskål til ~ 50 °C på en kogeplade i røghætten. Hold temperaturen nøje øje med for at undgå brand.
    2. Nedsænk PMMA-grafen-on-salt i petriskålen fyldt med acetone og lad det opløse PMMA i 30 min.
    3. Gentag det foregående trin i alt tre gange med ny, ren acetone.
    4. Lad grafen-on-salt lufttørre grundigt, før du bruger det til prøve forberedelse.

7. Grafen Belægning

BEMÆRK: Grafenbelægningsproceduren er skematisk vist i figur 3A.

  1. En mikrochip, der er fremstillet med faste celler, vaskes med faste celler og mærkes HER2 i rent vand for at fjerne eventuelle rester af salt fra bufferen. Anlæg mikrochippen på et filterpapir. Cellerne er synlige som mørke pletter (Figur 3B).
  2. Skær flerlagsgrafen på NaCl krystal i et stykke, der passer til SiN vinduet i en mikrochip ved hjælp af et barberblad.
  3. Forbered et bæger af rent vand og fjern grafen fra NaCl krystal ved at vippe krystal omkring 45 ° vinkel med hensyn til vandoverfladen og røre ved vandet. Grafen vil flyde på vandoverfladen (Figur 3C).
  4. Fang grafen med en metalløkke fra vandoverfladen. Grafen vil flyde inden for dråben under løkken (Figur 3D).
  5. Tryk på mikrochippens øverste overflade med den nederste sløjfeoverflade. Mikrochippen vil holde sig til metalløkken. Grafen kan ses oven på mikrochippen (Figur 3E).
  6. Under et stereomikroskop skal du bruge filterpapir til at fjerne det resterende vand fra mikrochippen, så grafen dækker alle celler på SiN-vinduet.
    BEMÆRK: Grafen vil bevæge sig, når den slettes. Sørg for, at grafen forbliver på toppen af vinduet ved at røre mikrochippen lige med kanten af filterpapiret.
  7. Brug en pincet til at fjerne mikrochippen fra metalløkken og læg den på et filterpapir. Grafen er synlig som en lilla glitre på mikrochippen (Figur 3F).
  8. Overfør mikrochippen fra papiret til et rum Petriskål.
  9. Pipette en dråbe vand i en af de frie rum og lukke låget for at give en vand-mættet atmosfære.
  10. Rumskålen forsegles med paraffinfilm, og opbevares i køleskabet ved 4 °C, hvis det er nødvendigt for yderligere målinger.

8.

  1. Fremstil STEM ved 200 kV-stråleenergi ved hjælp af en justerings-/prøveprøve for en sondestørrelse på mindst 0,2 nm ved justering af kondensatorglassene, en sondestrøm I = 180 pA (oplysninger om sondestrømen for forskellige mikroskopindstillinger leveres af fabrikanten inden for 5% nøjagtighed) og en strålekonvergenshalingsvinkel på 13,2 mrad ved at indsætte en blænde. Indstil ADF STEM-detektorens åbning af halvvinkelområdet (indvendigt og udvendigt) til 68-280 mrad ved at justere indstillingerne for projektorlinsen. Indstil STEM-billedstørrelsen til 2048 x 2048 pixel, og pixel dvæler tid t = 6 μs.
  2. Mikrochippen indbelæses med grafenbelagte celler i en standardprøveholder til TEM på en sådan måde, at cellerne vender opad.
  3. Læg holderen i elektronmikroskopet.
  4. Få et oversigtsbillede ved forstørrelse (M) = 800x (Figur 4) ved hjælp af indstillingerne i trin 8.1.
  5. Identificer et område af interesse i en celle.
  6. Afbilde QD'erne med en ADF-detektor ved M = 80.000x ved en pixelstørrelse d = 1,3 nm ( Figur 4 ) ved hjælp afindstillingernei trin 8.1.
  7. Ansk af området efter eksponering med en lavere forstørrelse (her, M = 50.000x) for at vise det eksponerede område (Figur 4).
  8. Beregn elektrondosis
    Equation 3
    hvor e er den elementære afgift. Med de indstillinger, der er angivet i ovenstående,
    Equation 4
    og en fejl på 5%.
  9. Der skal anskaffes 20 billeder til en dosisserie med de samme indstillinger, men med t = 60 μs, hvilket resulterer i en akkumuleret dosis
    Equation 20.
  10. Hvis du vil bekræfte tilstedeværelsen af grafen, skal du skifte mikroskopet til TEM ved M = 1.200x, vælge et område i nærheden af en celle og skifte til diffraktionstilstand. Optag et diffraktionsmønster ved en eksponeringstid på 0,5 s, 2048 x 2048 x 3 pixel og en valgt områdeåbning på 50 μm (Figur 4).
  11. Ved afslutningen af sessionen fjernes prøven fra mikroskopet, mikrochippen anbringes tilbage i rumskålen, skålen forsegles med paraffinfilm, og den opbevares i køleskabet ved 4 °C, hvis det er nødvendigt for yderligere målinger.
  12. Vælg den anden mikrochip fremstillet på samme måde som den første mikrochip, men uden grafenbelægning.
  13. Gentag trin 8.2-8.11, men nu for denne prøve. Optag et diffraktionsmønster med de samme indstillinger som i ovenstående som sammenligning (Figur 4).

9. Analyse

BEMÆRK: For automatiseret registrering af QD positioner i en STEM billede, analysen bruger et plugin af lokale design for ImageJ (NIH), som beskrevetandetsteds 20. Plugin er tilgængelig efter anmodning.

  1. Softwaren anvender automatisk følgende trin til at registrere partikler i et STEM-billede:
    1. Anvend et gaussisk filter for at reducere pixelstøj.
    2. Påfør et Fast Fourier Transform (FFT) bandpass filter for kun at opnå nanopartikler.
    3. Angiv en grænse for at få billedet til at blive ændret på en binærer.
    4. Brug en partikeldiameter på 10 nm med en tolerancefaktor på 2 til partikeldetektion.
    5. Detekter partikelpositioner.
  2. Mål afstanden fra center til center mellem ti par QD'er pr. serie. Her blev der målt 10 distancer med varierende størrelse pr. serie.
  3. Den relative ændring i partikelafstand beregnes ved at sammenligne hver partikelafstand med afstanden i det første billede ved hjælp af:
    Equation 5.

Representative Results

Figur 1A viser celler, der er seedet på en sådan måde, at vinduet er dækket, men med tilstrækkelig plads til, at de kan flade ud og holde sig til, hvilket fører til sammenløb på ca. 2/3rd (Figur 1B). Hvis der er for mange celler, der er seedet på en mikrochip (Figur 1C), er der ikke tilstrækkelig plads til, at alle celler kan holde sig til mikrochippen. Figur 1D viser den samme mikrochip efter 24 timer. Mere end halvdelen af cellerne ikke flade. På den anden side, hvis for få celler er seedet (Figur 1E), vil SiN vinduet ende med en stor tom plads efter 24 timer som det ses i figur 1F. Figur 1G viser DIC-billedet af cellerne i figur 1A og Figur 1B. Figur 1H viser det tilsvarende fluorescensbillede falsk farvet med gult, hvilket indikerer vellykket mærkning af HER2.

Repræsentative STEM-data vises i figur 4. Grafenbelagte (venstre kolonne) og ikke-belagte (højre kolonne) SKBR3 celler blev undersøgt. Figur 4A,B viser M = 800x oversigtsbilleder af cellerne i vinduet. De områder, der blev vist som indlæg, blev afbildet ved M = 80.000x i dosisserien, se Figur 4C,D. QD'erne er synlige som lyse pletter her. Figur 4E og Figur 4F viser M = 50.000 x forstørrede billeder erhvervet på rektanglets placering i figur 4C,D. Begge billeder blev optaget efter erhvervelsen af en dosisserie med D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Dosisserien blev optaget på M = 80.000x. De udsatte områder kan genkendes som rektangler, hvor rektanglet var klart synligt for den ikke-belagte prøve (Figur 4F).

For at kontrollere tilstedeværelsen af grafen blev diffraktionsmønstre i områder uden celler, men med eller uden grafen på SiN-vinduet, anskaffet. Grafenens sekskantede struktur blev observeret i diffraktionsmønsteret for den grafenbelagte prøve (Figur 4G), mens den ikke var til stede for den ikke-belagte prøve (figur 4H). Den diffraktion mønster af enkelt krystal graphene vil have seks gange symmetri på grund af højt bestilt sekskantede struktur graphene. Så den sekskantede struktur angiver tilstedeværelsen af grafen på prøverne.

For at undersøge effekten af elektronstrålebelysning på prøven blev STEM-billeder anskaffet i en billedserie med en akkumulerende elektrondosis. Repræsentative resultater for ikke-belagte og grafenbelagte prøver er vist i henholdsvis figur 5A-D og Figur 5E-G. Alle data blev erhvervet på kanten af cellen, hvor cellen er den fladeste, og den observerede struktur er således tættest på SiN membranen. Eksponering af en ikke-belagt prøver førte til lyse strukturer, der vises på cellefladerne ved D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (Figur 5B). Disse strukturer blev større med højere doser, så de var tydeligt synlige i det sidste billede af serien ved D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Figur 5C,D). Disse pletter var ikke opført på nogen af de grafenbelagte prøver (Figur 5E-G).

Yderligere mikrochips blev forberedt og undersøgt ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i ovenstående. Seks belagte og syv ikke-coatede prøver blev undersøgt i alt. To ud af syv ikke-belagte prøver viste disse artefakter. Ingen af de coatede prøver viste yderligere lyspunkter.

Som et andet mål for strålingsskader blev afstanden mellem QD'er undersøgt. Hvis der skulle opstå strukturelle skader, ville man forvente, at afstandene mellem QD'er ville ændre sig. Ændringer i afstande blev målt for forskellige par QD'er med akkumulerende D for en række par afstande. Figur 5H viser, at den relative ændring af partiklerne for ikke-coatede prøver i gennemsnit forblev under 1,3 %, mens den gennemsnitlige relative afstand forblev under 0,8 % for de coatede prøver. Man kan derfor konkludere, at grafenbelægningen stabiliserede prøven, men de indtørrede prøver uden grafenbelægning var også bemærkelsesværdigt stabil.

Figure 1
Figur 1: Cellesåning på et SiN-vindue i en siliciummikrochip og HER2 mærket. a)Eksemplarisk billede af et SiN-vinduesområde med SKBR3-celler 5 minutter efter såning på mikrochippen. bB) De samme celler spredes på samme SiN-vindue efter 24 h. (C) SKBR3-celler på en Si-mikrochip 5 min efter såning. d) Samme celler som i litra C) efter 24 timer. Celler ikke flade ordentligt, da der var for mange celler på chips ved såning. (E) Celler på en mikrochip 5 min efter såning. (F) Kun få celler var synlige på vinduet, fordi for få celler var seedet på mikrochippen. gG) DIC-billede af de samme SKBR3-celler efter QD-mærkning af HER2. (H) Overlejringsbillede af DIC og tilsvarende fluorescensbillede af mærket SKBR3-celler med HER2-QD655 (falsk farvet i gul). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Rengøring og overførsel af grafen til NaCl krystaller. (A) PMMA-graphene-on-polymer er nedsænket i rent vand for at frigive PMMA grafen. PMMA-grafen kan fanges med et glasdias. BB) Kobberbaserede kontamineringer blev ætset ved hjælp af natriumpersulfatopløsning. For at rense grafen blev den overført til et bægerglas indeholdende deioniseret vand. Disse trin blev gentaget 3 gange. PMMA-grafen blev derefter overført til mættet opløsning af NaCl i rent vand. En NaCl krystal blev brugt til at afhente grafen fra saltopløsningen. (C) PMMA-grafen på NaCl krystal blev tørret ud i 30 min ved stuetemperatur. PMMA blev fjernet ved at inkubere blokken i acetone i 30 min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Grafenbelægning af celler, der er seedet på en Si-mikrochip. aA) Procedure for grafenbelægning. Graphene på NaCl krystal frigives på vandoverfladen. Grafenstykket fanges derefter med en metalløkke og overføres til Si-mikrochippen. B) Mikrochip (2,0 x 2,6 mm) med et SiN-vindue med dimensioner 400 x 160 μm uden grafen. SKBR3 celler var synlige som mørke pletter. cC) Grafen (rød cirkel), der flyder på overfladen af et bægerglas fyldt med vand. dD) Graphene fanget med en metalløkke. (E) Mikrochippen fastgjort til vanddråber, så grafen var på toppen af SiN vinduet. (F) Mikrochip efter grafen belægning. Grafen var synlig som en lilla glitre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: STEM af grafenbelagte og ikke-belagte SKBR3-celler på SiN-vinduet. a) STEM-billede af en grafenbelagt prøve, der er anskaffet ved et M = 800x.(B) STEM-billede af en ikke-belagt prøve, der er anskaffet ved M = 800x. (C) M = 80.000x-billede optaget ved placeringen af det blå rektangel i A. Gule linjer repræsenterer eksempler på afstande målt inden for partikel. dD) M = 80.000x billede optaget på placeringen af det blå rektangel i B. Gul linje repræsenterer eksempler afstande målt i partikler. (E) M = 50.000x billede af samme region som C udsat for D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. (F) M = 50.000x billede af samme region som D og eksponeret for D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. Det udsatte område blev tydeligt set. gG) Diffraktionsmønster for en grafenbelagt prøve fra et område uden celler. Grafens seksfoldige symmetri er synlig som lyse pletter. (H) Diffraktion mønster af en prøve uden graphene viser ingen 6-fold lyse pletter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Artefakter, der opstår på prøver uden grafenbelægning. (A) Første billeder af områder på prøver uden grafenbelægning erhvervet ved M = 80.000x og eksponeret for D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) Billeder med de første artefakter, der opstår ved D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (gule pile). c,d) Sidste billede af serien erhvervet med D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Artefakter var synlige som lyse pletter. (E-G) Graphene belagt prøver uden at opstå artefakter. (E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. HH) Relativ ændring i partikelafstande for grafenbelagte og ikke-coatede prøver. To af de ikke-coatede prøver, der viser artefakter, hvoraf den ene er vist i (A-C), og det sidste billede af den anden prøve i D, samt tre coatede prøver blev analyseret (den ene er vist i E-G). I alt blev der undersøgt ti QD-par pr. prøve med afstande på mellem 250 nm og 3 μm. Den relative ændring afspejler gennemsnittet af alle målinger i én gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: Opskrifter på løsninger og buffere. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

For bedre at forstå proteinfunktionen er det vigtigt at indhente oplysninger om proteinplaceringer i plasmamembranen i intakte celler. Metoder til opnåelse af disse oplysninger omfatter fluorescensmikroskopi i superopløsning1,2. Selv om super-opløsning mikroskopi har videreudviklet i løbet af de seneste år, dens opløsning er stadig begrænset til omkring 20 nm for praktiske forhold af celleforsøg, mens typiske receptor proteiner har størrelser i intervallet 1-10 nm. Billeddannelse af proteiner på enkeltcelle- og enkeltmolekyleniveau med tilstrækkelig opløsning til at visualisere proteiner er mulig med EM. Men på grund af sektion, konventionelle EM metoder typisk ikke forlade cellen intakt26, hvilket fører til tab af vigtige oplysninger om konteksten og den rumlige fordeling af proteiner i plasmamembranen. Der er udviklet metoder til hele celler med kryo-TEM6, og det er muligt at kombinere proteinmærkning med kryo-EM27, også kryo-STEM er påvist28. Men cryo-EM arbejdsgange er optimeret til at studere den cellulære ultrastruktur og proteinstruktur, og ikke så meget til at analysere membran protein rumlige distributioner. Kritisk punkt tørring er en anden hel celle forberedelse metode, men prøverne er udsat for flere tørretrin, og teknikken er meget tidskrævende29. Membranproteiner er også blevet undersøgt via frysefraktur7. I denne metode er celler faste, frosne og brækkede. De frakturerede dele replikeres med kulstof- og platinlag, og den biologiske prøve fjernes. Replikaerne kan derefter analyseres med EM30. Helcelleanalyse er umulig med frysefraktion, fordi oplysninger om fordelingen af proteiner i membranen inden for rammerne af hele cellen går tabt.

Den metode, der præsenteres her, gør det muligt at undersøge cellemembranen uden at skulle udtyndeprøven 9,31. Cellerne holdes intakte, så lokaliseringen af membranproteinerne er synlig fra fluorescensbillederne, som er korreleret med EM-billederne. Undersøgelse af proteiner i enkeltcelle- og enkeltmolekyleniveauet i intakte celler i hydreret tilstand har vist sig at være mulig med en opløsning på 2 nm ved hjælp af STEM af QD-mærkede proteiner ved hjælp af denne grafenindkapslingsmetode9. Det er afgørende at holde celler i deres oprindelige tilstand, da det bevarer den rumlige fordeling af membranproteiner, således at analyser er mulige på enkeltcelle- og enkeltmolekyleniveau, hvilket er vigtigt for at forstå proteinfunktioner og udvikle nye lægemidler til behandlingsmetoder.

Et andet kritisk aspekt af billeddannende biologiske prøver med EM er strålingsskaderne af prøverne forårsaget af elektronstrålen. Løsninger omfatter ofte reduktion af elektrondosis så meget som muligt eller forskellige belægningsmetoder, såsom indkapsling af prøven mellem tynde lag af kulstof32. Vores metode viser, at grafen belægning reducerer stråle-induceret artefakter, der opstår på celleoverfladen for ikke-belagte prøver. Undersøgelse af de kemisk faste og grafenbelagte biologiske prøver er mulig under elektronstrålebestråling ved 200 keV-stråleenergi op til D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2 uden strålingsskade, såsom lyspunkter, der er vist på prøven. Sammenlignet med andre EM-metoder, der involverer omfattende prøveforberedelse, for eksempel farvning, indlejring, (kryo-) nittet, frakturering osv., er den metode, der er beskrevet her, mindre tidskrævende. Mærkning af proteiner udføres inden for et par timer, og grafen belægning kræver kun omkring 15 min for uddannede forskere. Prøvepræparatet kan sammenlignes med de procedurer, der er nødvendige for fluorescensmikroskopi.

Protokollen kan ændres i nogle trin. Grafen på mikrochippen kan også lufttørres for at sikre, at grafen ikke bevæger sig, når den slettes med et filterpapir. Hvis grafen er forurenet med salt, er det muligt at lade det flyde på overfladen af vand i ca. en time for at opløse saltet og dermed minimere forureningen. Opstår kobber eller PMMA forurening på grafen kan reduceres ved at udvide de tilsvarende ætsning trin i protokollen. Andre grafen belægning metoder er blevet beskrevet, hvor for eksempel graphene-PMMA blev direkte deponeret på celler, og PMMA blev fjernet ved vask i acetone bagefter33. I vores metode blev PMMA fjernet før belægning for at undgå eventuelle skader på cellerne forårsaget af yderligere acetone vasketrin. NaCl blev valgt som et substrat her, fordi det er fladt, så det ikke rynke grafen, og det opløses i vand for at frigive graphene9. Desuden kan det skæres i den ønskede størrelse og ingen substrat rester er tilbage på grafen. Men under hensyntagen til disse kriterier, andre substrater som kaliumchlorid kan muligvis anvendes så godt.

For at reducere risikoen for potentiel etiket-induceret klyngedannelse, GA fiksering trin kan gennemføres direkte efter FA fiksering, hvorefter alle membran proteiner er immobiliseret. Det første fikseringstrin med FA løser allerede den biologiske struktur, men et reduceret niveau af membranproteinspfusion kanstadig forekomme 34, hvilket muligvis kan føre til etiketinduceret klyngedannelse på grund af tilstedeværelsen af flere Streptavidin pr. QD. Fiksering med GA kan føre til et autofluorescenssignal under LM og udføres derfor efter LM i den beskrevne protokol, men kan reduceres som beskrevetandetsteds 34. Cacodylate buffer er ganske giftigt, og andre fiksativer kan bruges så godt, men cacodylate bruges her, da det er en almindeligt anvendt buffer til EM-protokoller, undgår udfældere, forhindrer væksten af bakterielle og svampe, og er forenelig med calciumioner, der er nødvendige for at bevare den ultrastrukturelle integritet lipidmembraner35. Hvis det er nødvendigt, kan osmium tetroxid bruges som ekstra fiksering for at stabilisere lipider. Dette ville bidrage til at øge kontrasten i cellestrukturen, men også tilføje et andet metal til systemet og reducere kontrasten opnået på QDs.

Den protokol, der er beskrevet her, indeholder mange trin, der kræver god instruktion. Nogle uddannelse er nødvendig, før håndtering af mikrochips for at undgå at ridse SiN overfladen af mikrochips og for at forhindre brud. Som nævnt før anbefales det at forberede mikrochips i dubletter, da SiN-vinduet kan gå i stykker fra tid til anden. Opnåelse af det nødvendige antal celler på en mikrochip kræver også en vis erfaring. Belægning cellerne med graphene har brug for nogle uddannelse, da det kan være svært at finde den rigtige vippevinkel til at flyde grafen på vand. Når du fanger grafen fra vand, kan det også være svært at se den tynde grafen. Så snart grafen er på mikrochippen, overskydende vand skal slettes med et filterpapir. Dette bør kun gøres med spidsen af et filterpapir sådant for at undgå at fjerne grafen fra mikrochippen.

Grafenbelægning forhindrede artefakter i at blive vist på prøven. Men for D < 4 x 102 e-/Å2 opstod der heller ingen artefakter for den ikke-belagte prøve, og artefakter dukkede kun op til 2 ikke-belagte prøver. Således undersøgelser af ikke-belagte celler synes også muligt, selv om det ville være bedre at bruge grafen og undgå risikoen for artefaktdannelse. Sammensætningen af disse artefakter kan analyseres i fremtiden for at give hints om, hvordan man kan forhindre deres dannelse. Med hensyn til cellernes strukturelle stabilitet blev der kun observeret en mindre forbedring af grafenbelægningen. De faste celler blev tilsyneladende stabiliseret i de undersøgte tynde områder, hvor deres struktur lå tæt på SiN-membranen. Hvad vi ikke undersøge her, var imidlertid tørring artefakter, der er kendt for at forekomme for cellulære prøver, når de udsættes for vakuum4. Tørring af cellerne ville føre til svind af cellerne, så også QD afstande ville ændre sig som en konsekvens. For den elektrondosis, der anvendes her, forblev afstanden mellem QD'er af grafenbelagte og ikke-belagte prøver stabil. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge effekten af grafen belægning på cellerne til EM.

En begrænsning af denne metode er, at den kemiske fiksering af cellerne er nødvendig; Derfor kan der ikke udføres levende celleforsøg. Men hvis mærkningen ikke er nødvendig, og celler med en højere strukturel stabilitet anvendes, for eksempel bakterier, så kan ikke-fastfærede celler omsluttet i grafen til EM36, om end med en anden elektrondosistolerance. Desuden er proteinerne ikke direkte påviselige, så QD'er er nødvendige for at visualisere proteinerne. Metoden ville drage fordel af mindre etiketter. Et diskussionspunkt er, om det er godt eller skidt, at ultrastrukturen ikke er klart synlig. Vores metode svarer til fluorescensmikroskopi, hvor kun udvalgte proteiner er synlige37. Øge synligheden af ultrastrukturen ville også tilføje meget mere information til billedet, og derefter på et tidspunkt forhindre påvisning af de enkelte label positioner. Desuden er den metode, der er beskrevet her, for en proteinart, og tilsætninger af protokollen er nødvendige for at kunne mærke flere proteiner. Sidst, metoden virker, når en lille høj affinitet specifikt bindende molekyle såsom antistof mimetiske21 eller nanostof38 er tilgængelig. Almindeligt anvendte antistoffer er meget større og ville forhindre påvisning af den funktionelle tilstand af protein underenheder i oligomerer.

Vores metode er nyttig til at studere proteinfunktion på hele celler ved hjælp af EM, samtidig med at cellerne i hydreret tilstand bevares. Det er let muligt at undersøge serier af celler. Andre typer af celler og proteiner kan studeres så godt. Hvis proteinmærkning ikke er nødvendig, kan en delmængde af protokollen anvendes til grafenbelægning af en lang række biologiske prøver. Evnen til at studere hele celler er relevant i cellulære forskning for at forstå korrelationer af membran protein funktion på molekylært niveau.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker D.B. Peckys for at have hjælp til cellekulturprotokollen, F. Weinberg for at have gennemgået manuskriptet, T. Trampert for at få hjælp til eksperimenterne og tallene, S. Smolka for at få hjælp til tallene, og E. Arzt for hans støtte gennem INM. Denne forskning er finansieret af Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. The Transmission Electron Microscope. , Springer. (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , Jones and Barlett Publishers. (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , Springer. (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Tags

Biologi grafen nanopartikler hele celle hydreret scanning transmission elektron mikroskopi STEM membran proteiner strålingsskader
Grafen kabinet af kemisk faste pattedyr celler til flydende fase elektron mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N.… More

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter