Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Grafenkabinett av kjemisk faste pattedyrceller for flytende fase elektronmikroskopi

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

Presentert her er en protokoll for merking membranproteiner i pattedyrceller og belegg prøven med grafen for væskefase skanning overføring elektron mikroskopi. Stabiliteten av prøvene mot skaden forårsaket av stråling kan også studeres med denne protokollen.

Abstract

En protokoll er beskrevet for å undersøke human epidermal vekstfaktorreseptor 2 (HER2) i den intakte plasmamembranen av brystkreftceller ved hjelp av skanning av transmisjonselektronmikroskopi (STEM). Celler i den pattedyrske brystkreftcellelinjen SKBR3 ble dyrket på silisiummikrobrikker med silisiumnitradvinduer (SiN). Cellene ble kjemisk faste, og HER2-proteiner ble merket med quantum dot nanopartikler (QDs), ved hjelp av en to-trinns biotin-streptavidin bindingsprotokoll. Cellene ble belagt med flerlags grafen for å opprettholde en hydrert tilstand, og for å beskytte dem mot elektronstråleskade under STEM. For å undersøke stabiliteten til prøvene under elektronstrålebestråling, ble det utført et eksperiment i doseringsserien. Grafenbelagte og ikke-belagte prøver ble sammenlignet. Beam indusert skade, i form av lyse gjenstander, dukket opp for noen ikke-belagte prøver ved økt elektrondose D,mens ingen gjenstander dukket opp på belagte prøver.

Introduction

Analyse av membranproteinfunksjon er avgjørende for cellebiologisk forskning, og for legemiddelutvikling. En klasse av viktige eksperimenter innebærer undersøkelse av membranproteinstillinger i celler. Denne informasjonen kan brukes til å utlede konklusjoner om montering av proteiner i proteinkomplekser og deres spesifikke steder i plasmamembranen, som, via dynamisk montering og demontering, driver et bredt utvalg av cellulære funksjoner. Blant andre teknikker brukes lett mikroskopi (LM) og elektronmikroskopi (EM) til å studere proteinfunksjoner i celler. LM tillater analyse av hele celler i væske; Oppløsningen er imidlertid begrenset til 200-300 nm for konvensjonelle og opptil 20 nm for super oppløsning fluorescens mikroskopi under praktiske forhold1,,2. EM gir rundt 1 Å-oppløsninger3, men konvensjonell prøveforberedelse krever dehydrering, metallfarging for å forbedre bildekontrasten og innebygging i et monteringsstoff, for eksempel harpiks, for overføring av elektronmikroskopi (TEM)4. For å bevare biologiske prøver i et mer innfødt-lignende miljø, kan cryo-EM teknikker brukes5,,6. Prøvene fryses raskt inn i amorf is, og om nødvendig seksjonert. Et annet alternativ er fryse-fracturing EM7.

EM teknikker for å studere membran proteiner i intakte celler i sin innfødte, flytende tilstand har dukket opp i det sistetiåret 8,9,10,11. En romlig oppløsning på 2 nm ble oppnådd på quantum dot (QD) merkede membranproteiner i hele celler dyrket på en SiN-membran og omsluttet av et lag grafen9.

Her er detaljer om en protokoll for proteinmerking oggrafenbelegg 9,12 beskrevet. Målet med denne protokollen er å analysere den romlige fordelingen av HER2 i membranen av hele, faste celler, samtidig som cellene bevares i en hydrert tilstand. Belegg med grafen forhindrer tørking av cellene i vakuum, og reduserer også strålingsskader13. Denne metoden gir informasjon om merkede membranproteiner i den intakte plasmamembranen, men metoden er ikke nyttig for å studere cellulær ultrastruktur som vanligvis gjøres med EM.

Grafen er det tynneste nanomaterialet kjent, og består av et enkelt karbonatom tykt krystallinsk ark arrangert i en honeycomb gitter14. Den har unike egenskaper, inkludert høy fleksibilitet og mekanisk styrke. Nyere forskning har vist at defektfri grafen er ugjennomtrengelig for gasser og væsker, men defekter tillater hydrogenpermeasjon15. Denne lekkasjen kan reduseres ved hjelp av flerlags grafen som brukes her. Bilayer grafen har nylig vist seg å være nyttig som en støtte for cryo-EM prøver, forbedre homogeniteten til det tynne islaget sammenlignet med grafenoksid der bare ikke-uniform lag kan dannes16. Grafen ble også vist å redusere stråleskader av biologiske prøver under væskefaseoverføring elektronmikroskopi13,,17. Som et eksemplarisk eksperiment ble HER2 uttrykt i den pattedyrske brystkreftcellelinjen SKBR3 merket med QDs18 og den romlige fordelingen registrert ved hjelp av STEM. Cellene ble seeded på en Si mikrobrikke med en elektron gjennomsiktig SiN membran19. Mikrobrikkene ble valgt som en støtte da de er robuste, kompatible med LM og EM, og hele merkingsprosedyren kan utføres direkte påmikrobrikken 19. Etter cellevedlegg ble HER2 merket med en totrinns merkingsprotokoll20. Først ble en biotinylert anti-HER2 antistoff mimetisk forbindelse21 festet til HER2. Cellene ble deretter kjemisk festet for å hindre etikettindusert reseptorklynging, og for å øke stabiliteten til den cellulære ultrastrukturen. Streptavidin-belagte QDs ble senere knyttet til HER2-antistoff mimetisk kompleks. Det lyse fluorescenssignalet og den elektrontette kjernen i QDene tillot korrelativ fluorescens- og elektronmikroskopi (CLEM)20. CLEM er spesielt nyttig fordi cellulære områder av interesse for STEM-analyse kan velges fra oversikten fluorescens mikroskopi bilder fremhever lokalisering av HER2 på cellene. Celler ble analysert av fluorescensmikroskopi for å identifisere cellulære regioner med høye HER2-nivåer. Deretter ble et 3-5 lags tykt ark grafen overført til cellene for belegg9,22. Deretter ble prøven montert i en EM-prøveholder. STEM-data ble innhentet ved hjelp av den ringformede mørke feltdetektoren (ADF), som ga informasjon om den romlige fordelingen av HER2 på celleoverflaten i forhold til celleoverflatens plassering, men gir ingen informasjon om cellens ultrastruktur. For å fastslå stabiliteten til prøven under elektronstrålebestråling ble prøvene undersøkt ved økende dose (D) i en bildeserie. Forskjellen mellom grafenbelagte og ikke-belagte prøver ble undersøkt. Flere typer strålingsskader ble evaluert.

Protokollen som er beskrevet her bruker HER2 overexpressing mammal brystkreft celle linje SKBR3 som et modellsystem for målretting HER223. Protokollen inkluderer utarbeidelse av en grafenbelagt prøve, og en lignende prøve, men uten grafenbelegg for sammenligning. Eksperimentet er utarbeidet i duplikat siden SiN-vinduet kan bryte en gang hver stund, og for å få en eksperimentell duplikat i de fleste tilfeller. Det totale utbyttet av metoden er høy, noe som betyr at mikrobrikker med grafendekkede celler vanligvis oppnås med en eksepsjonell feil, selv om ikke hele SiN-vinduet kan dekkes med grafen i alle tilfeller. Duplikater er ikke beskrevet i protokollen.

Merkingsprotokollen (trinn 1-5) kan sammenlignes med protokollen for merking av epidermal vekstfaktorreseptoren i COS7 fibroblastceller publisert tidligere24; detaljer i det papiret henvises til om håndtering av mikrobrikkene, og bruken av brønnplatene. Følgende protokoll er optimalisert for merking av HER2, grafenbelegg9, og undersøke strålingstoleransen til prøven.

Protocol

1. Rengjøring av mikrobrikker og belegg med poly-L-lysin (PLL) og fibronectin-lignende protein (FLP)

  1. Plasser to mikrobrikker med en SiN-membran (2,0 x 2,6 mm) i 50 ml aceton. Håndter mikrobrikkene forsiktig med den flate siden vendt opp. Unngå å bryte kantene ved hjelp av flat-nebb pinsett. Unngå å berøre den øverste overflaten av mikrobrikkene når du håndterer med pinsett for å forhindre brudd på SiN-vinduet.
    MERK: Man kan også bruke polytetrafluoretylenbelagte pinsett eller karbontipp pinsett for å forhindre skade på mikrobrikkene.
  2. Vask sjetongene i 2 min ved å riste begeret forsiktig, se mikrobrikkene ikke snu.
  3. Overfør mikrobrikkene til 50 ml etanol og vask i 2 min ved å riste begeret forsiktig. Sørg for at overføringen er rask slik at overflødig aceton ikke tørker inn.
  4. Vask mikrobrikkene med 50 ml vann i 10 min.
  5. Dypp mikrobrikkene i et nylaget beger på 20 ml etanol.
  6. Plasser mikrobrikker på et vaskeromvev for tørking.
  7. Plasma rengjør mikrobrikkene med 11,5 sccm O2 og 35 sccm Ar ved 70 mTorr og radiofrekvens (RF)-mål på 50 W i 5 min.
  8. Plasser mikrobrikkene i en laminær strømningshette for sterilt cellearbeid.
  9. Forbered en løsning på 0,01% PLL i vann. Klargjør en oppløsning på 15 μg/ml FLP i fosfatbufret saltvann (PBS).
  10. Forbered en 24 brønnplate under laminærstrømningshetten og fyll 5 brønner individuelt med 1 ml av løsningene i følgende rekkefølge: brønn 1 – PLL; brønn 2 – vann; brønn 3 – vann; vel 4 – FLP; brønn 5 - PBS og godt 6 - PBS.
    MERK: Utukne vasketrinn ved å dyppe en mikrobrikke i den angitte 24 eller 96 godt i noen sekunder ved hjelp av pinsett. Utfør inkubasjonstrinn ved å inkubere mikrobrikkene i 24 eller 96-brønnen i den angitte oppløsningen for angitt tid og temperatur. Overfør mikrobrikkene til en annen brønn innen få sekunder.
  11. Inkuber mikrobrikkene i PLL-oppløsning i 5 min. Vask deretter mikrobrikkene i vann to ganger.
  12. Inkuber mikrobrikkene i FLP i 5 min. Vask deretter mikrobrikkene i PBS to ganger.
  13. Overfør begge mikrobrikkene til brønner (en for hver mikrobrikke) av en ny 96 brønnplate forhåndsfylt med 50 μL serumfritt medium for cellesåing.
  14. Inkuber mikrobrikkene ved 37 °C og 5 % CO2 til cellefjæringen er klargjort.

2. Seeding celler på SiN membran mikrobrikker

  1. Sett opp alle forsyninger og utstyr i en laminær strømningshette for å sikre sterilt arbeid.
  2. Vask brystkreftcellelinjen, SKBR3, i en cellekulturkolbe med vekstmedium en gang. Bruk Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) som inneholder 10 % føtalkalvenserum (FCS) og 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAAer) som vekstmedium.
  3. Inkuber cellene med 1 ml celleavløsning til cellene løsnet fra kolben.
  4. Tilsett 5 ml vekstmedium til de frittliggende cellene i kolben. Overfør denne suspensjonen til et sentrifugerør.
  5. Pipette 20 μL av cellesuspensjonen i et hemocytometer for å oppnå cellekonsentrasjonen. Bruk følgende formel.
    Equation 1.
  6. Forbered en dispergert cellesuspensjon på 2,5 x10 5 celler/ml. Beregn den nødvendige mengden av den forberedte cellesuspensjonen ved å:
    Equation 2
    og fyll opp med vekstmedium til ønsket volum.
  7. Tilsett 100 μL av cellefjæringen til de to brønnene på en 96-brønnplate som inneholder PLL- og FLP-belagte mikrobrikker med SiN-membranen vendt opp og 50 μL serumfritt medium, slik at hver brønn inneholder 25 000 celler.
  8. Inkuber platen ved 37 °C og 5 % CO2 i 5 min for å vente på at cellene skal festes til mikrobrikken.
    MERK: På dette punktet kan celler løsne fra mikrobrikken fordi de ikke har fulgt ennå.
  9. Kontroller tettheten av cellene på mikrobrikken med et omvendt mikroskop. Kontroller at cellene dekker vinduet med tilstrekkelig plass til å flate ut og feste (se figur 1A).
    MERK: Flere celler kan legges til på dette tidspunktet om nødvendig.
  10. Overfør mikrobrikkene til nye brønner som inneholder 200 μL vekstmedium og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 over natten.
  11. På ettermiddagen neste dag overfører du begge mikrobrikkene til serumfritt medium (serumsultmedium) hvis cellene har flatet ut og festet seg til en visuelt inspisert samløpet (det vil si brøkdelen av vindusområdet dekket med celler) på ca. 2/3 (se figur 1B). Bytt til serumfritt medium etter behov for å bringe cellene i en definert starttilstand etter behov for sammenligning mellom ulike eksperimenter25.
  12. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 over natten.
    MERK: Vær oppmerksom på at cellebeløpene kan variere i henhold til vekstrater og cellemorfologi for andre cellelinjer.

3. HER2 merking og fiksering

  1. Klargjør løsningene som beskrevet i tilleggstabell 1.
    1. Arbeid under laminærstrømningshetten for å sikre sterilt arbeid. Bruk en 96 brønnplate referert til som merkeplate I, og fyll 6 brønner per mikrobrikke med 200 μL av merkeplaten I-løsninger: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, antistoff mimetisk, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Bruk én rad (én bokstav per rad, f.eks. A1 til A6) på brønnplaten per mikrobrikke. Varm merkeplaten til 37 °C.
    2. Under en røykhette, lag en 24 brønnplate referert til som fikseringsplate, og fyll 8 brønner per mikrobrikke med 500 μL av fikseringsplateløsningene: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS/ glycine, PBS / BSA.
      FORSIKTIG: CB er akutt giftig ved innånding eller oral inntak og er farlig for vann. Arbeid under røykhetten med egnet beskyttelse og kast CB i henhold til sikkerhetsdatabladet (SDS). FA er etsende og skadelig for hud og helse. Arbeid under røykhetten og se SDS for informasjon om håndtering og avhending.
    3. Forbered en 96 brønnplate referert til som merking plate II og fyll 4 brønner per mikrobrikke med 200 μL av merking plate II løsninger: QDs, PBS / BSA, PBS / BSA, PBS / BSA.
      MERK: Her brukes en 24-brønnplate til å se mikrobrikkene bedre i brønnene. Hvis du vil bruke mindre antistoff mimetisk (trinn 3.2) og QDs (trinn 3.4), bruker du 96 brønnplater for disse trinnene.
  2. Merk HER2 i cellene.
    1. Når disse platene er klare, begynner du å merke ved å plassere mikrobrikkene i brønnene i den første raden med merkeplate 1.
    2. Vask mikrobrikkene med PBS/BSA i 96-brønnplaten merket som merkeplate I.
    3. Blokker uspesifikke steder for å forhindre uspesifisert binding av antistoffet mimetisk ved å inkubere med PBS/BSA/GS i 5 min ved 37 °C og 5 % CO2.
    4. Inkuber med 200 nM antistoff mimetisk i 10 min ved 37 °C og 5% CO2.
    5. Vask mikrobrikken tre ganger i PBS/BSA.
  3. Fiks cellene.
    1. Overfør mikrobrikkene til 24-brønnfikseringsplaten i røykhetten.
      MERK: Det er ikke nødvendig med sterilt arbeid herfra.
    2. Vask en gang med CB i noen sekunder.
    3. Fiks celler med 3% FA i 10 min.
    4. Vask én gang med CB og tre ganger med PBS.
    5. Blokker gratis aldehydgrupper av FA ved å inkubere med PBS-glycin i 2 min.
    6. Vask mikrobrikker med PBS-BSA én gang.
  4. Fest QDene.
    1. Flytt mikrobrikkene til 96 godt merking plate II.
    2. Inkuber med 20 nM QDs i 12 min.
    3. Vask mikrobrikkene med PBS/BSA to ganger.
    4. Oppbevar mikrobrikkene i en brønn som inneholder PBS/BSA.

4. Lett mikroskopi av de faste cellene

  1. Forbered en 3,5 cm diameter glass bunnrett med 2 ml PBS / BSA løsning.
  2. Ta de første mikrobrikkene, legg den opp ned (celler vendt ned) i glassbunnsfatet og legg parabolen i fluorescensmikroskopet. Senk mikrobrikken langsomt ned i væsken for å forhindre skade på cellene.
  3. Oppnå differensial interferenskontrast (DIC) og fluorescensbilder av hver mikrobrikke med et 40x mål og riktig fluorescenskanal.
    MERK: Her brukes en eksitasjonsbølgelengde på 540-580 nm og en bølgelengde på 607-683 nm til å oppdage QD655.
  4. Gjenta prosedyren for den andre mikrobrikken.

5. Etter fiksering

  1. Utfør alle trinnene under røykhetten.
  2. Fyll 6 brønner per mikrobrikke av en 96 brønnplate med 200 μL av etterfikseringsløsningene:
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    FORSIKTIG: GA er vannfarlig, skadelig for hud, luftveier og øyne. Arbeid under røykhetten og se SDS for informasjon om håndtering og avhending.
  3. Plasser begge mikrobrikkene i sine respektive brønner med cellene vendt opp.
  4. Vask én gang med CB.
  5. Fiks celler med 2% GA i 10 min.
  6. Vask én gang med CB.
  7. Vask tre ganger med PBS/BSA.
    MERK: Det første fikseringstrinnet med FA løser allerede den biologiske strukturen, men et redusert nivå av membranproteindiffusjon kan fortsatt forekomme, noe som muligens fører til etikettindusert klynger på grunn av tilstedeværelsen av flere streptavidiner per QD. Hold tiden for de eksperimentelle trinnene fra FA-fiksering til GA, derfor så kort som mulig for å minimere spredningen av proteinene i membranen.
  8. Oppbevares i PBS/BSA for å forhindre osmotiske støt og 0,02 % natriumazid (NaN3) for å forhindre bakterievekst ved 4 °C til grafenbelegg i en ny brønnplate. Forsegle godt plate med parafinfilm for å hindre tørking. Mikrobrikkene og cellene er stabile opptil 2 uker når de oppbevares ved 4 °C.
    FORSIKTIG: NaN3 er vannfarlig og akutt giftig ved oral inntak, for hud og luftveier. Arbeid under røykhetten og se SDS for informasjon om håndtering og avhending.

6. Rengjøring og overføring av grafen til saltkrystaller

  1. Fjern poly(metylmetakkrylat) (PMMA)-grafen fra PMMA-grafen-på-polymer (figur 2A).
    1. Pipette noen dråper vann på polymeren rundt PMMA-grafen.
      MERK: Sørg for at PMMA-grafen lett kommer av støttepolymeren når den flyter på vannoverflaten.
    2. Dypp PMMA-grafen-på-polymer i vann med en vinkel på 30-45° for å frigjøre PMMA-grafen.
      MERK: Polymeren skal bare fuktes litt. Pipettering for mye vann på polymeren vil løfte opp og muligens brette PMMA-grafen.
  2. Ets kobberbaserte kontaminanter ved hjelp av en natriumpersulfatoppløsning (figur 2B).
    MERK: Kommersiell grafen dyrket på kobberfolie inneholder ofte sub-mikrometer kobberrester, som kan fjernes med en kobberetchant løsning22.
    1. Forbered en 50 ml oppløsning på 0,42 M natriumpersulfat i vann.
    2. Overfør PMMA-grafen til natriumpersulfatoppløsningen med grafensiden ned ved hjelp av et standard glasssklie. PMMA-grafen vil flyte på toppen av løsningen.
    3. La PMMA-grafen stå i natriumpersulfatoppløsningen over natten.
    4. Fjern PMMA-grafen fra natriumpersulfatoppløsningen og plasser den på toppen av rent vann ved hjelp av en glasssklie. La det flyte på vannet i en halv time.
    5. Gjenta forrige trinn totalt tre ganger for å fjerne alle natriumpersulfatrester fra PMMA-grafen.
  3. Overfør PMMA-grafen til en natriumklorid (NaCl) krystall.
    1. Forbered en mettet løsning av NaCl i vann i en petriskål.
    2. Overfør PMMA-grafen på toppen av NaCl-løsningen med grafensiden ned ved hjelp av et glasssklie.
    3. Hold en NaCl krystall med pinsett og plukke opp flytende PMMA-grafen.
      MERK: Størrelsen på NaCl-krystallen skal være litt større enn størrelsen på PMMA-grafen for å unngå å brette den utstående grafen på kanten av saltet eller kontakte grafen med pinsett. I disse eksperimentene brukes NaCl-krystall på 12 mm x 12 mm x 0,5 mm til å plukke opp et 10 mm x 10 mm grafenark og støtte det etterpå.
    4. Hold PMMA-grafen-på-salt vertikalt i 2 min for å la overflødig vann strømme ut.
    5. La PMMA-grafen-på-salt tørke ved romtemperatur i 30 min og stek den i en ovn ved 100 °C i 20 min for å fjerne vann helt.
  4. Fjern PMMA ved hjelp av en acetonvask (figur 2C).
    1. Forvarm aceton i et glass Petriskål til ~ 50 ° C på en kokeplate i røykhetten. Pass nøye på temperaturen for å unngå brann.
    2. Dypp PMMA-grafen-på-salt i petriskålen fylt med aceton og la den oppløse PMMA i 30 min.
    3. Gjenta forrige trinn totalt tre ganger med nytt, rent aceton.
    4. La grafen-på-salt lufttørke grundig før du bruker den til prøveklargjøring.

7. Grafen belegg

MERK: Grafenbeleggprosedyren vises skjematisk i figur 3A.

  1. Vask en mikrobrikke tilberedt med faste celler og merket HER2 i rent vann for å fjerne eventuelle rester av salt fra bufferen. Plasser mikrobrikken på et filterpapir. Cellene er synlige som mørke flekker (figur 3B).
  2. Skjær flerlagsgrafen på NaCl-krystallen i et stykke som passer til SiN-vinduet på en mikrobrikke ved hjelp av et barberblad.
  3. Forbered et beger av rent vann og fjern grafen fra NaCl-krystallen ved å vippe krystallen ca 45 ° vinkel med hensyn til vannoverflaten og berøre vannet. Grafen vil flyte på vannoverflaten (figur 3C).
  4. Fang grafen med en metallsløyfe fra overflaten av vannet. Grafen vil flyte innenfor dråpen under løkken (figur 3D).
  5. Berør den øvre overflaten av mikrobrikken med den nedre sløyfeoverflaten. Mikrobrikken vil holde seg til metallsløyfen. Grafen kan ses på toppen av mikrobrikken (figur 3E).
  6. Under et stereomikroskop bruker du filterpapir til å fjerne det gjenværende vannet fra mikrobrikken, slik at grafen dekker alle celler på SiN-vinduet.
    MERK: Grafen vil bevege seg når den er blotted. Kontroller at grafen forblir på toppen av vinduet ved å berøre mikrobrikken bare med kanten av filterpapiret.
  7. Bruk pinsett til å fjerne mikrobrikken fra metallløkken og plassere den på et filterpapir. Grafen er synlig som en lilla skimmer på mikrobrikken (figur 3F).
  8. Overfør mikrobrikken fra papiret til et rom Petriskål.
  9. Pipette en dråpe vann inn i et av de frie rommene og lukk lokket for å gi en vannmettet atmosfære.
  10. Forsegle romfatet med parafinfilm og oppbevar i kjøleskapet ved 4 °C om nødvendig for videre målinger.

8. STEM

  1. Juster STEM ved 200 kV stråleenergi ved hjelp av en justerings-/testprøve for en probestørrelse på minst 0,2 nm ved å justere kondensatorlinsene, en probestrøm I = 180 pA (informasjon om probestrømmen for forskjellige mikroskopinnstillinger er gitt av produsenten innen 5% nøyaktighet) og en strålekonvergens halvvinkel på 13,2 mrad ved å sette inn en blenderåpning. Sett ADF STEM-detektoråpningen halvvinkelområde (indre og ytre) til 68-280 mrad ved å justere projektorlinseinnstillingene. Sett STEM-bildestørrelsen til 2048 x 2048 piksler, og pikselbotid t = 6 μs.
  2. Legg mikrobrikken med grafenbelagte celler i en standard prøveholder for TEM på en slik måte at cellene vender opp.
  3. Legg holderen inn i elektronmikroskopet.
  4. Få et oversiktsbilde ved forstørrelse (M) = 800x (Figur 4) ved hjelp av innstillingene i trinn 8.1.
  5. Identifisere et interesseområde på en celle.
  6. Bilde QDene med en ADF-detektor ved M = 80 000 x ved en pikselstørrelse d = 1,3 nm (figur 4) ved hjelp av innstillingene i trinn 8.1.
  7. Få et bilde av området etter eksponering med en lavere forstørrelse (her M = 50 000x) for å vise det eksponerte området (figur 4).
  8. Beregn elektrondosen
    Equation 3
    der e er den elementære ladningen. Med innstillingene som er angitt i ovennevnte,
    Equation 4
    og en feil på 5%.
  9. Få 20 bilder for en doseserie med samme innstillinger, men med t = 60 μs som resulterer i en akkumulert dose
    Equation 20.
  10. For å bekrefte tilstedeværelsen av grafen, bytt mikroskopet til TEM ved M = 1200x, velg et område i nærheten av en celle og bytt til diffraksjonsmodus. Ta opp et diffraksjonsmønster ved en eksponeringstid på 0,5 s, 2048 x 2048 x 3 piksler, og en valgt områdeåpning på 50 μm (figur 4).
  11. På slutten av økten, fjern prøven fra mikroskopet, legg mikrobrikken tilbake i romfatet, forsegle parabolen med parafinfilm, og oppbevar den i kjøleskapet ved 4 ° C om nødvendig for ytterligere målinger.
  12. Velg den andre mikrobrikken som er utarbeidet på samme måte som den første mikrobrikken, men uten grafenbelegg.
  13. Gjenta trinn 8.2-8.11, men nå for dette eksemplet. Ta opp et diffraksjonsmønster med de samme innstillingene som i ovennevnte, til sammenligning (figur 4).

9. Analyse

MERK: For automatisert gjenkjenning av QD-posisjoner i et STEM-bilde, bruker analysen en plugin av lokal design for ImageJ (NIH), som beskrevet andre steder20. Programtillegget er tilgjengelig etter avtale.

  1. Programvaren bruker automatisk følgende trinn for å oppdage partikler i et STEM-bilde:
    1. Påfør et gaussisk filter for å redusere pikselstøy.
    2. Påfør et Fast Fourier Transform (FFT) bandpassfilter for å oppnå nanopartikler bare.
    3. Angi en terskel for å binarize bildet.
    4. Bruk en partikkeldiameter på 10 nm med en toleransefaktor på 2 for partikkeldeteksjon.
    5. Oppdag partikkelposisjoner.
  2. Mål midt-til-midten-avstanden mellom ti par QDer per serie. Her ble det målt 10 avstander med varierende størrelse per serie.
  3. Beregn den relative endringen i partikkelavstand ved å sammenligne hver partikkelavstand med avstanden i det første bildet ved hjelp av:
    Equation 5.

Representative Results

Figur 1A viser celler seeded på en slik måte at vinduet er dekket, men med tilstrekkelig plass til å tillate dem å flate ut og holde seg, noe som fører til samløpet på ca 2/3rd (Figur 1B). I tilfelle for mange celler seedes på en mikrobrikke (figur 1C), er det ikke nok plass for alle celler til å holde seg til mikrobrikken. Figur 1D viser samme mikrobrikke etter 24 timer. Mer enn halvparten av cellene flatet ikke ut. På den annen side, hvis for få celler er seeded (Figur 1E), vil SiN-vinduet ende opp med et stort tomt rom etter 24 timer som vist i figur 1F. Figur 1G viser DIC-bildet av cellene i figur 1A og figur 1B. Figur 1H viser det tilsvarende fluorescensbildet som er falskt farget i gult, noe som indikerer vellykket merking av HER2.

Representative STEM-data vises i figur 4. Grafenbelagte (venstre kolonne) og ikke-belagte (høyre kolonne) SKBR3-celler ble undersøkt. Figur 4A,B viser M = 800x oversiktsbilder av cellene i vinduet. Områdene som vises som innløp ble avbildet ved M = 80 000x i doseserien, se figur 4C,D. QDene er synlige som lyse flekker her. Figur 4E og Figur 4F viser M = 50 000x forstørrede bilder som er anskaffet på rektanglenes plasseringer i figur 4C,D. Begge bildene ble tatt opp etter oppkjøpet av en doseserie med D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Doseserien ble registrert ved M = 80 000x. De eksponerte områdene kan gjenkjennes som rektangel, der rektangelet var godt synlig for den ikke-belagte prøven (figur 4F).

For å verifisere tilstedeværelsen av grafen ble diffraksjonsmønstre av områder uten celler, men med eller uten grafen på SiN-vinduet anskaffet. Grafens sekskantede struktur ble observert i diffraksjonsmønsteret til den grafenbelagte prøven (figur 4G), mens den var fraværende for den ikke-belagte prøven (figur 4H). Diffraksjonsmønsteret til enkelt krystallgrafen vil ha seksdoblet symmetri på grunn av høyt bestilt sekskantet struktur av grafen. Så indikerer den sekskantede strukturen tilstedeværelsen av grafen på prøvene.

For å undersøke effekten av elektronstrålebelysning på prøven, ble STEM-bilder kjøpt i en bildeserie med en akkumulerende elektrondose. Representative resultater for ikke-belagte og grafenbelagte prøver er vist i henholdsvis figur 5A-D og figur 5E-G. Alle data ble innhentet på kanten av cellen, hvor cellen er den flateste, og den observerte strukturen er dermed nærmest SiN-membranen. Eksponeringen av en ikke-belagt prøver førte til lyse strukturer som vises på celleflatene ved D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (figur 5B). Disse strukturene ble større med høyere doser, så de var tydelig synlige i det siste bildet av serien ved D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Figur 5C, D). Disse flekkene ble ikke vist på noen av de grafenbelagte prøvene (figur 5E-G).

Ytterligere mikrobrikker ble utarbeidet og undersøkt ved hjelp av protokollen som er beskrevet i ovennevnte. Totalt ble seks belagte og syv ikke-bestrøkede prøver undersøkt totalt. To av syv ikke-bestrøkede prøver viste disse artefaktene. Ingen av de bestrøkede prøvene viste noen ekstra lyse flekker.

Som et annet mål på strålingsskader ble avstanden mellom QDs undersøkt. Hvis strukturell skade skulle oppstå, ville man forvente at avstandene mellom QDs skulle endres. Endringer i avstander ble målt for ulike par QDer med akkumulerende D for en rekke paravstander. Figur 5H viser at den relative endringen av partiklene for ikke-bestrøkede prøver holdt seg under 1,3% i gjennomsnitt, mens den gjennomsnittlige relative avstanden forble under 0,8% for de bebelagte prøvene. Man kan derfor konkludere med at grafenbelegget stabiliserte prøven, men de inntørkede prøvene uten grafenbelegg var også bemerkelsesverdig stabilt.

Figure 1
Figur 1: Cellesåing på et SiN-vindu i en silisiummikrobrikke og HER2 merket. (A) Eksemplarisk bilde av et SiN vindusområde med SKBR3-celler 5 min etter såing på mikrobrikken. (B)De samme cellene sprer seg på samme SiN-vindu etter 24 timer (C) SKBR3 celler på en Si mikrobrikke 5 min etter såing. (D)Samme celler som i (C) etter 24 timer. Cellene flatet ikke ordentlig ut da det var for mange celler på sjetongene ved såing. (E) Celler på en mikrobrikke 5 min etter såing. (F) Bare få celler var synlige på vinduet fordi for få celler ble seeded på mikrobrikken. (G) DIC bilde av de samme SKBR3-cellene etter QD merking av HER2. (H)Overlegg bilde av DIC og tilsvarende fluorescens bilde av merkede SKBR3 celler med HER2-QD655 (falsk farget i gult). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Rengjøring og overføring av grafen til NaCl-krystaller. (A)PMMA-grafen-på-polymer er nedsenket i rent vann for å frigjøre PMMA grafen. PMMA-grafen kan fanges med et glasssklie. (B)Kobberbaserte forurensninger ble etset ved hjelp av natriumpersulfatoppløsning. For å rengjøre grafen ble den overført til et beger som inneholdt deionisert vann. Disse trinnene ble gjentatt 3 ganger. PMMA-grafen ble deretter overført til mettet løsning av NaCl i rent vann. En NaCl-krystall ble brukt til å plukke opp grafen fra saltoppløsningen. (C) PMMA-grafen på NaCl krystall ble tørket ut i 30 min ved romtemperatur. PMMA ble fjernet ved å inkubere blokken i aceton i 30 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Grafen belegg av celler seeded på en Si microchip. (A) Prosedyre for grafen belegg. Grafen på NaCl krystall slippes ut på vannoverflaten. Grafenstykket fanges deretter med en metallsløyfe og overføres til Si-mikrobrikken. (B)Microchip (2,0 x 2,6 mm) med et SiN-vindu av dimensjoner 400 x 160 μm uten grafen. SKBR3-celler var synlige som mørke flekker. (C) Grafen (rød sirkel) flytende på overflaten av et beger fylt med vann. (D) Grafen fanget med en metallsløyfe. Mikrobrikkenfestet til vanndråpen slik at grafen var på toppen av SiN-vinduet. (F)Mikrochip etter grafenbelegg. Grafen var synlig som en lilla skimmer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: STAMME av grafenbelagte og ikke-belagte SKBR3-celler i SiN-vinduet. (A) STEM bilde av en grafen belagt prøve ervervet ved en M = 800x. (B) STEM bilde av en ikke-belagt prøve kjøpt ved M = 800x. (C) M = 80,000x bilde registrert i plasseringen av det blå rektangelet i A. Gule linjer representerer eksempler avstander målt i partikkel. (D) M = 80 000x bilde registrert i posisjonen til det blå rektangelet i B. Gul linje representerer eksempler avstander målt i partikler. (E) M = 50 000x bilde av samme region som C utsatt for D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. (F) M = 50 000x bilde av samme region som D og utsatt for D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. Det eksponerte området ble tydelig sett. (G)Diffraksjonsmønster av en grafenbelagt prøve fra et område uten celler. Grafens seksfoldige symmetri er synlig som lyse flekker. (H) Diffraksjonsmønster av en prøve uten grafen som ikke viser 6-ganger lyse flekker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Gjenstander som oppstår på prøver uten grafenbelegg. (A)Første bilder av regioner på prøver uten grafenbelegg ervervet ved M = 80 000x, og utsatt for D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) Bilder med de første artefaktene som oppstår ved D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (gule piler). (C, D) Siste bilde av serien ervervet med D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Artefakter var synlige som lyse flekker. (E-G) Grafenbelagte prøver uten å oppstå gjenstander. (E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. (H)Relativ endring i partikkelavstander for grafenbelagte og ikke-belagte prøver. To av de ikke-bestrøkede prøvene som viser artefakter, hvorav den ene vist i (A-C), og det siste bildet av den andre prøven i D, samt tre bestrøkede prøver ble analysert (en er vist i E-G). Totalt ble ti QD-par undersøkt per prøve med avstander mellom 250 nm og 3 μm. Den relative endringen gjenspeiler gjennomsnittet av alle målinger i én gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstabell 1: Oppskrifter for løsninger og buffere. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

For å bedre forstå proteinfunksjonen er det viktig å få informasjon om proteinplasseringer i plasmamembranen av intakte celler. Metoder for å få denne informasjonen inkluderer superoppløsning fluorescens mikroskopi1,2. Selv om mikroskopi med superoppløsning har utviklet seg videre de siste årene, er oppløsningen fortsatt begrenset til ca. 20 nm for praktiske forhold til celleeksperimenter, mens typiske reseptorproteiner har størrelser i området 1-10 nm. Avbildning av proteiner på enkeltcelle- og enkeltmolekylnivå med tilstrekkelig oppløsning for å visualisere proteiner er mulig med EM. Men på grunn av snitting forlater konvensjonelle EM-metoder vanligvis ikke cellen intakt26, noe som fører til tap av viktig informasjon om konteksten og den romlige fordelingen av proteiner i plasmamembranen. Metoder for hele celler med cryo-TEM er utviklet6,det er mulig å kombinere proteinmerking med cryo-EM27, også cryo-STEM har blitt demonstrert28. Kryo-EM-arbeidsflyter er imidlertid optimalisert for å studere cellulær ultrastruktur og proteinstruktur, og ikke så mye for å analysere membranprotein romlige distribusjoner. Kritisk punkttørking er en annen hel celleforberedelsesmetode, men prøvene blir utsatt for flere tørketrinn, og teknikken er svært tidkrevende29. Membranproteiner har også blitt undersøkt via frysebrudd7. I denne metoden er cellene faste, frosne og brukket. De brukket delene replikeres av karbon- og platinalag, og den biologiske prøven fjernes. Replikaene kan deretter analyseres med EM30. Hele celleanalyse er umulig med frysefraksjon fordi informasjon om fordelingen av proteiner i membranen i sammenheng med hele cellen går tapt.

Metoden som presenteres her gjør at cellemembranen kan studeres uten å måtte tynne oppprøven 9,31. Cellene holdes intakte slik at lokaliseringen av membranproteinene er synlige fra fluorescensbildene, som er korrelert med EM-bildene. Studere proteiner på enkeltcelle og enkeltmolekylnivå i intakte celler i hydrert tilstand har vist seg å være mulig med en oppløsning på 2 nm ved hjelp av STEM av QD merkede proteiner ved hjelp av denne grafen kabinettmetoden9. Å holde celler i sin opprinnelige tilstand er avgjørende, da det bevarer den romlige fordelingen av membranproteiner slik at analyser er mulige på enkeltcelle- og enkeltmolekylnivå, noe som er viktig for å forstå proteinfunksjoner, og utvikle nye legemidler for terapitilnærminger.

Et annet kritisk aspekt ved å avbilde biologiske prøver med EM er strålingsskaden til prøvene forårsaket av elektronstrålen. Løsninger inkluderer ofte reduksjon av elektrondosen så mye som mulig eller ulike beleggmetoder, for eksempel innkapsling av prøven mellom tynne lag av karbon32. Vår metode viser at grafenbelegg reduserer stråleinduserte gjenstander som dukker opp på celleoverflaten for ikke-belagte prøver. Undersøkelse av kjemisk faste, og grafenbelagte biologiske prøver er mulig under elektronstrålebestråling ved 200 keV stråleenergi opp til D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/ Å2 uten strålingsskader, for eksempel lyse flekker, som vises på prøven. Sammenlignet med andre EM-metoder som involverer forseggjort prøveforberedelse, for eksempel farging, innebygging, (cryo-) snitting, fracturing, etc., er metoden som er beskrevet her mindre tidkrevende. Merking av proteinene utføres innen få timer, og grafenbelegg krever bare ca. 15 min for trente forskere. Prøvepreparatet kan sammenlignes med prosedyrene som trengs for fluorescensmikroskopi.

Protokollen kan endres i noen trinn. Grafenen på mikrobrikken kan også tørkes i luften for å sikre at grafen ikke beveger seg når den er blotted med et filterpapir. Hvis grafen er forurenset med salt, er det mulig å la den flyte på overflaten av vann i omtrent en time for å oppløse saltet og dermed minimere forurensning. Ved å forekomme kobber- eller PMMA-kontaminering på grafen kan reduseres ved å utvide de tilsvarende etsetrinnene i protokollen. Andre grafenbeleggmetoder har blitt beskrevet der for eksempel grafen-PMMA ble direkte deponert på celler, og PMMA ble fjernet ved vask i aceton etterpå33. I vår metode ble PMMA fjernet før belegg for å unngå mulig skade på cellene forårsaket av ytterligere acetonvasketrinn. NaCl ble valgt som substrat her fordi det er flatt, så det rynker ikke grafen, og det oppløses i vann for å frigjøre grafen9. Dessuten kan den kuttes i ønsket størrelse og ingen substratrester er igjen på grafen. Men tar disse kriteriene i betraktning, andre substrater som kaliumklorid kan muligens brukes også.

For å redusere sjansen for potensiell etikettindusert klynger, kan GA-fikseringstrinnet implementeres direkte etter FA-fiksering, hvorpå alle membranproteiner immobiliseres. Det første fikseringstrinnet med FA løser allerede den biologiske strukturen, men et redusert nivå av membranproteindiffusjon kan fortsattforekomme 34, noe som muligens fører til etikettindusert klynger på grunn av tilstedeværelsen av flere Streptavidin per QD. Fiksering med GA kan føre til et autofluorescence signal under LM, og er derfor gjort etter LM i den beskrevne protokollen, men kan reduseres som beskrevet andre steder34. Cacodylate buffer er ganske giftig, og andre fikseringsmidler kan også brukes, men cacodylate brukes her som det er en vanlig buffer for EM-protokoller, unngår bunnsprater, forhindrer veksten av bakterielle og sopp, og er kompatibel med kalsiumioner som trengs for å bevare den ultrastrukturelle integriteten til lipidmembraner35. Om nødvendig kan osmiumtetroksid brukes som ekstra fiksering for å stabilisere lipidene. Dette vil bidra til å forbedre kontrasten til cellestrukturen, men også legge til et annet metall til systemet og redusere kontrasten oppnådd på QDs.

Protokollen som er beskrevet her inneholder mange trinn som krever god instruksjon. Noe trening er nødvendig før du håndterer mikrobrikker for å unngå å skrape SiN-overflaten av mikrobrikkene og for å forhindre brudd. Som nevnt tidligere anbefales det å forberede mikrobrikker i duplikater, da SiN-vinduet kan bryte fra tid til annen. Å få det nødvendige antall celler på en mikrobrikke krever også litt erfaring. Belegg cellene med grafen trenger litt trening som det kan være vanskelig å finne riktig vippevinkel for å flyte grafen på vann. Når du fanger grafen fra vann, kan det også være vanskelig å se den tynne grafen. Så snart grafen er på mikrobrikken, må overflødig vann bli ødelagt med et filterpapir. Dette bør bare gjøres med spissen av et filterpapir som for å unngå å fjerne grafen fra mikrobrikken.

Grafenbelegg forhindret artefakter fra å vises på prøven. Men for D < 4 x 102 e-/Å2 oppsto heller ingen gjenstander for den ikke-belagte prøven, og gjenstander dukket opp kun for 2 ikke-belagte prøver. Dermed synes undersøkelser av ikke-belagte celler også mulig, selv om det ville være bedre å bruke grafen og unngå risikoen for artefaktdannelse. Sammensetningen av disse artefaktene kan analyseres i fremtiden for å gi hint om hvordan de kan forhindre dannelsen. Når det gjelder cellenes strukturelle stabilitet ble det bare observert en mindre forbedring av grafenbelegget. De faste cellene ble tilsynelatende stabilisert i de undersøkte tynne områdene, hvor deres struktur var i nærheten av SiN-membranen. Det vi ikke undersøkte her, var imidlertid tørking av gjenstander som er kjent for å forekomme for cellulære prøver når de utsettes for vakuum4. Tørking av cellene ville føre til krymping av cellene slik at også QD-avstandene ville endres som en konsekvens. For elektrondosen som brukes her, forble avstanden til QDer av grafenbelagte og ikke-belagte prøver stabil. Videre studier er nødvendig for å undersøke effekten av grafen belegg på cellene for EM.

En begrensning av denne metoden er at kjemisk fiksering av cellene er nødvendig; Derfor kan ingen levende celleeksperimenter utføres. Men i tilfelle merkingen ikke er nødvendig og celler med høyere strukturell stabilitet brukes, for eksempel bakterier, kan uløste celler omsluttes av grafen for EM36, om enn med en annen elektrondosetoleranse. Proteinene er heller ikke direkte påviselige, så QDs er nødvendig for å visualisere proteinene. Metoden ville ha nytte av mindre etiketter. Et diskusjonspunkt er om det er bra eller dårlig at ultrastrukturen ikke er tydelig synlig. Vår metode ligner fluorescensmikroskopi hvor bare utvalgte proteiner er synlige37. Å øke synligheten av ultrastrukturen vil også legge mye mer informasjon til bildet, og deretter på et tidspunkt hindre påvisning av de enkelte etikettposisjonene. Videre er metoden som er beskrevet her for en proteinart, og tillegg av protokollen er nødvendig for å kunne merke flere proteiner. Sist, metoden fungerer når en liten høy affinitet spesielt bindende molekyl som antistoff mimetic21 eller nanobody38 er tilgjengelig. Vanlige antistoffer er mye større og vil forhindre påvisning av den funksjonelle tilstanden til proteinunderenheter i oligomerer.

Vår metode er nyttig for å studere proteinfunksjon på hele celler ved hjelp av EM mens du holder cellene i hydrert tilstand. Det er lett mulig å undersøke en rekke celler. Andre typer celler og proteiner kan også studeres. Hvis proteinmerking ikke er nødvendig, kan en undergruppe av protokollen brukes til grafenbelegg av et bredt utvalg av biologiske prøver. Evnen til å studere hele celler er relevant i cellulær forskning for å forstå sammenhenger mellom membranproteinfunksjon på molekylært nivå.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker D. B. Peckys for hjelp med cellekulturprotokollen, F. Weinberg for å ha gjennomgått manuskriptet, T. Trampert for hjelp med eksperimentene og figurene, S. Smolka for å få hjelp med tallene, og E. Arzt for hans støtte gjennom INM. Denne forskningen er finansiert av Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. The Transmission Electron Microscope. , Springer. (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , Jones and Barlett Publishers. (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , Springer. (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Tags

Biologi Utgave 163 grafen nanopartikler hele cellen hydrert skanning overføring elektron mikroskopi STEM membran proteiner strålingsskade
Grafenkabinett av kjemisk faste pattedyrceller for flytende fase elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N.… More

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter