Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Carcasa de grafeno de células de mamíferos fijas químicamente para microscopía electrónica de fase líquida

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

Aquí se presenta un protocolo para etiquetar proteínas de membrana en células de mamíferos y recubrir la muestra con grafeno para microscopía electrónica de transmisión de barrido en fase líquida. La estabilidad de las muestras contra el daño causado por la radiación también se puede estudiar con este protocolo.

Abstract

Se describe un protocolo para investigar el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) en la membrana plasmática intacta de las células de cáncer de mama mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM). Las células de la línea celular de cáncer de mama de mamífero SKBR3 se cultivaron en microchips de silicio con ventanas de nitruro de silicio (SiN). Las células se fijaron químicamente, y las proteínas HER2 fueron etiquetadas con nanopartículas de puntos cuánticos (QD), utilizando un protocolo de unión de biotina-estreptavidina de dos pasos. Las células fueron recubiertas con grafeno multicapa para mantener un estado hidratado, y para protegerlas del daño del haz de electrones durante STEM. Para examinar la estabilidad de las muestras bajo la irradiación de haz de electrones, se realizó un experimento de serie de dosis. Se compararon muestras recubiertas de grafeno y no recubiertas. El daño inducido por el haz, en forma de artefactos brillantes, apareció para algunas muestras no recubiertas a la dosis de electrones Daumentada, mientras que no aparecieron artefactos en las muestras recubiertas.

Introduction

El análisis de la función de la proteína de membrana es esencial para la investigación biológica celular y para el desarrollo de fármacos. Una clase de experimentos importantes implica el examen de las posiciones de las proteínas de membrana en las células. Esta información se puede utilizar para deducir conclusiones sobre el ensamblaje de proteínas en complejos proteicos y sus ubicaciones específicas en la membrana plasmática, que, a través del montaje dinámico y el desmontaje, impulsa una amplia variedad de funciones celulares. Entre otras técnicas, la microscopía de luz (LM) y la microscopía electrónica (EM) se utilizan para estudiar las funciones proteicas en las células. LM permite el análisis de células enteras en líquido; sin embargo, la resolución está restringida a 200-300 nm para convencional y hasta 20 nm para microscopía de fluorescencia de super resolución en condiciones prácticas1,,2. EM proporciona alrededor de 1 resoluciones3, pero la preparación convencional de muestras requiere deshidratación, tinción de metal para mejorar el contraste de la imagen, e incrustación en una sustancia de montaje, como resina, para la microscopía electrónica de transmisión (TEM)4. Para preservar las muestras biológicas en un entorno más nativo, se pueden utilizar técnicas crio-EM5,,6. Las muestras se congelan rápidamente en hielo amorfo y, si es necesario, se seccionan. Otra opción es la congelación EM7.

Las técnicas EM para el estudio de proteínas de membrana dentro de células intactas en su estado nativo, líquido han surgido en la última década8,9,10,11. Se logró una resolución espacial de 2 nm en proteínas de membrana etiquetadas por puntos cuánticos (QD) en células enteras cultivadas en una membrana SiN y encerradas por una capa degrafeno 9.

Aquí, se describen los detalles de un protocolo para el etiquetado de proteínas y el recubrimientode grafeno 9,12. El objetivo de este protocolo es analizar la distribución espacial de HER2 en la membrana de células enteras y fijas, preservando las células en estado hidratado. El recubrimiento con grafeno evita el secado de las células al vacío, y también reduce el daño por radiación13. Este método proporciona información sobre las proteínas de membrana etiquetadas dentro de la membrana plasmática intacta, pero el método no es útil para estudiar la ultraestructura celular como se hace generalmente con EM.

El grafeno es el nanomaterial más delgado conocido, y consiste en una sola lámina cristalina de espesor de átomo de carbono dispuesta en una celosía de panal14. Tiene propiedades únicas que incluyen alta flexibilidad y resistencia mecánica. Investigaciones recientes han demostrado que el grafeno libre de defectos es impermeable a los gases y líquidos, pero los defectos permiten la permeación del hidrógeno15. Esta fuga se puede reducir mediante el uso de grafeno multicapa como se utiliza aquí. El grafeno bicapa ha demostrado recientemente ser útil como soporte para muestras crio-EM, mejorando la homogeneidad de la capa de hielo delgada en comparación con el óxido de grafeno donde sólo se pueden formar capas no uniformes16. También se demostró que el grafeno reduce el daño del haz de muestras biológicas durante la microscopía electrónica de transmisión en fase líquida13,17. Como un experimento ejemplar, HER2 expresado en la línea de células de cáncer de mama de mamífero SKBR3 fue etiquetado con QDs18 y su distribución espacial registrada usando STEM. Las células se sembraron en un microchip Si con una membrana SiN transparente de electrones19. Los microchips fueron elegidos como soporte, ya que son robustos, compatibles con LM y EM, y todo el procedimiento de etiquetado se puede realizar directamente en el microchip19. Después de la fijación de celda, HER2 fue etiquetado con un protocolo de etiquetado de dos pasos20. En primer lugar, se adjuntó un compuesto mimético anti-HER2 anticuerpo biotinilado21 a HER2. Las células se fijaron químicamente para evitar la agrupación en clústeres de receptores inducidos por etiquetas, y para aumentar la estabilidad de la ultraestructura celular. Los QD recubiertos con Streptavidin se vincularon posteriormente al complejo mimético her2-anticuerpo. La señal de fluorescencia brillante y el núcleo densa de electrones de los QD permitieron la fluorescencia correlativa y la microscopía electrónica (CLEM)20. CLEM es especialmente útil porque las regiones celulares de interés para el análisis STEM se pueden seleccionar de las imágenes de microscopía de fluorescencia general que resaltan la localización de HER2 en las células. Las células fueron analizadas por microscopía de fluorescencia para identificar regiones celulares con altos niveles de HER2. A partir de entonces, una lámina de grafeno de 3-5 capas de espesor fue transferida a las celdas para el recubrimiento9,,22. Posteriormente, la muestra se montó en un soporte de muestra EM. Los datos STEM se adquirieron utilizando el detector de campo oscuro anular (ADF), proporcionando información sobre la distribución espacial de HER2 en la superficie celular en relación con la ubicación de la superficie celular, pero sin dar información sobre la ultraestructura de la célula. Para determinar la estabilidad de la muestra bajo la irradiación de haz de electrones, las muestras se examinaron a una dosis creciente (D) en una serie de imágenes. Se investigó la diferencia entre las muestras recubiertas de grafeno y las no recubiertas. Se evaluaron varios tipos de daño por radiación.

El protocolo descrito aquí utiliza la línea de células de cáncer de mama DE MAMÍFEROs SKBR3 como un sistema modelo para apuntar a HER223. El protocolo incluye la preparación de una muestra recubierta de grafeno, y una muestra similar, pero sin recubrimiento de grafeno para la comparación. El experimento se prepara por duplicado, ya que la ventana de SiN puede romperse una vez cada vez, y para obtener un duplicado experimental en la mayoría de los casos. El rendimiento general del método es alto, lo que significa que los microchips con células cubiertas de grafeno generalmente se obtienen con un error excepcional, aunque no toda la ventana de SiN puede estar cubierta con grafeno en todos los casos. Los duplicados no se describen en el protocolo.

El protocolo de etiquetado (pasos 1-5) es comparable al protocolo del etiquetado del receptor del factor de crecimiento epidérmico en las células de fibroblastos COS7 publicadas anteriormente24; detalles en ese papel se refieren a la manipulación de los microchips, y el uso de las placas de pozo. El siguiente protocolo está optimizado para etiquetar HER2, recubrimientode grafeno 9y examinar la tolerancia a la radiación de la muestra.

Protocol

1. Limpieza de microchips y recubrimiento con poli-L-lisina (PLL) y proteína similar a la fibronectina (FLP)

  1. Colocar dos microchips con una membrana SiN (2,0 x 2,6 mm) en 50 ml de acetona. Manipule los microchips cuidadosamente con el lado plano hacia arriba. Evite romper los bordes utilizando pinzas de pico plano. Evite tocar la superficie superior de los microchips al manipular con pinzas para evitar la rotura de la ventana del SiN.
    NOTA: También se pueden utilizar pinzas recubiertas de politetrafluoroetileno o de punta de carbono para evitar daños en los microchips.
  2. Lavar las virutas durante 2 minutos agitando cuidadosamente el vaso de precipitados, viendo que los microchips no se voltean.
  3. Transfiera los microchips a 50 ml de etanol y lave durante 2 minutos agitando cuidadosamente el vaso de precipitados. Asegúrese de que la transferencia sea rápida para que el exceso de acetona no se seque.
  4. Lavar los microchips con 50 ml de agua durante 10 min.
  5. Sumerja los microchips en un vaso de precipitados recién preparado de 20 ml de etanol.
  6. Coloque microchips en un tejido de sala limpia para secar.
  7. El plasma limpia los microchips con 11,5 sccm O2 y 35 sccm Ar a 70 mTorr y radiofrecuencia (RF) -objetivo de 50 W durante 5 min.
  8. Coloque los microchips en una campana de flujo laminar para el trabajo celular estéril.
  9. Preparar una solución de 0,01% PLL en agua. Preparar una solución de FLP de 15 g/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  10. Preparar una placa de 24 pozos bajo el capó de flujo laminar y llenar 5 pozos individualmente con 1 mL de las soluciones en el siguiente orden: pozo 1 – PLL; pozo 2 – agua; pozo 3 – agua; bien 4 – FLP; bien 5 – PBS y pozo 6 – PBS.
    NOTA: Lleve a cabo los pasos de lavado sumergiendo un microchip en el pozo indicado 24 o 96 durante unos segundos con pinzas. Realizar pasos de incubación incubando los microchips en el pozo 24 o 96 en la solución indicada para el tiempo y la temperatura indicados. Transfiera los microchips a otro pozo en pocos segundos.
  11. Incubar los microchips en solución PLL durante 5 min. A continuación, lave los microchips en agua dos veces.
  12. Incubar los microchips en FLP durante 5 min. A continuación, lave los microchips en PBS dos veces.
  13. Transfiera ambos microchips a pozos (uno para cada microchip) de una nueva placa de 96 pozos precargada con 50 ml de medio libre de suero para la siembra celular.
  14. Incubar los microchips a 37oC y 5% de CO2 hasta que se prepare la suspensión celular.

2. Sembrar células en microchips de membrana SiN

  1. Configure todos los suministros y equipos en una campana de flujo laminar para garantizar un funcionamiento estéril.
  2. Lave la línea celular del cáncer de mama, SKBR3, en un matraz de cultivo celular con medio de crecimiento una vez. Utilice el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco que contenga 10% de suero de ternero fetal (FCS), y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAAs) como medio de crecimiento.
  3. Incubar las células con 1 ml de la solución de desprendimiento celular hasta que las células se desprendieran del matraz.
  4. Añadir 5 ml de medio de crecimiento a las celdas separadas en el matraz. Transfiera esta suspensión a un tubo centrífugo.
  5. Pipetear 20 l de la suspensión celular en un hemocitoómetro para obtener la concentración celular. Utilice la siguiente fórmula.
    Equation 1.
  6. Preparar una suspensión de células dispersas de 2,5 x 105 células/ml. Calcule la cantidad necesaria de la suspensión celular preparada:
    Equation 2
    y llenar con medio de crecimiento al volumen deseado.
  7. Añadir 100 l de la suspensión celular a los dos pocillos de una placa de 96 pozos que contenga los microchips recubiertos de PLL y FLP con la membrana SiN hacia arriba y 50 l de medio libre de suero para que cada pocillo contenga 25.000 células.
  8. Incubar la placa a 37oC y 5% deCO2 durante 5 minutos para esperar a que las células se adhieran al microchip.
    NOTA: En este punto, las células pueden desprenderse del microchip porque aún no se han adherido.
  9. Compruebe la densidad de las células del microchip con un microscopio invertido. Asegúrese de que las celdas cubran la ventana con suficiente espacio para aplanar y adherirse (consulte la figura 1A).
    NOTA: Se pueden agregar más celdas en este punto si es necesario.
  10. Transfiera los microchips a nuevos pomos que contengan 200 l de medio de crecimiento e incubar a 37oC y 5% de CO2 durante la noche.
  11. En la tarde del día siguiente, transfiera ambos microchips a un medio libre de suero (medio de inanición sérica) si las células se han aplanado y se han adherido a una confluencia inspeccionada visualmente (es decir, la fracción del área de la ventana cubierta de células) de aproximadamente 2/3 (ver Figura 1B). Cambie a medio libre de suero según sea necesario para llevar las células en una condición de inicio definida según sea necesario para la comparación entre diferentes experimentos25.
  12. Incubar a 37oC y 5% de CO2 durante la noche.
    NOTA: Tenga en cuenta que las cantidades de células pueden diferir según las tasas de crecimiento y la morfología celular para otras líneas celulares.

3. Etiquetado y fijación HER2

  1. Prepare las soluciones como se describe en la Tabla Suplementaria 1.
    1. Trabaje bajo la campana de flujo laminar para asegurar un trabajo estéril. Utilice una placa de 96 pozos denominada placa de etiquetado I, y llene 6 pocillos por microchip con 200 l de las soluciones de la placa de etiquetado I: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, miméticos de anticuerpos, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Utilice una fila (una letra por fila, por ejemplo, A1 a A6) de la placa de pozo por microchip. Caliente la placa de etiquetado a 37 oC.
    2. Bajo una campana de humo, prepare una placa de 24 pozos conocida como placa de fijación, y llene 8 pocillos por microchip con 500 l de las soluciones de placas de fijación: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS/glicina, PBS/BSA.
      ADVERTENCIA: El CB es agudamente tóxico por inhalación o ingestión oral y es peligroso para las aguas. Trabaje bajo la campana de humos con la protección adecuada y deseche el banco central de acuerdo con la ficha de datos de seguridad (SDS). La FA es corrosiva y dañina para la piel y la salud. Trabaje bajo la campana de humo y consulte el SDS para obtener información sobre el manejo y la eliminación.
    3. Preparar una placa de 96 pozos conocida como placa de etiquetado II y llenar 4 pocillos por microchip con 200 l de las soluciones de la placa de etiquetado II: QDs, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA.
      NOTA: Aquí, una placa de 24 pozos se utiliza para ver mejor los microchips en los pozos. Para utilizar menos anticuerpos miméticos (paso 3.2) y QD (paso 3.4), utilice 96 placas de pozo para estos pasos.
  2. Etiquete HER2 en las celdas.
    1. Una vez que estas placas estén listas, comience a etiquetar colocando los microchips en los pocillos de la primera fila de la placa de etiquetado 1.
    2. Lave los microchips con PBS/BSA en la placa de 96 pozos marcada como placa de etiquetado I.
    3. Bloquear sitios inespecíficos para evitar la unión inespecífica del anticuerpo mimético mediante la incubación con PBS/BSA/GS durante 5 min a 37 oC y 5% de CO2.
    4. Incubar con 200 nM de anticuerpos miméticos durante 10 min a 37oC y 5% CO2.
    5. Lave el microchip tres veces en PBS/BSA.
  3. Arregla las celdas.
    1. Transfiera los microchips a la placa de fijación de 24 pozos en la campana de humos.
      NOTA: No se necesita ningún trabajo estéril desde aquí.
    2. Lavar una vez con CB durante unos segundos.
    3. Corrija las celdas con 3% FA durante 10 min.
    4. Lavar una vez con CB y tres veces con PBS.
    5. Bloquear los grupos libres de aldehído de FA mediante la incubación con PBS-glicina durante 2 min.
    6. Lave los microchips con PBS-BSA una vez.
  4. Adjunte los QD.
    1. Mueva los microchips a la placa de etiquetado de 96 pozos II.
    2. Incubar con 20 nM QDs durante 12 min.
    3. Lave los microchips con PBS/BSA dos veces.
    4. Almacene los microchips en un pozo que contenga PBS/BSA.

4. Microscopía ligera de las células fijas

  1. Preparar un plato inferior de vidrio de 3,5 cm de diámetro con 2 ml de solución PBS/BSA.
  2. Tome los primeros microchips, colóquelos boca abajo (células mirando hacia abajo) en el plato inferior de vidrio y coloque el plato en el microscopio de fluorescencia. Baje el microchip lentamente en el líquido para evitar daños en las células.
  3. Adquiera imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) y fluorescencia de cada microchip con un objetivo de 40x y el canal de fluorescencia adecuado.
    NOTA: Aquí, se utiliza una longitud de onda de excitación de 540-580 nm y una longitud de onda de emisión de 607-683 nm para detectar QD655.
  4. Repita el procedimiento para el segundo microchip.

5. Post-fijación

  1. Realice todos los pasos debajo de la campana de humos.
  2. Llenar 6 pocillos por microchip de una placa de 96 pocillos con 200 l de las soluciones post-fijación:
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    ADVERTENCIA: GA es peligroso para las aguas, perjudicial para la piel, el sistema respiratorio y los ojos. Trabaje bajo la campana de humo y consulte el SDS para obtener información sobre el manejo y la eliminación.
  3. Coloque ambos microchips en sus respectivos pozos con las células hacia arriba.
  4. Lavar una vez con CB.
  5. Corrija las celdas con 2% DE GA durante 10 min.
  6. Lavar una vez con CB.
  7. Lavar tres veces con PBS/BSA.
    NOTA: El primer paso de fijación con FA ya fija la estructura biológica, pero todavía puede producirse un nivel reducido de difusión de proteínas de membrana, lo que posiblemente conduzca a agrupaciones inducidas por etiquetas debido a la presencia de múltiples estreptavidinas por QD. Mantener el tiempo de los pasos experimentales de la fijación FA a GA, por lo tanto, lo más corto posible para minimizar la difusión de las proteínas en la membrana.
  8. Conservar en PBS/BSA para evitar choques osmóticos y 0,02% de azida sódica (NaN3)para evitar el crecimiento bacteriano a 4 oC hasta que el recubrimiento de grafeno en una placa de pozo nueva. Selle la placa de pozo con película de parafina para evitar el secado. Los microchips y las células son estables hasta 2 semanas cuando se almacenan a 4 oC.
    ADVERTENCIA: La NaN3 es peligrosa para las aguas y agudamente tóxica por ingestión oral, para la piel y el sistema respiratorio. Trabaje bajo la campana de humo y consulte el SDS para obtener información sobre el manejo y la eliminación.

6. Limpieza y transferencia de grafeno a cristales de sal

  1. Eliminar el poli(metilmetacrilato) (PMMA)-grafeno de PMMA-grafeno-sobre-polímero (Figura 2A).
    1. Pipetear unas gotas de agua en el polímero alrededor del PMMA-grafeno.
      NOTA: Asegúrese de que el PMMA-grafeno salga fácilmente del polímero de soporte mientras flota en la superficie del agua.
    2. Sumerja el PMMA-grafeno-sobre-polímero en agua con un ángulo de 30-45o para liberar el PMMA-grafeno.
      NOTA: El polímero sólo debe estar ligeramente humedecido. Pipetting demasiada agua en el polímero se levantará y posiblemente doblar el PMMA-grafeno.
  2. Contaminantes a base de cobre etch utilizando una solución de persulfato de sodio (Figura 2B).
    NOTA: El grafeno comercial cultivado en papel de cobre a menudo contiene residuos de cobre submicrométrico, que se pueden eliminar con una solución de grabado de cobre22.
    1. Preparar una solución de 50 ml de persulfato sódico de 0,42 M en agua.
    2. Transfiera el PMMA-grafeno a la solución de persulfato de sodio con el lado del grafeno hacia abajo utilizando un portaobjetos de vidrio estándar. El PMMA-grafeno flotará encima de la solución.
    3. Deje el PMMA-grafeno en la solución de persulfato sódico durante la noche.
    4. Retire el PMMA-grafeno de la solución de persulfato de sodio y colóquelo encima de agua limpia usando un portaobjetos de vidrio. Déjalo flotar en el agua durante media hora.
    5. Repita el paso anterior un total de tres veces para eliminar todos los residuos de persulfato de sodio del PMMA-grafeno.
  3. Transfiera el PMMA-grafeno a un cristal de cloruro de sodio (NaCl).
    1. Preparar una solución saturada de NaCl en agua en un plato de Petri.
    2. Transfiera el PMMA-grafeno en la parte superior de la solución NaCl con el lado del grafeno hacia abajo usando un portaobjetos de vidrio.
    3. Sostenga un cristal NaCl con pinzas y recoja el PMMA-grafeno flotante.
      NOTA: El tamaño del cristal NaCl debe ser ligeramente mayor que el tamaño del grafeno PMMA para evitar doblar el grafeno sobresaliente en el borde de la sal o entrar en contacto con el grafeno con pinzas. En estos experimentos se utiliza el cristal NaCl de 12 mm x 12 mm x 0,5 mm para recoger una lámina de grafeno de 10 mm x 10 mm y apoyarla después.
    4. Sostenga el PMMA-grafeno-sobre-sal verticalmente durante 2 minutos para dejar que el exceso de agua fluya.
    5. Deje que el PMMA-grafeno-sobre-sal se seque a temperatura ambiente durante 30 minutos y hornéelo en un horno a 100 oC durante 20 minutos para eliminar completamente el agua.
  4. Retire el PMMA con un lavado de acetona(Figura 2C).
    1. Precaliente la acetona en un plato de Petri de vidrio a 50 oC en una placa de cocción en la campana de humo. Observe la temperatura cuidadosamente para evitar el fuego.
    2. Sumerja el PMMA-grafeno-sobre-sal en el plato Petri lleno de acetona y déjelo disolver el PMMA durante 30 min.
    3. Repita el paso anterior un total de tres veces con acetona nueva y limpia.
    4. Deje que el grafeno sobre sal se seque completamente antes de usarlo para la preparación de la muestra.

7. Recubrimiento de grafeno

NOTA: El procedimiento de recubrimiento de grafeno se muestra esquemáticamente en la Figura 3A.

  1. Lavar un microchip preparado con células fijas y etiquetado HER2 en agua pura para eliminar cualquier residuo de sal del tampón. Coloque el microchip en un papel de filtro. Las celdas son visibles como manchas oscuras (Figura 3B).
  2. Corte el grafeno multicapa en el cristal NaCl en una pieza que se ajuste a la ventana SiN de un microchip usando una cuchilla de afeitar.
  3. Preparar un vaso de agua pura y retirar el grafeno del cristal NaCl inclinando el cristal alrededor de 45o de ángulo con respecto a la superficie del agua y tocando el agua. El grafeno flotará sobre la superficie del agua(Figura 3C).
  4. Atrapa el grafeno con un lazo metálico de la superficie del agua. El grafeno flotará dentro de la gota debajo del lazo(Figura 3D).
  5. Toque la superficie superior del microchip con la superficie del bucle inferior. El microchip se pegará al lazo metálico. El grafeno se puede ver en la parte superior del microchip (Figura 3E).
  6. Bajo un estereomicroscopio, utilice papel de filtro para eliminar el agua restante del microchip, de modo que el grafeno cubra todas las celdas de la ventana de SiN.
    NOTA: El grafeno se moverá cuando se borre. Asegúrese de que el grafeno se mantenga en la parte superior de la ventana tocando el microchip solo con el borde del papel de filtro.
  7. Utilice pinzas para quitar el microchip del lazo metálico y colóquelo en un papel de filtro. El grafeno es visible como un brillo púrpura en el microchip (Figura 3F).
  8. Transfiera el microchip del papel a un compartimento De Petri.
  9. Pipetear una gota de agua en uno de los compartimentos libres y cerrar la tapa para proporcionar una atmósfera saturada de agua.
  10. Selle el plato del compartimiento con película de parafina y guárdelo en la nevera a 4 oC si es necesario para mediciones adicionales.

8. STEM

  1. Ajuste el STEM a 200 kV de energía de haz utilizando una muestra de alineación/prueba para un tamaño de sonda de al menos 0,2 nm ajustando las lentes del condensador, una corriente de sonda I a 180 pA (el fabricante proporciona información sobre la corriente de la sonda para diferentes ajustes del microscopio con una precisión del 5%) y un semiángulo de convergencia de 13,2 mrad mediante la inserción de una abertura. Ajuste el rango de semiángulo de apertura del detector ADF STEM (interior y exterior) a 68-280 mrad ajustando la configuración de la lente del proyector. Establezca el tamaño de la imagen STEM en 2048 x 2048 píxeles, y el tiempo de permanencia de píxeles t a 6 s.
  2. Cargue el microchip con células recubiertas de grafeno en un soporte de muestra estándar para TEM de tal manera que las células estén mirando hacia arriba.
  3. Cargue el soporte en el microscopio electrónico.
  4. Adquirir una imagen general en el aumento (M) a 800x (Figura 4) utilizando la configuración del paso 8.1.
  5. Identifique una región de interés en una celda.
  6. Ijes con un detector de ADF a 80.000x a un tamaño de píxel d a 1,3 nm M (Figura 4) utilizando la configuración del paso 8.1.
  7. Adquirir una imagen del área después de la exposición con un aumento inferior (aquí, M a 50.000x) para mostrar el área expuesta (Figura 4).
  8. Calcular la dosis de electrones
    Equation 3
    donde e es la carga elemental. Con los ajustes indicados en lo anterior,
    Equation 4
    y un error del 5%.
  9. Adquiera 20 imágenes para una serie de dosis con los mismos ajustes, pero con t a 60o dando como resultado una dosis acumulada de
    Equation 20.
  10. Para confirmar la presencia de grafeno, cambie el microscopio a TEM a M a 1.200x, seleccione una región cerca de una celda y cambie al modo de difracción. Registre un patrón de difracción en un tiempo de exposición de 0,5 s, 2048 x 2048 x 3 píxeles, y una apertura de área seleccionada de 50 m(Figura 4).
  11. Al final de la sesión, retire la muestra del microscopio, vuelva a colocar el microchip en la bandeja del compartimiento, selle el plato con película de parafina y guárdelo en la nevera a 4 oC si es necesario para realizar mediciones adicionales.
  12. Seleccione el segundo microchip preparado de la misma manera que el primer microchip pero sin recubrimiento de grafeno.
  13. Repita los pasos 8.2-8.11 pero ahora para este ejemplo. Registre un patrón de difracción con la misma configuración que en la anterior, como comparación (Figura 4).

9. Análisis

NOTA: Para la detección automatizada de posiciones QD en una imagen STEM, el análisis utiliza un plugin de diseño local para ImageJ (NIH), como se describe en otroslugares 20. El plugin está disponible bajo petición.

  1. El software aplica automáticamente los siguientes pasos para detectar partículas en una imagen STEM:
    1. Aplica un filtro gaussiano para reducir el ruido de píxeles.
    2. Aplique un filtro de paso de banda Fast Fourier Transform (FFT) para obtener solo nanopartículas.
    3. Establezca un umbral para binarizar la imagen.
    4. Utilice un diámetro de partícula de 10 nm con un factor de tolerancia de 2 para la detección de partículas.
    5. Detectar posiciones de partículas.
  2. Mida la distancia centro-centro entre diez pares de QD por serie. Aquí, se midieron 10 distancias con un tamaño variable por serie.
  3. Calcule el cambio relativo en la distancia de partículas comparando cada distancia de partícula con la distancia de la primera imagen utilizando:
    Equation 5.

Representative Results

La Figura 1A muestra las celdas sembradas de tal manera que la ventana está cubierta pero con espacio suficiente para permitirles aplanarse y adherirse, lo que lleva a una confluencia de aproximadamente 2/3rd (Figura 1B). En caso de que se se se seban demasiadas células en un microchip (Figura 1C), no hay suficiente espacio para que todas las células se adhieran al microchip. La Figura 1D muestra el mismo microchip después de 24 h. Más de la mitad de las células no se aplanó. Por otro lado, si se siembran muy pocas celdas(Figura 1E),la ventana SiN terminará con un gran espacio vacío después de 24 h como se ve en la Figura 1F. El cuadro 1G muestra la imagen DIC de las células en el cuadro 1A y el cuadro 1B. La Figura 1H muestra la imagen de fluorescencia correspondiente de color falso en amarillo que indica el etiquetado correcto de HER2.

Los datos REPRESENTATIVOs STEM se muestran en la Figura 4. Se investigaron las celdas SKBR3 recubiertas de grafeno (columna izquierda) y no recubiertas (columna derecha). Figura 4A,B muestra las imágenes de visión general de M a 800x de las celdas en la ventana. Las áreas mostradas como insertos se visualizaron en M a 80.000x durante la serie de dosis, véase la Figura 4C,D. Los QD son visibles como puntos brillantes aquí. La Figura 4E y la Figura 4F muestran M a 50.000 imágenes magnificadas adquiridas en las ubicaciones de los rectángulos de la Figura 4C,D. Ambas imágenes se registraron después de la adquisición de una serie de dosis con D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/-2. La serie de dosis se registró en M a 80.000x. Las áreas expuestas se pueden reconocer como rectángulos, por lo que el rectángulo era claramente visible para la muestra no recubierta (Figura 4F).

Para verificar la presencia de grafeno, se adquirieron patrones de difracción de áreas sin células, pero con o sin grafeno en la ventana de SiN. La estructura hexagonal del grafeno se observó en el patrón de difracción de la muestra recubierta de grafeno (Figura 4G), mientras que estaba ausente para la muestra no recubierta (Figura 4H). El patrón de difracción del grafeno de cristal único tendrá seis veces la simetría debido a la estructura hexagonal altamente ordenada del grafeno. Por lo tanto, la estructura hexagonal indica la presencia de grafeno en las muestras.

Para investigar el efecto de la iluminación de haz de electrones en la muestra, se adquirieron imágenes STEM en una serie de imágenes con una dosis de electrones acumulada. Los resultados representativos de las muestras no recubiertas y recubiertas de grafeno se muestran en la Figura 5A-D y en la Figura 5E-G,respectivamente. Todos los datos fueron adquiridos en el borde de la célula, donde la célula es la más plana, y la estructura observada es por lo tanto la más cercana a la membrana SiN. La exposición de una muestra no recubierta dio lugar a estructuras brillantes que aparecen en las superficies celulares en D á (1,9 x 0,1) x 103 e-/a2 (Figura 5B). Estas estructuras se hicieron más grandes con dosis más altas, por lo que fueron claramente visibles en la última imagen de la serie en D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/-2 (Figura 5C,D). Estas manchas no aparecieron en ninguna de las muestras recubiertas de grafeno(Figura 5E-G).

Se prepararon y examinaron microchips adicionales utilizando el protocolo descrito en lo anterior. Se investigaron en total seis muestras recubiertas y siete no recubiertas. Dos de cada siete muestras no recubiertas mostraron estos artefactos. Ninguna de las muestras recubiertas mostró puntos brillantes adicionales.

Como otra medida del daño por radiación, se examinó la distancia entre los QD. Si se produjeran daños estructurales, se esperaría que las distancias entre los QD cambiaran. Los cambios en las distancias se midieron para diferentes pares de QD con la acumulación de D para un rango de distancias de par. La Figura 5H muestra que el cambio relativo de las partículas para las muestras no recubiertas se mantuvo por debajo del 1,3% en promedio, mientras que la distancia relativa media se mantuvo por debajo del 0,8% para las muestras recubiertas. Por lo tanto, se puede concluir que el recubrimiento de grafeno estabilizó la muestra, pero las muestras secas sin recubrimiento de grafeno también eran notablemente estables.

Figure 1
Figura 1: Siembra celular en una ventana SiN de un microchip de silicio y HER2 etiquetado. (A) Imagen ejemplar de una región de ventana SiN con celdas SKBR3 5 minutos después de la siembra en el microchip. (B) Las mismas celdas se extienden en la misma ventana de SiN después de 24 h. (C) SKBR3 células en un Microchip Si 5 min después de la siembra. (D) Las mismas células que en (C) después de 24 h. Las células no se aplanaron correctamente, ya que había demasiadas células en las virutas al sembrar. (E) Cells en un microchip 5 min después de la siembra. (F) Sólo unas pocas celdas eran visibles en la ventana porque muy pocas células se sembraron en el microchip. (G) Imagen DIC de las mismas celdas SKBR3 después del etiquetado QD de HER2. (H) Superponga la imagen de DIC y la imagen de fluorescencia correspondiente de las celdas SKBR3 etiquetadas con HER2-QD655 (color falso en amarillo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Limpieza y transferencia de grafeno a cristales NaCl. (A) PMMA-grafeno-sobre-polímero se sumerge en agua pura para liberar grafeno PMMA. El PMMA-grafeno se puede atrapar con un portaobjetos de vidrio. (B) Las contaminaciones a base de cobre se grabaron utilizando solución de persulfato sódico. Para limpiar el grafeno, se transfirió a un vaso de precipitados que contenía agua desionizada. Estos pasos se repitieron 3 veces. El PMMA-grafeno se transfirió entonces a la solución saturada de NaCl en agua pura. Se utilizó un cristal NaCl para recoger el grafeno de la solución salina. (C) El PMMA-grafeno en cristal NaCl se secó durante 30 minutos a temperatura ambiente. PMMA se eliminó incubando el bloque en acetona durante 30 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Recubrimiento de grafeno de las células sembradas en un microchip Si. (A) Procedimiento de recubrimiento de grafeno. El grafeno en el cristal naCl se libera sobre la superficie del agua. La pieza de grafeno es capturada con un lazo metálico y transferida al microchip Si. (B) Microchip (2,0 x 2,6 mm) con una ventana SiN de dimensiones 400 x 160 m sin grafeno. Las células SKBR3 eran visibles como manchas oscuras. (C) Grafeno (círculo rojo) flotando en la superficie de un vaso de precipitados lleno de agua. (D) Grafeno atrapado con un lazo metálico. (E) El microchip unido a la gota de agua de modo que el grafeno estaba en la parte superior de la ventana del SiN. (F) Microchip después del recubrimiento de grafeno. El grafeno era visible como un brillo púrpura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: STEM de celdas SKBR3 recubiertas y no recubiertas de grafeno en la ventana de SiN. (A) Imagen STEM de una muestra recubierta de grafeno adquirida en una imagen STEM M a 800x. (B) de una muestra no recubierta adquirida en M a 800x. (C) M a 80.000x imagen grabada en la posición del rectángulo azul en A. Las líneas amarillas representan ejemplos de distancias medidas dentro de la partícula. (D) M a 80.000x imagen grabada en la posición del rectángulo azul en B. La línea amarilla representa ejemplos de distancias medidas dentro de partículas. (E) M a 50.000x imagen de la misma región que C expuesta a D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/o2. (F) M a 50.000x imagen de la misma región que D y expuesta a D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/o2. El área expuesta fue claramente vista. (G) Patrón de difracción de una muestra recubierta de grafeno de un área sin células. La simetría de seis veces del grafeno es visible como puntos brillantes. (H) Patrón de difracción de una muestra sin grafeno que no muestra 6 puntos brillantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Artefactos que surgen en muestras sin recubrimiento de grafeno. (A) Primeras imágenes de regiones en muestras sin recubrimiento de grafeno adquiridas a 80.000x, y expuestas a D á (0,39 a 0,02) x 102 e-/o2. M (B) Imágenes con los primeros artefactos que surjan en D á (1,94 x 0,1) x 103 e-/o2 (flechas amarillas). (C, D) La última imagen de la serie adquirida con D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/o2. Los artefactos eran visibles como puntos brillantes. (E-G) Muestras recubiertas de grafeno sin artefactos. (E) D á (0,39 a 0,02) x 102 e-/a2 (F) D á (1,94 a 0,1) x 103 e-/o2 (G) D á (7,8 a 0,4) x 103 e-/o2. (H) Cambio relativo en las distancias de partículas para muestras recubiertas de grafeno y no recubiertas. Se analizaron dos de las muestras no recubiertas que muestran artefactos, una de las cuales se muestra en (A-C), y la última imagen de la segunda muestra en D, así como tres muestras recubiertas (una se muestra en E-G). En total, se examinaron diez pares de QD por muestra con distancias que oscilaban entre 250 nm y 3 m. El cambio relativo refleja el promedio de todas las mediciones en un grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Recetas para soluciones y buffers. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

Para comprender mejor la función proteica, es importante obtener información sobre las ubicaciones de proteínas en la membrana plasmática de las células intactas. Los métodos para obtener esta información incluyen la microscopía de fluorescencia de superconorción1,2. Aunque la microscopía de superresor resolución se ha desarrollado aún más en los últimos años, su resolución todavía está limitada a unos 20 nm para condiciones prácticas de experimentos celulares, mientras que las proteínas receptoras típicas tienen tamaños en el rango de 1-10 nm. La imagen de proteínas en un solo nivel de célula y molécula única con resolución suficiente para visualizar proteínas es posible con EM. Pero debido al corte, los métodos EM convencionales normalmente no dejan la célula intacta26,lo que conduce a la pérdida de información importante sobre el contexto y la distribución espacial de proteínas en la membrana plasmática. Métodos para células enteras con crio-TEM se han desarrollado6,es factible combinar el etiquetado de proteínas con crio-EM27,también crio-STEM se ha demostrado28. Sin embargo, los flujos de trabajo crio-EM están optimizados para estudiar la ultraestructura celular y la estructura de proteínas, y no tanto para analizar las distribuciones espaciales de proteínas de membrana. El secado de punto crítico es otro método de preparación de células enteras, pero las muestras se someten a varios pasos de secado, y la técnica consume mucho tiempo29. Las proteínas de membrana también se han examinado a través de la fractura por congelación7. En este método, las células se fijan, congelan y se fracturan. Las partes fracturadas se replican por capas de carbono y platino, y se elimina la muestra biológica. Las réplicas se pueden analizar con EM30. El análisis celular completo es imposible con la fracción de congelación porque se pierde información sobre la distribución de proteínas en la membrana dentro del contexto de toda la célula.

El método presentado aquí permite estudiar la membrana celular sin necesidad de cortar la muestra9,,31. Las células se mantienen intactas para que la localización de las proteínas de membrana sea visible a partir de las imágenes de fluorescencia, que están correlacionadas con las imágenes EM. El estudio de proteínas a nivel de célula única y molécula única dentro de células intactas en estado hidratado ha demostrado ser posible con una resolución de 2 nm utilizando STEM de proteínas etiquetadas con QD utilizando este método de grafeno9. Mantener las células en su estado nativo es crucial, ya que preserva la distribución espacial de las proteínas de membrana de tal manera que los análisis son posibles a nivel de célula única y molécula única, que es importante para entender las funciones proteicas, y el desarrollo de nuevos fármacos para los enfoques terapéuticos.

Otro aspecto crítico de la toma de imágenes de muestras biológicas con EM es el daño por radiación de las muestras causado por el haz de electrones. Las soluciones a menudo incluyen la reducción de la dosis de electrones tanto como sea posible o varios métodos de recubrimiento, tales como encapsular la muestra entre capas delgadas de carbono32. Nuestro método muestra que el recubrimiento de grafeno reduce los artefactos inducidos por el haz que emergen en la superficie de la célula para muestras no recubiertas. El examen de las muestras biológicas fijas químicamente y recubiertas de grafeno es posible bajo irradiación de haz de electrones a 200 keV de energía de haz hasta D á (7,8 x 0,4) x 103 e-/a2 sin daños por radiación, como puntos brillantes, que aparecen en la muestra. En comparación con otros métodos EM que implican una preparación elaborada de la muestra, por ejemplo, tinción, incrustación, sección (crio-), fracturación, etc., el método descrito aquí consume menos tiempo. El etiquetado de las proteínas se realiza en pocas horas, y el recubrimiento de grafeno sólo requiere unos 15 minutos para investigadores capacitados. La preparación de la muestra es comparable con los procedimientos necesarios para la microscopía de fluorescencia.

El protocolo se puede modificar en algunos pasos. El grafeno en el microchip también se puede secar al aire para asegurarse de que el grafeno no se mueve cuando se borra con un papel de filtro. Si el grafeno está contaminado con sal, es posible dejarlo flotar en la superficie del agua durante aproximadamente una hora para disolver la sal y así minimizar la contaminación. La contaminación por cobre o PMMA en el grafeno se puede reducir extendiendo los pasos de grabado correspondientes en el protocolo. Se han descrito otros métodos de recubrimiento de grafeno en los que, por ejemplo, el grafeno-PMMA se depositó directamente en las células, y el PMMA se eliminó lavando en acetona despuésde 33. En nuestro método, PMMA fue removido antes del recubrimiento para evitar cualquier posible daño a las células causado por pasos adicionales de lavado de acetona. NaCl fue elegido como sustrato aquí porque es plano, por lo que no arruga el grafeno, y se disuelve en agua para liberar elgrafeno 9. Además, se puede cortar en el tamaño deseado y no quedan residuos de sustrato en el grafeno. Pero teniendo en cuenta esos criterios, otros sustratos como el cloruro de potasio posiblemente se pueden utilizar también.

Para reducir la posibilidad de un posible agrupamiento inducido por etiquetas, el paso de fijación de GA se puede implementar directamente después de la fijación de FA, después de lo cual todas las proteínas de membrana se inmovilizan. El primer paso de fijación con FA ya fija la estructura biológica, pero un nivel reducido de difusión de proteína de membrana todavía puede ocurrir34,lo que posiblemente conduce a la agrupación inducida por etiquetas debido a la presencia de múltiples Streptavidin por QD. La fijación con GA puede conducir a una señal de autofluorescencia durante LM, y por lo tanto, se realiza después de LM en el protocolo descrito, pero se puede reducir como se describe en otro lugar34. El tampón de cacodilato es bastante tóxico, y otros fijadores también se pueden utilizar, pero el cacodilato se utiliza aquí ya que es un tampón comúnmente utilizado para los protocolos EM, evita los precipitados, previene el crecimiento de bacterias y hongos, y es compatible con los iones de calcio que se necesitan para preservar la integridad ultraestructural de las membranas lipídicas35. Si es necesario, el tetróxido de osmio se puede utilizar como fijación adicional para estabilizar los lípidos. Esto ayudaría a mejorar el contraste de la estructura celular, pero también añadir otro metal al sistema y reducir el contraste obtenido en los QD.

El protocolo descrito aquí contiene muchos pasos que requieren una buena instrucción. Se requiere cierto entrenamiento antes de manipular microchips para evitar rayar la superficie del SiN de los microchips y para evitar roturas. Como se mencionó anteriormente, se recomienda preparar microchips en duplicados ya que la ventana siN puede romperse de vez en cuando. Obtener el número requerido de células en un microchip también requiere cierta experiencia. Recubrir las células con grafeno necesita un poco de entrenamiento, ya que puede ser difícil encontrar el ángulo de inclinación correcto para flotar el grafeno en el agua. Al capturar el grafeno del agua, también puede ser difícil ver el grafeno delgado. Tan pronto como el grafeno está en el microchip, el exceso de agua necesita ser borrado con un papel de filtro. Esto sólo debe hacerse con la punta de un papel de filtro para evitar la eliminación del grafeno del microchip.

El recubrimiento de grafeno impidió que aparecieran artefactos en la muestra. Pero para D < 4 x 102 e-/-2 tampoco surgieron artefactos para la muestra no recubierta, y los artefactos aparecieron solo para 2 muestras no recubiertas. Por lo tanto, los exámenes de células no recubiertas también parecen posibles, aunque sería mejor utilizar grafeno y evitar el riesgo de formación de artefactos. La composición de esos artefactos se puede analizar en el futuro para dar pistas sobre cómo prevenir su formación. En cuanto a la estabilidad estructural de las células sólo se observó una pequeña mejora del recubrimiento de grafeno. Las células fijas fueron aparentemente estabilizadas en las áreas delgadas examinadas, donde su estructura estaba cerca de la membrana SiN. Lo que no examinamos aquí, sin embargo, fueron artefactos de secado que se sabe que ocurren para muestras celulares cuando se exponen al vacío4. El secado de las células llevaría a la contracción de las células para que también las distancias QD cambiarían como consecuencia. Para la dosis de electrones utilizada aquí, la distancia de QD de muestras recubiertas de grafeno y no recubiertas se mantuvo estable. Se necesitan más estudios para examinar el efecto del recubrimiento de grafeno en las células para EM.

Una limitación de este método es que la fijación química de las células es necesaria; por lo tanto, no se pueden realizar experimentos de células vivas. Pero en caso de que el etiquetado no sea necesario y se utilicen células con una mayor estabilidad estructural, por ejemplo bacterias, entonces las células no fijas se pueden encerrar en grafeno para EM36 aunque con una tolerancia de dosis de electrones diferente. Además, las proteínas no son detectables directamente, por lo que se necesitan QD para visualizar las proteínas. El método se beneficiaría de etiquetas más pequeñas. Un punto de discusión es si es bueno o malo que la ultraestructura no sea claramente visible. Nuestro método es similar al de la microscopía de fluorescencia donde sólo las proteínas seleccionadas son visibles37. Aumentar la visibilidad de la ultraestructura también añadiría mucha más información a la imagen, y luego en algún momento evitaría la detección de las posiciones de etiqueta individuales. Además, el método descrito aquí es para una especie de proteína, y se necesitan adiciones del protocolo para poder etiquetar múltiples proteínas. Por último, el método funciona cuando una pequeña molécula de unión de alta afinidad específicamente como anticuerpos miméticos21 o nanobody38 está disponible. Los anticuerpos de uso común son mucho más grandes y evitarían la detección del estado funcional de las subunidades de proteínas en oligómeros.

Nuestro método es útil para estudiar la función proteica en células enteras usando EM mientras mantiene las células en estado hidratado. Es fácilmente posible examinar series de células. También se pueden estudiar otros tipos de células y proteínas. Si no se necesita el etiquetado de proteínas, se puede utilizar un subconjunto del protocolo para el recubrimiento de grafeno de una amplia variedad de muestras biológicas. La capacidad de estudiar células enteras es relevante en la investigación celular para entender las correlaciones de la función de la proteína de membrana a nivel molecular.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a D. B. Peckys por ayuda con el protocolo de cultivo celular, F. Weinberg por revisar el manuscrito, T. Trampert por ayuda con los experimentos y las figuras, S. Smolka para ayudar con las figuras, y E. Arzt por su apoyo a través de INM. Esta investigación está financiada por Else Kr'ner-Fresenius-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. The Transmission Electron Microscope. , Springer. (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , Jones and Barlett Publishers. (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , Springer. (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Tags

Biología Número 163 grafeno nanopartículas célula entera hidratado microscopía electrónica de transmisión de barrido STEM proteínas de membrana daño por radiación
Carcasa de grafeno de células de mamíferos fijas químicamente para microscopía electrónica de fase líquida
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N.… More

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter