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Biology

Involucro di grafene di cellule di mammiferi fissate chimicamente per la microscopia elettronica a fase liquida

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

Qui è presentato un protocollo per etichettare le proteine della membrana nelle cellule dei mammiferi e rivestire il campione con grafene per la microscopia elettronica a trasmissione a scansione in fase liquida. La stabilità dei campioni contro i danni causati dalle radiazioni può anche essere studiata con questo protocollo.

Abstract

Viene descritto un protocollo per studiare il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) nella membrana plasmatica intatta delle cellule del cancro al seno utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione (STEM). Le cellule della linea cellulare skBR3 del cancro al seno dei mammiferi sono state coltivate su microchip di silicio con finestre di nitrato di silicio (SiN). Le cellule sono state fissate chimicamente e le proteine HER2 sono state etichettate con nanoparticelle di punti quantici (QD), utilizzando un protocollo di legame biotina-streptavidin in due passaggi. Le cellule sono state rivestite con grafene multistrato per mantenere uno stato idratato e per proteggerle dai danni del fascio di elettroni durante lo STEM. Per esaminare la stabilità dei campioni nell'irradiazione del fascio di elettroni, è stato eseguito un esperimento di serie di dosi. Sono stati confrontati campioni rivestiti di grafene e non rivestiti. Il danno indotto dal fascio, sotto forma di artefatti luminosi, è apparso per alcuni campioni non rivestiti ad una maggiore dose di elettroni D, mentre nessun artefatto è apparso su campioni rivestiti.

Introduction

L'analisi della funzione proteica della membrana è essenziale per la ricerca biologica cellulare e per lo sviluppo di farmaci. Una classe di importanti esperimenti prevede l'esame delle posizioni delle proteine della membrana nelle cellule. Queste informazioni possono essere utilizzate per dedurre conclusioni sull'assemblaggio di proteine in complessi proteici e sulle loro posizioni specifiche nella membrana plasmatica, che, tramite assemblaggio e smontaggio dinamico, guida un'ampia varietà di funzioni cellulari. Tra le altre tecniche, la microscopia leggera (LM) e la microscopia elettronica (EM) vengono utilizzate per studiare le funzioni proteiche nelle cellule. LM consente l'analisi di intere cellule in liquido; tuttavia, la risoluzione è limitata a 200-300 nm per la microscopia convenzionale e fino a 20 nm per la microscopia a fluorescenza super risoluzione in condizioni pratiche1,2. L'EM fornisce circa 1 risoluzione3, ma la preparazione convenzionale del campione richiede disidratazione, colorazione metallica per migliorare il contrasto dell'immagine e incorporamento in una sostanza di montaggio, come la resina, per la microscopia elettronica di trasmissione (TEM)4. Per conservare campioni biologici in un ambiente più nativo, è possibile utilizzare tecniche crio-EM5,6. I campioni vengono rapidamente congelati in ghiaccio amorfo e, se necessario, sezionati. Un'altra opzione è la frattura del congelamento EM7.

Tecniche EM per lo studio delle proteine della membrana all'interno di cellule intatte nel loro stato nativo, liquido sono emerse negliultimi dieci anni 8,9,10,11. Una risoluzione spaziale di 2 nm è stata raggiunta su proteine di membrana etichettate punto quantico (QD) in cellule intere coltivate su una membrana SiN e racchiuse da uno strato digrafene 9.

Qui, sono descritti i dettagli di un protocollo per l'etichettatura delle proteine e il rivestimentodi grafene 9,12. L'obiettivo di questo protocollo è quello di analizzare la distribuzione spaziale di HER2 nella membrana di cellule intere fisse, preservando le cellule in uno stato idratato. Il rivestimento con grafene impedisce l'essiccazione delle cellule nel vuoto e riduce anche il danno daradiazioni 13. Questo metodo fornisce informazioni sulle proteine della membrana etichettate all'interno della membrana plasmatica intatta, ma il metodo non è utile per studiare l'ultrastruttura cellulare come di solito viene fatto con EM.

Il grafene è il nanomateriale più sottile conosciuto, ed è costituito da un singolo foglio cristallino spesso atomo di carbonio disposto in un reticolo a nido d'ape14. Ha proprietà uniche tra cui alta flessibilità e resistenza meccanica. Recenti ricerche hanno dimostrato che il grafene privo di difetti è impermeabile ai gas e ai liquidi, ma i difetti consentono la permeazionedell'idrogeno 15. Questa perdita può essere ridotta utilizzando il grafene multistrato come usato qui. Il grafene bistrato ha recentemente dimostrato di essere utile come supporto per i campioni crio-EM, migliorando l'omogeneità dello strato di ghiaccio sottile rispetto all'ossido di grafene dove possono essere formati solo strati non uniformi16. È stato inoltre dimostrato che il grafene riduce il danno del fascio di campioni biologici durante la microscopia elettronica a trasmissione infase liquida 13,17. Come esperimento esemplare, HER2 espresso nella linea cellulare del cancro al seno dei mammiferi SKBR3 è stato etichettato con QD18 e la sua distribuzione spaziale registrata utilizzando STEM. Le cellule sono state seme su un microchip Si con una membrana SiNtrasparente elettronica 19. I microchip sono stati scelti come supporto in quanto robusti, compatibili con LM ed EM, e l'intera procedura di etichettatura può essere eseguita direttamente sul microchip19. Dopo l'attacco alla cella, HER2 è stato etichettato con un protocollo di etichettatura in duepassaggi 20. In primo luogo, un composto mimetico anticorpo anti-HER2 biotinilato21 è stato attaccato a HER2. Le cellule sono state quindi fissate chimicamente per prevenire il clustering dei recettori indotti dall'etichetta e per aumentare la stabilità dell'ultrastruttura cellulare. I QD rivestiti di Streptavidin sono stati successivamente collegati al complesso mimetico HER2-antibody. Il segnale di fluorescenza luminosa e il nucleo elettrone-denso dei QD hanno permesso la microscopia correlata alla fluorescenza e all'elettrone (CLEM)20. CLEM è particolarmente utile perché le regioni cellulari di interesse per l'analisi STEM possono essere selezionate dalle immagini di microscopia panoramica a fluorescenza che evidenziano la localizzazione di HER2 sulle cellule. Le cellule sono state analizzate mediante microscopia a fluorescenza per identificare le regioni cellulari con alti livelli di HER2. Successivamente, un foglio di grafene spesso 3-5 strati è stato trasferito sulle celle per il rivestimento9,22. Successivamente, il campione è stato montato in un supporto di campioni EM. I dati STEM sono stati acquisiti utilizzando il rivelatore di campo scuro anulare (ADF), fornendo informazioni sulla distribuzione spaziale di HER2 sulla superficie cellulare rispetto alla posizione della superficie cellulare, ma non fornendo informazioni sull'ultrastruttura della cellula. Per determinare la stabilità del campione nell'irradiazione del fascio di elettroni, i campioni sono stati esaminati a dose crescente (D) in una serie di immagini. È stata studiata la differenza tra campioni rivestiti di grafene e campioni non rivestiti. Sono stati valutati diversi tipi di danni da radiazioni.

Il protocollo qui descritto utilizza la linea cellulare di cancro al seno di mammifero HER2 overexpressing SKBR3 come un sistema modello per il targeting HER223. Il protocollo include la preparazione di un campione rivestito di grafene e di un campione simile, ma senza rivestimento di grafene per il confronto. L'esperimento viene preparato in duplicato poiché la finestra SiN può rompersi una volta ogni tanto e ottenere un duplicato sperimentale nella maggior parte dei casi. La resa complessiva del metodo è elevata, il che significa che i microchip con cellule coperte di grafene sono di solito ottenuti con un errore eccezionale anche se non l'intera finestra SiN può essere coperta di grafene in tutti i casi. I duplicati non sono descritti nel protocollo.

Il protocollo di etichettatura (passaggi da 1 a 5) è paragonabile al protocollo di etichettatura del recettore del fattore di crescita epidermico nelle cellule fibroblasti COS7 pubblicate inprecedenza 24; dettagli in tale documento sono indicati per quanto riguarda la manipolazione dei microchip, e l'uso delle piastre del pozzo. Il seguente protocollo è ottimizzato per l'etichettatura HER2, rivestimento digrafene 9ed esame della tolleranza alle radiazioni del campione.

Protocol

1. Pulizia di microchip e rivestimento con poli-lilina L (PLL) e proteina fibronectina (FLP)

  1. Posizionare due microchip con una membrana SiN (2,0 x 2,6 mm) in 50 mL di acetone. Maneggiare i microchip con attenzione con il lato piatto rivolto verso l'alto. Evitare di rompere i bordi utilizzando una pinzetta a becco piatto. Evitare di toccare la superficie superiore dei microchip durante la manipolazione con una pinzetta per evitare la rottura della finestra SiN.
    NOTA: Si può anche utilizzare politetrafluoroetilene rivestito o pinzette punta di carbonio per prevenire danni dei microchip.
  2. Lavare i chip per 2 minuti scuotendo attentamente il becher, guardando i microchip non capovolgere.
  3. Trasferire i microchip a 50 mL di etanolo e lavare per 2 minuti agitando con attenzione il becher. Assicurarsi che il trasferimento sia rapido in modo che l'acetone in eccesso non si asciughi.
  4. Lavare i microchip con 50 mL di acqua per 10 min.
  5. Immergere i microchip in un becher appena preparato di 20 mL di etanolo.
  6. Posizionare i microchip su un tessuto di camera pulita per l'essiccazione.
  7. Pulire al plasma i microchip con 11,5 sccm O2 e 35 sccm Ar a 70 mTorr e radiofrequenza (RF)-target di 50 W per 5 min.
  8. Posizionare i microchip in una cappa di flusso laminare per il lavoro sterile delle cellule.
  9. Preparare una soluzione di 0,01% PLL in acqua. Preparare una soluzione di 15 G/mL FLP in salina tamponata di fosfati (PBS).
  10. Preparare una piastra di 24 pozzetti sotto il cofano di flusso laminare e riempire 5 pozzetti singolarmente con 1 mL delle soluzioni nel seguente ordine: ben 1 – PLL; pozzo 2 – acqua; pozzo 3 – acqua; pozzo 4 – FLP; bene 5 – PBS e ben 6 – PBS.
    NOTA: Condurre i passaggi di lavaggio immergendo un microchip nel 24 o 96 indicato per alcuni secondi utilizzando una pinzetta. Eseguire le fasi di incubazione incubando i microchip nel pozzo 24 o 96 nella soluzione indicata per il tempo e la temperatura indicati. Trasferire i microchip in un altro pozzo in pochi secondi.
  11. Incubare i microchip nella soluzione PLL per 5 minuti. Quindi lavare i microchip in acqua due volte.
  12. Incubare i microchip in FLP per 5 min. Quindi lavare i microchip in PBS due volte.
  13. Trasferire entrambi i microchip in pozzi (uno per ogni microchip) di una nuova piastra di 96 pozzi precompilata con 50 l di mezzo senza siero per la semina cellulare.
  14. Incubare i microchip a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2 fino a quando non viene preparata la sospensione cellulare.

2. Seminare cellule su microchip a membrana SiN

  1. Impostare tutte le forniture e le attrezzature in un cofano di flusso laminare per garantire il funzionamento sterile.
  2. Lavare la linea cellulare del cancro al seno, SKBR3, in un flacone di coltura cellulare con mezzo di crescita una volta. Utilizzare il mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di siero fetale del polpaccio (FCS) e l'1% di aminoacidi non essenziali (NEAA) come mezzo di crescita.
  3. Incubare le cellule con 1 mL della soluzione di distacco cellulare fino a quando le cellule si sono staccate dal pallone.
  4. Aggiungere 5 mL di mezzo di crescita alle cellule staccate nel pallone. Trasferire questa sospensione in un tubo di centrifuga.
  5. Pipette 20 L della sospensione cellulare in un emocitometro per ottenere la concentrazione cellulare. Utilizzare la formula seguente.
    Equation 1.
  6. Preparare una sospensione delle cellule disperse di 2,5 x 105 celle/mL. Calcolare la quantità necessaria della sospensione delle celle preparate:
    Equation 2
    e riempire con media di crescita al volume desiderato.
  7. Aggiungere 100 L della sospensione cellulare ai due pozzetti di una piastra di 96 pozzi contenente i microchip rivestiti PLL e FLP con la membrana SiN rivolta verso l'alto e 50 L di mezzo senza siero in modo che ogni pozzo contenga 25.000 cellule.
  8. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2 per 5 minuti per attendere che le cellule si alleghino al microchip.
    NOTA: A questo punto, le cellule possono staccarsi dal microchip perché non hanno ancora aderito.
  9. Controllare la densità delle cellule sul microchip con un microscopio invertito. Assicurarsi che le celle coprano la finestra con spazio sufficiente per appiattirsi e aderire (vedere la figura 1A).
    NOTA: Se necessario, è possibile aggiungere più celle a questo punto.
  10. Trasferire i microchip in nuovi pozzi contenenti 200 L di mezzo di crescita e incubare a 37 gradi centigradi e 5% CO2 durante la notte.
  11. Nel pomeriggio del giorno successivo, trasferire entrambi i microchip su mezzo privo di siero (mezzo di fame del siero) se le cellule si sono appiattite e hanno aderito a una confluenza visivamente ispezionata (cioè la frazione dell'area della finestra coperta di celle) di circa 2/3 (vedi Figura 1B). Passare al mezzo privo di siero in base alle esigenze per portare le cellule in una condizione di partenza definita in base alle esigenze per il confronto tra i diversi esperimenti25.
  12. Incubare a 37 gradi centigradi e 5% CO2 durante la notte.
    NOTA: Tieni presente che gli importi delle cellule possono differire a seconda dei tassi di crescita e della morfologia cellulare per altre linee cellulari.

3. Etichettatura e fissaggio HER2

  1. Preparare le soluzioni come descritto nella Tabella supplementare 1.
    1. Lavorare sotto il cofano di flusso laminare per garantire il lavoro sterile. Utilizzare una piastra ben 96 denominata piastra di etichettatura I e riempire 6 pozzetti per microchip con 200 L delle soluzioni I di etichettatura: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, anticorpo mimetico, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Utilizzare una riga (una lettera per riga, ad esempio, da A1 ad A6) della piastra del pozzo per microchip. Riscaldare la piastra di etichettatura a 37 gradi centigradi.
    2. Sotto un cappuccio di fume, preparare una piastra di fissazione da 24 pozzetti, e riempire 8 pozzetti per microchip con 500 L delle soluzioni della piastra di fissazione: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS/glicina, PBS/BSA.
      CAUTION: CB è acutamente tossico per inalazione o ingestione orale ed è pericoloso per le acque. Lavorare sotto il cofano di fumi con un'adeguata protezione e smaltire CB secondo la scheda dati di sicurezza (SDS). La FA è corrosiva e dannosa per la pelle e la salute. Lavorare sotto il cofano di fumi e fare riferimento alla SDS per informazioni sulla movimentazione e lo smaltimento.
    3. Preparare una piastra 96 ben denominata piastra di etichettatura II e riempire 4 pozzetti per microchip con 200 L delle soluzioni II della piastra di etichettatura: QD, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA.
      NOTA: Qui, una piastra di 24 pozzetti viene utilizzata per vedere meglio i microchip nei pozzetti. Per utilizzare meno anticorpi mimetici (passaggio 3.2) e QD (passaggio 3.4), utilizzare 96 piastre di pozzo per questi passaggi.
  2. Etichetta HER2 nelle celle.
    1. Una volta che queste piastre sono pronte, iniziare l'etichettatura inserendo i microchip nei pozzetti della prima fila di piastra di etichettatura 1.
    2. Lavare i microchip con PBS/BSA nella piastra 96 ben contrassegnata come piastra di etichettatura I.
    3. Bloccare i siti non specifici per evitare l'associazione non specifica dell'anticorpo mimetico incubando con PBS/BSA/GS per 5 min a 37 gradi centigradi e 5% CO2.
    4. Incubare con 200 nM anticorpo mimetico per 10 min a 37 gradi centigradi e 5% CO2.
    5. Lavare il microchip tre volte in PBS/BSA.
  3. Fissare le cellule.
    1. Trasferire i microchip nella piastra di fissazione del pozzo 24 nel cofano del fumi.
      NOTA: da qui non è necessario alcun lavoro sterile.
    2. Lavare una volta con CB per alcuni secondi.
    3. Fissare le cellule con 3% FA per 10 min.
    4. Lavare una volta con CB e tre volte con PBS.
    5. Bloccare i gruppi di aldeide liberi di FA incubando con pbS-glicina per 2 min.
    6. Lavare i microchip con PBS-BSA una sola volta.
  4. Allegare i QD.
    1. Spostare i microchip sulla piastra di etichettatura dei 96 well II.
    2. Incubare con 20 NM QD per 12 min.
    3. Lavare due volte i microchip con PBS/BSA.
    4. Conservare i microchip in un pozzo contenente PBS/BSA.

4. Microscopia leggera delle cellule fisse

  1. Preparare un piatto inferiore in vetro di 3,5 cm di diametro con 2 mL di soluzione PBS/BSA.
  2. Prendere i primi microchip, posizionarlo a testa in giù (cellule rivolte verso il basso) nel piatto di fondo di vetro e posizionare il piatto nel microscopio a fluorescenza. Abbassare lentamente il microchip nel liquido per evitare danni alle cellule.
  3. Acquisire immagini di contrasto di interferenza differenziale (DIC) e fluorescenza di ogni microchip con un obiettivo 40x e il canale di fluorescenza appropriato.
    NOTA: Qui, una lunghezza d'onda di eccitazione di 540-580 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 607-683 nm viene utilizzata per rilevare QD655.
  4. Ripetere la procedura per il secondo microchip.

5. Post-fissazione

  1. Eseguire tutti i passaggi sotto il cofano del fumi.
  2. Riempire 6 pozzetti per microchip di una piastra di 96 pozzi con 200 L delle soluzioni di post-fissazione:
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    CAUTION: GA è pericoloso per le acque, dannoso per la pelle, il sistema respiratorio e gli occhi. Lavorare sotto il cofano di fumi e fare riferimento alla SDS per informazioni sulla movimentazione e lo smaltimento.
  3. Posizionare entrambi i microchip nei rispettivi pozzi con le cellule rivolte verso l'alto.
  4. Lavare una volta con CB.
  5. Fissare le cellule con 2% GA per 10 min.
  6. Lavare una volta con CB.
  7. Lavare tre volte con PBS/BSA.
    NOTA: Il primo passaggio di fissazione con FA fissa già la struttura biologica, ma può ancora verificarsi un livello ridotto di diffusione delle proteine della membrana, che potrebbe portare al clustering indotto dall'etichetta a causa della presenza di streptavidin multipli per QD. Mantenere il tempo dei passaggi sperimentali dalla fissazione FA alla GA, quindi, il più breve possibile per ridurre al minimo la diffusione delle proteine nella membrana.
  8. Conservare in PBS/BSA per prevenire gli urti osmotici e lo 0,02% di azide di sodio (NaN3) per prevenire la crescita batterica a 4 gradi centigradi fino al rivestimento di grafene in una nuova piastra di pozzo. Sigillare la piastra con pellicola di paraffina per evitare l'essiccazione. I microchip e le cellule sono stabili fino a 2 settimane quando sono conservati a 4 gradi centigradi.
    CAUTION: NaN3 è pericoloso per le acque e acutamente tossico per ingestione orale, per la pelle e il sistema respiratorio. Lavorare sotto il cofano di fumi e fare riferimento alla SDS per informazioni sulla movimentazione e lo smaltimento.

6. Pulizia e trasferimento del grafene su cristalli di sale

  1. Rimuovere il poli(metile methacrylate) (PMMA)-graphene da PMMA-graphene-on-polymer (Figura 2A).
    1. Pipetta alcune goccioline d'acqua sul polimero intorno al PMMA-grafene.
      NOTA: Assicurarsi che il PMMA-grafene si stacca facilmente dal polimero di supporto mentre galleggia sulla superficie dell'acqua.
    2. Immergete il PMMA-grafene-on-polymer in acqua con un angolo di 30-45 gradi per rilasciare il PMMA-graphene.
      NOTA: Il polimero deve essere solo leggermente bagnato. Pipettare troppa acqua sul polimero solleverà e possibilmente piegherà il PMMA-grafene.
  2. Contaminanti a base di rame Etch utilizzando una soluzione persulfata di sodio (Figura 2B).
    NOTA: il grafene commerciale coltivato su lamina di rame contiene spesso residui di rame sub-micrometrici, che possono essere rimossi con una soluzione di incisione dirame 22.
    1. Preparare una soluzione da 50 mL di 0,42 M di sodio in acqua.
    2. Trasferire il grafene PMMA nella soluzione persulfata di sodio con il lato del grafene verso il basso utilizzando un vetrato di vetro standard. PMMA-graphene fluttuerà sulla parte superiore della soluzione.
    3. Lasciare il PMMA-grafene nella soluzione persulfata di sodio durante la notte.
    4. Rimuovere il PMMA-graphene dalla soluzione persulfata di sodio e posizionarlo sopra l'acqua pulita utilizzando uno scivolo di vetro. Lascialo galleggiare sull'acqua per mezz'ora.
    5. Ripetere il passaggio precedente per un totale di tre volte per rimuovere tutti i residui di persulfato di sodio dal PMMA-grafene.
  3. Trasferire il PMMA-grafene su un cristallo di cloruro di sodio (NaCl).
    1. Preparare una soluzione satura di NaCl in acqua in un piatto Petri.
    2. Trasferire il PMMA-grafene sopra la soluzione NaCl con il lato del grafene verso il basso utilizzando una vetrata.
    3. Tenere un cristallo NaCl con una pinzetta e prendere il pmMA-grafene galleggiante.
      NOTA: La dimensione del cristallo NaCl deve essere leggermente maggiore delle dimensioni del PMMA-grafene per evitare di piegare il grafene sporgente sul bordo del sale o di contattare il grafene con una pinzetta. In questi esperimenti il cristallo NaCl di 12 mm x 12 mm x 0,5 mm viene utilizzato per raccogliere un foglio di grafene da 10 mm x 10 mm e sostenerlo in seguito.
    4. Tenere il PMMA-graphene-on-salt verticalmente per 2 minuti per far fluire l'acqua in eccesso.
    5. Lasciare asciugare il PMMA-grafene-on-sale a temperatura ambiente per 30 minuti e cuocerlo in forno a 100 gradi per 20 minuti per rimuovere completamente l'acqua.
  4. Rimuovere PMMA utilizzando un lavaggio di acetone (Figura 2C).
    1. Preriscaldare l'acetone in un piatto di Petri di vetro a 50 gradi centigradi su una piastra calda nel cappuccio dei fumi. Osservare attentamente la temperatura per evitare il fuoco.
    2. Immergere il PMMA-graphene-on-salt nel piatto Petri riempito con acetone e lasciare sciogliere il PMMA per 30 min.
    3. Ripetere il passaggio precedente per un totale di tre volte con acetone nuovo e pulito.
    4. Lasciare asciugare accuratamente il grafene-on-sale all'aria prima di usarlo per la preparazione del campione.

7. Rivestimento di grafene

NOTA: la procedura di rivestimento del grafene è illustrata schematicamente nella Figura 3A.

  1. Lavare un microchip preparato con celle fisse ed etichettato HER2 in acqua pura per rimuovere eventuali residui di sale dal tampone. Posizionare il microchip su una carta da filtro. Le celle sono visibili come macchie scure (Figura 3B).
  2. Tagliare il grafene multistrato sul cristallo NaCl in un pezzo che si adatta alla finestra SiN di un microchip utilizzando una lama di rasoio.
  3. Preparare un bicchiere di acqua pura e rimuovere il grafene dal cristallo NaCl inclinando il cristallo di circa 45 gradi rispetto alla superficie dell'acqua e toccando l'acqua. Il grafene fluttuerà sulla superficie dell'acqua (Figura 3C).
  4. Catturare il grafene con un anello metallico dalla superficie dell'acqua. Il grafene fluttuerà all'interno della goccia sotto il ciclo (Figura 3D).
  5. Toccare la superficie superiore del microchip con la superficie del loop inferiore. Il microchip si atterrà al loop metallico. Il grafene può essere visto in cima al microchip (Figura 3E).
  6. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare carta filtro per rimuovere l'acqua rimanente dal microchip, in modo che il grafene copra tutte le cellule della finestra SiN.
    NOTA: il grafene si muoverà quando cancellato. Assicurati che il grafene rimanga nella parte superiore della finestra toccando il microchip solo con il bordo della carta da filtro.
  7. Utilizzare una pinzetta per rimuovere il microchip dal loop metallico e posizionarlo su una carta da filtro. Il grafene è visibile come un luccichio viola sul microchip (Figura 3F).
  8. Trasferire il microchip dalla carta in un piatto Petri scomparto.
  9. Pipetta una goccia d'acqua in uno dei compartimenti liberi e chiudere il coperchio per fornire un'atmosfera satura d'acqua.
  10. Sigillare il piatto del vano con pellicola di paraffina e conservarlo in frigorifero a 4 gradi centigradi, se necessario, per ulteriori misurazioni.

8. STELO

  1. Regolare l'STEM a 200 kV di energia del fascio utilizzando un campione di allineamento/test per una dimensione della sonda di almeno 0,2 nm regolando le lenti a condensatore, una corrente di sonda I - 180 pA (le informazioni sulla corrente della sonda per diverse impostazioni del microscopio sono fornite dal produttore entro una precisione del 5%) e un semi-angolo di convergenza di 13,2 mrad inserendo un'apertura. Impostare l'intervallo semiangolare di apertura del rivelatore ADF STEM (interno ed esterno) su 68-280 mrad regolando le impostazioni dell'obiettivo del proiettore. Impostare le dimensioni dell'immagine STEM su 2048 x 2048 pixel e il tempo di dimora dei pixel t .
  2. Caricare il microchip con cellule rivestite di grafene in un supporto di campioni standard per TEM in modo tale che le cellule siano rivolte verso l'alto.
  3. Caricare il supporto nel microscopio elettronico.
  4. Acquisire un'immagine di panoramica in fase di ingrandimento (M) - 800x (Figura 4) utilizzando le impostazioni del passaggio 8.1.
  5. Identificare un'area di interesse in una cella.
  6. Immagine dei QD con un rilevatore ADF in M : 80.000x con una dimensione in pixel d - 1,3 nm (Figura 4) utilizzando le impostazioni nel passaggio 8.1.
  7. Acquisire un'immagine dell'area dopo l'esposizione con un ingrandimento inferiore (qui, M - 50.000x) per mostrare l'area esposta (Figura 4).
  8. Calcolare la dose di elettroni
    Equation 3
    dove e è la carica elementare. Con le impostazioni di cui sopra,
    Equation 4
    e un errore del 5%.
  9. Acquisire 20 immagini per una serie di dosi con le stesse impostazioni, ma con t
    Equation 20.
  10. Per confermare la presenza di grafene, impostare M il microscopio su TEM a 1.200x, selezionare una regione vicino a una cella e passare alla modalità diffrazione. Registrare un modello di diffrazione in un momento di esposizione di 0,5 s, 2048 x 2048 x 3 pixel e un'apertura di area selezionata di 50 m (Figura 4).
  11. Al termine della sessione, togliere il campione dal microscopio, rimettirlo nel piatto del compartimento, sigillare il piatto con pellicola di paraffina e conservarlo in frigorifero a 4 gradi centigradi, se necessario, per ulteriori misurazioni.
  12. Selezionare il secondo microchip preparato allo stesso modo del primo microchip ma senza rivestimento in grafene.
  13. Ripetere i passaggi 8.2-8.11 ma ora per questo esempio. Registrare un modello di diffrazione con le stesse impostazioni di quanto sopra, come confronto (Figura 4).

9. Analisi

NOTA: per il rilevamento automatico delle posizioni QD in un'immagine STEM, l'analisi utilizza un plugin di progettazione locale per ImageJ (NIH), come descritto altrove20. Il plugin è disponibile su richiesta.

  1. Il software applica automaticamente i seguenti passaggi per rilevare le particelle in un'immagine STEM:
    1. Applicate un filtro gaussiano per ridurre il rumore dei pixel.
    2. Applicare un filtro del pass di banda Fast Fourier Transform (FFT) per ottenere solo nanoparticelle.
    3. Impostare una soglia per il file binario dell'immagine.
    4. Utilizzare un diametro di particella di 10 nm con un fattore di tolleranza di 2 per il rilevamento delle particelle.
    5. Rilevare le posizioni delle particelle.
  2. Misurare la distanza da centro a centro tra dieci coppie di QD per serie. Qui, sono state misurate 10 distanze con dimensioni variabili per serie.
  3. Calcolate la variazione relativa della distanza delle particelle confrontando ogni distanza di particelle con la distanza nella prima immagine utilizzando:
    Equation 5.

Representative Results

La figura 1A mostra le celle di cui è stato effettuato il seeding in modo tale che la finestra sia coperta ma con spazio sufficiente per consentire loro di appiattire e aderire, portando a una confluenza di circa 2/3rd (Figura 1B). Nel caso in cui troppe cellule siano seme su un microchip (Figura 1C), non c'è spazio sufficiente per tutte le cellule per aderire al microchip. La figura 1D mostra lo stesso microchip dopo 24 h. Più della metà delle cellule non si è appiattita. D'altra parte, se vengono testate troppo poche celle (Figura 1E), la finestra SiN finirà con un grande spazio vuoto dopo 24 h come si vede nella Figura 1F. Nella figura 1G viene illustrata l'immagine DIC delle celle nella Figura 1A e nella Figura 1B. La figura 1H mostra l'immagine di fluorescenza corrispondente falsa colorata in giallo che indica la corretta etichettatura di HER2.

I dati STEM rappresentativi sono illustrati nella Figura 4. Sono state studiate le celle SKBR3 rivestite di grafene (colonna sinistra) e non rivestite (colonna destra). Figura 4A,B mostra le immagini di panoramica di M e 800x delle celle nella finestra. Le aree mostrate come inset sono state visualizzate in M - 80.000x durante la serie di dosi, vedere la figura 4C,D. I QD sono visibili come punti luminosi qui. Figura 4E e Figura 4F mostrano M - 50.000x immagini ingrandite acquisite nelle posizioni dei rettangoli nella figura 4C,D. Entrambe le immagini sono state registrate3 dopo l'acquisizione di una seriedidosi con D .- La serie di dosi è stata registrata a M 80.000x. Le aree esposte possono essere riconosciute come rettangoli, in base ai quali il rettangolo era chiaramente visibile per il campione non rivestito (Figura 4F).

Per verificare la presenza di grafene, sono stati acquisiti modelli di diffrazione delle aree senza celle, ma con o senza grafene nella finestra SiN. La struttura esagonale del grafene è stata osservata nel modello di diffrazione del campione rivestito digrafene ( Figura 4G), mentre era assente per il campione non rivestito (Figura 4H). Il modello di diffrazione del grafene a cristallo singolo avrà una simmetria sei volte più volte dovuta alla struttura esagonale altamente ordinata del grafene. Quindi, la struttura esagonale indica la presenza di grafene sui campioni.

Per studiare l'effetto dell'illuminazione del fascio di elettroni sul campione, le immagini STEM sono state acquisite in una serie di immagini con una dose di elettroni accumulata. I risultati rappresentativi per i campioni non rivestiti e rivestiti di grafene sono illustrati rispettivamente nella Figura 5A-D e nella Figura 5E-G. Tutti i dati sono stati acquisiti sul bordo della cellula, dove la cellula è la più piatta, e la struttura osservata è quindi la più vicina alla membrana SiN. L'esposizione di un campione non rivestito ha portato ad una struttura luminosa che appaiono sulle superfici cellulari a D ( 1,9 x 0,1) x 103 e-/2 (Figura 5B). Queste strutture sono diventate più grandi con dosi più elevate, quindi erano chiaramente visibili nell'ultima immagine della serie a D - (7,8 x 0,4) x 103 e-/2 (Figura 5C,D). Queste macchie non sono apparite su nessuno dei campioni rivestiti di grafene (Figura 5E-G).

Ulteriori microchip sono stati preparati ed esaminati utilizzando il protocollo descritto in precedenza. Sono stati studiati in totale sei campioni rivestiti e sette campioni non rivestiti. Due campioni non rivestiti su sette hanno mostrato questi manufatti. Nessuno dei campioni rivestiti ha mostrato ulteriori punti luminosi.

Come un'altra misura dei danni da radiazioni, è stata esaminata la distanza tra i QD. Se si verificasse un danno strutturale, ci si aspetterebbe che le distanze tra i QD cambino. I cambiamenti nelle distanze sono stati misurati per diverse coppie di QD con l'accumulo di D per un intervallo di distanze di coppia. La figura 5H mostra che la variazione relativa delle particelle per i campioni non rivestiti è rimasta in media inferiore all'1,3%, mentre la distanza relativa media è rimasta inferiore allo 0,8% per i campioni rivestiti. Si può quindi concludere che il rivestimento del grafene ha stabilizzato il campione, ma anche i campioni essiccati senza rivestimento di grafene erano notevolmente stabili.

Figure 1
Figura 1: semina cellulare su una finestra SiN di un microchip di silicio ed etichettata HER2. (A) Immagine esemplare di un'area della finestra SiN con celle SKBR3 5 min dopo la seeding sul microchip. (B) Le stesse cellule si diffondono sulla stessa finestra SiN dopo 24 h. (C) SKBR3 cellule su un Si microchip 5 min dopo la semina. (D) Stesse celle come in (C) dopo 24 h. Le cellule non si appiattivano correttamente perché c'erano troppe cellule sulle patatine al momento della semina. (E) Cellule su un microchip 5 min dopo la semina. (F) Solo poche celle erano visibili sulla finestra perché troppo poche cellule sono state seme sul microchip. (G) IMMAGINE DIC delle stesse celle SKBR3 dopo l'etichettatura QD di HER2. (H) Immagine di sovrapposizione di DIC e immagine di fluorescenza corrispondente di celle SKBR3 etichettate con HER2-QD655 (falso colore in giallo). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Pulizia e trasferimento del grafene sui cristalli NaCl. (A) PMMA-graphene-on-polymer è immerso in acqua pura per rilasciare grafene PMMA. PMMA-graphene può essere catturato con uno scivolo di vetro. (B) Le contaminazioni a base di rame sono state incisi utilizzando una soluzione persulfata di sodio. Per pulire il grafene, è stato trasferito a un becher contenente acqua deionizzata. Questi passaggi sono stati ripetuti 3 volte. Il PMMA-graphene è stato poi trasferito alla soluzione satura di NaCl in acqua pura. Un cristallo NaCl è stato utilizzato per raccogliere il grafene dalla soluzione salina. (C) Il grafene PMMA sul cristallo NaCl è stato essiccato per 30 min a temperatura ambiente. PMMA è stato rimosso incubando il blocco in acetone per 30 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rivestimento di grafene di cellule semitesse su un microchip Si. (A) Procedura di rivestimento in grafene. Il grafene sul cristallo NaCl viene rilasciato sulla superficie dell'acqua. Il pezzo di grafene viene poi catturato con un anello metallico e trasferito sul microchip Si. (B) Microchip (2,0 x 2,6 mm) con una finestra SiN di dimensioni 400 x 160 m senza grafene. Le cellule SKBR3 erano visibili come macchie scure. (C) Grafene (cerchio rosso) galleggiante sulla superficie di un becher riempito d'acqua. (D) Grafene catturato con un anello metallico. (E) Il microchip collegato alla goccia d'acqua in modo che il grafene fosse in cima alla finestra SiN. (F) Microchip dopo il rivestimento di grafene. Il grafene era visibile come un luccichio viola. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: STEM di celle SKBR3 rivestite in grafene e non rivestite nella finestra SiN. (A) Immagine STEM di un campione rivestito di grafene acquisito in corrispondenza di un'immagine STEM M - 800x. (B) di un campione non rivestito acquisito a M - 800x. (C) M - 80.000x immagine registrata nella posizione del rettangolo blu in A. Le linee gialle rappresentano le distanze di esempio misurate all'interno della particella. (D) M - 80.000x immagine registrata nella posizione del rettangolo blu in B. Linea gialla rappresenta esempi di distanze misurate all'interno delle particelle. (E) M - 50.000x di immagine della stessa regione di C esposta a D : (7,8-0,4) x 103 e-/2. (F) M - 50.000x immagine della stessa regione di D ed esposta a D : (7,8-0,4) x 103 e-/2. L'area esposta è stata chiaramente vista. (G) Modello di diffrazione di un campione rivestito di grafene da un'area senza celle. La simmetria sei volte del grafene è visibile come macchie luminose. (H) Modello di diffrazione di un campione senza grafene che non mostra macchie luminose pieghevoli. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Manufatti derivanti da campioni senza rivestimento di grafene. (A) Prime immagini di regioni su campioni senza rivestimento di grafene acquisiti a M - 80.000x ed esposti a D - (0,39 x 0,02) x 102 e-/2. (B) Immagini con i primi artefatti che sorgono in D : (1,94 x 0,1) x 103 e-/2 (frecce gialle). (C, D) Ultima immagine della serie acquisita con D , (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. I manufatti erano visibili come punti luminosi. (E-G) Campioni rivestiti di grafene senza artefatti derivanti. (E) D ( 0,39 x 0,02) x 102 e-/2 (F) D ( 1,94 x 0,1) x 103 e-/2 (G) D ( 7,8 - 0,4) x 103 e-/2. (H) Variazione relativa delle distanze delle particelle per campioni rivestiti di grafene e non rivestiti. Sono stati analizzati due campioni non rivestiti che mostrano manufatti, uno dei quali mostrato in (A-C), e l'ultima immagine del secondo campione in D, nonché tre campioni rivestiti (uno è mostrato in E-G). In totale, sono state esaminate dieci coppie QD per campione con distanze che vanno da 250 nm a 3 m. La modifica relativa riflette la media di tutte le misurazioni in un gruppo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Ricette per soluzioni e buffer. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Per comprendere meglio la funzione proteica, è importante ottenere informazioni sulle posizioni delle proteine nella membrana plasmatica delle cellule intatte. I metodi per ottenere queste informazioni includono la microscopia a fluorescenzasuper-risoluzione 1,2. Anche se la microscopia super-risoluzione si è ulteriormente sviluppata negli ultimi anni, la sua risoluzione è ancora limitata a circa 20 nm per le condizioni pratiche degli esperimenti cellulari, mentre le proteine recettoriali tipiche hanno dimensioni nell'intervallo di 1-10 nm. L'imaging delle proteine a livello di singola cellula e singola molecola con una risoluzione sufficiente per visualizzare le proteine è possibile con EM. Ma a causa del sesscio, i metodi EM convenzionali in genere non lasciano la cellulaintatta 26, il che porta alla perdita di informazioni importanti sul contesto e la distribuzione spaziale delle proteine nella membrana plasmatica. Metodi per intere cellule con crio-TEM sono statisviluppati 6, è possibile combinare l'etichettatura delle proteine con crio-EM27, anche crio-STEM è stato dimostrato28. Tuttavia, i flussi di lavoro crio-EM sono ottimizzati per studiare l'ultrastruttura cellulare e la struttura proteica, e non tanto per analizzare le distribuzioni spaziali delle proteine della membrana. L'essiccazione dei punti critici è un altro metodo di preparazione dell'intera cellula, ma i campioni sono sottoposti a diversi passaggi di essiccazione e la tecnica richiedemolto tempo 29. Le proteine della membrana sono state esaminate anche tramite la frattura dicongelamento 7. In questo metodo, le cellule sono fisse, congelate e fratturate. Le parti fratturate vengono replicate da strati di carbonio e platino e il campione biologico viene rimosso. Le repliche possono quindi essere analizzate con EM30. L'analisi dell'intera cellula è impossibile con la frazione di congelamento perché le informazioni sulla distribuzione delle proteine nella membrana nel contesto dell'intera cellula vengono perse.

Il metodo qui presentato permette di studiare la membrana cellulare senza dover tagliare a sottile ilcampione 9,31. Le cellule sono mantenute intatte in modo che la localizzazione delle proteine della membrana sia visibile dalle immagini di fluorescenza, che sono correlate con le immagini EM. Lo studio delle proteine a livello di singola cellula e singola molecola all'interno di cellule intatte in stato idratato ha dimostrato di essere possibile con una risoluzione di 2 nm utilizzando STEM di proteine etichettate QD utilizzando questo metodo di recinzione di grafene9. Mantenere le cellule nel loro stato nativo è fondamentale, in quanto preserva la distribuzione spaziale delle proteine della membrana in modo tale che le analisi siano possibili a livello di singola cellula e singola molecola, che è importante per comprendere le funzioni proteiche e sviluppare nuovi farmaci per gli approcci terapeutici.

Un altro aspetto critico dell'imaging di campioni biologici con EM è il danno da radiazioni dei campioni causati dal fascio di elettroni. Le soluzioni spesso includono la riduzione del più possibile della dose di elettroni o vari metodi di rivestimento, come l'incapsulamento del campione tra sottili strati di carbonio32. Il nostro metodo mostra che il rivestimento di grafene riduce gli artefatti indotti dal fascio che emergono sulla superficie cellulare per i campioni non rivestiti. L'esame dei campioni biologici rivestiti chimicamente fissi e rivestiti di grafene è possibile sotto l'irradiazione del fascio di elettroni a 200 keV energia del fascio fino a D - (7,8-0,4) x 103 e-/2 senza danni da radiazioni, come macchie luminose, che appaiono sul campione. Rispetto ad altri metodi EM che comportano una preparazione elaborata del campione, ad esempio colorazione, incorporamento, sezionazione (crio-), fratturazione, ecc., il metodo qui descritto richiede meno tempo. L'etichettatura delle proteine viene eseguita entro poche ore e il rivestimento del grafene richiede solo circa 15 minuti per i ricercatori qualificati. La preparazione del campione è paragonabile alle procedure necessarie per la microscopia a fluorescenza.

Il protocollo può essere modificato in alcuni passaggi. Il grafene sul microchip può anche essere essiccato all'aria per assicurarsi che il grafene non si muova quando è macchiato da una carta da filtro. Se il grafene è contaminato dal sale, è possibile lasciarlo galleggiare sulla superficie dell'acqua per circa un'ora per sciogliere il sale e quindi ridurre al minimo la contaminazione. La contaminazione da rame o PMMA sul grafene può essere ridotta estendendo le corrispondenti fasi di incisione nel protocollo. Altri metodi di rivestimento del grafene sono stati descritti dove, ad esempio, il grafene-PMMA è stato depositato direttamente sulle cellule, e il PMMA è stato rimosso lavando in acetone inseguito 33. Nel nostro metodo, PMMA è stato rimosso prima del rivestimento per evitare eventuali danni alle cellule causati da ulteriori passaggi di lavaggio dell'acetone. NaCl è stato scelto come substrato qui perché è piatto, quindi non rughe il grafene, e si scioglie in acqua per rilasciare il grafene9. Inoltre, può essere tagliato nella dimensione desiderata e nessun residuo di substrato viene lasciato sul grafene. Ma tenendo conto di questi criteri, possono essere utilizzati anche altri substrati come il cloruro di potassio.

Per ridurre la possibilità di un potenziale clustering indotto dall'etichetta, la fase di fissazione GA può essere implementata direttamente dopo la fissazione della FA, dopo di che tutte le proteine della membrana vengono immobilizzate. Il primo passo di fissazione con FA fissa già la struttura biologica, ma un livello ridotto di diffusione della proteina della membrana puòancora verificarsi 34, possibilmente portando al clustering indotto dall'etichetta a causa della presenza di più Streptavidin per QD. La fissazione con GA può portare a un segnale di autofluorescenza durante LM, ed è, pertanto, fatto dopo LM nel protocollo descritto, ma può essere ridotto come descrittoaltrove 34. Buffer cacodilato è abbastanza tossico, e altri fissativi possono essere utilizzati pure, ma cacodylate viene utilizzato qui come è un buffer comunemente usato per protocolli EM, evita precipitati, impedisce la crescita di batteri e funghi, ed è compatibile con gli ioni di calcio che sono necessari per preservare l'integrità ultrastrutturale delle membranelipidiche 35. Se necessario, l'osmio tetroxide può essere utilizzato come fissazione aggiuntiva per stabilizzare i lipidi. Ciò contribuirebbe a migliorare il contrasto della struttura cellulare, ma aggiungerebbe anche un altro metallo al sistema e ridurrebbe il contrasto ottenuto sui QD.

Il protocollo descritto di seguito contiene molti passaggi che richiedono una buona istruzione. È necessario un certo allenamento prima di maneggiare microchip per evitare di graffiare la superficie SiN dei microchip e per prevenire la rottura. Come accennato in precedenza, si consiglia di preparare microchip in duplicati in quanto la finestra SiN può rompersi di volta in volta. Ottenere il numero richiesto di cellule su un microchip richiede anche una certa esperienza. Rivestire le cellule con grafene ha bisogno di un po 'di formazione in quanto può essere difficile trovare l'angolo di inclinazione destra per galleggiare grafene sull'acqua. Quando si cattura il grafene dall'acqua, può anche essere difficile vedere il grafene sottile. Non appena il grafene è sul microchip, l'acqua in eccesso deve essere cancellata con una carta da filtro. Questo dovrebbe essere fatto solo con la punta di una carta da filtro tale da evitare di rimuovere il grafene dal microchip.

Il rivestimento del grafene ha impedito la visualizzazione di artefatti sul campione. Ma per D < 4 x10 2 e -/2 non sono emersi artefatti per il campione non rivestito, e gli artefatti sono apparsi solo per 2 campioni non rivestiti.- Pertanto, anche gli esami delle cellule non rivestite sembrano possibili, anche se sarebbe meglio usare il grafene ed evitare il rischio di formazione di artefatti. La composizione di questi manufatti può essere analizzata in futuro per dare suggerimenti su come prevenire la loro formazione. Per quanto riguarda la stabilità strutturale delle cellule è stato osservato solo un piccolo miglioramento del rivestimento di grafene. Le cellule fisse erano apparentemente stabilizzate nelle aree sottili esaminate, dove la loro struttura era in prossimità della membrana SiN. Ciò che non abbiamo esaminato qui, tuttavia, erano artefatti di essiccazione che sono noti per verificarsi per campioni cellulari quando esposti al vuoto4. L'essiccazione delle cellule porterebbe al restringimento delle cellule in modo che anche le distanze QD cambino di conseguenza. Per la dose di elettroni qui utilizzata, la distanza dei QD di campioni rivestiti di grafene e non rivestiti è rimasta stabile. Sono necessari ulteriori studi per esaminare l'effetto del rivestimento di grafene sulle cellule per EM.

Una limitazione di questo metodo è che la fissazione chimica delle cellule è necessaria; pertanto, non è possibile eseguire esperimenti in cellule vive. Ma nel caso in cui l'etichettatura non sia necessaria e si usino cellule con una maggiore stabilità strutturale, ad esempio i batteri, le cellule non rappresentate possono essere racchiuse nel grafene per EM36 anche se con una diversa tolleranza alla dose di elettroni. Inoltre, le proteine non sono rilevabili direttamente, quindi sono necessari QD per visualizzare le proteine. Il metodo trarrebbe vantaggio da etichette più piccole. Un punto di discussione è se è buono o cattivo che l'ultrastruttura non sia chiaramente visibile. Il nostro metodo è simile a quello della microscopia a fluorescenza in cui sono visibili solo le proteine selezionate37. Aumentando la visibilità dell'ultrastruttura si aggiungono anche molte più informazioni all'immagine, e quindi a un certo punto si impedisce il rilevamento delle singole posizioni delle etichette. Inoltre, il metodo qui descritto è per una specie proteica, e sono necessarie aggiunte del protocollo per essere in grado di etichettare più proteine. Infine, il metodo funziona quando è disponibile una piccola molecola ad alta affinità che lega specificamente molecola come l'anticorpo mimetico21 o nanocorpo38. Gli anticorpi comunemente usati sono molto più grandi e impedirebbe il rilevamento dello stato funzionale delle sottounità proteiche negli oligomeri.

Il nostro metodo è utile per studiare la funzione proteica su cellule intere utilizzando EM mantenendo le cellule in stato idratato. È facilmente possibile esaminare serie di cellule. Altri tipi di cellule e proteine possono essere studiati pure. Se non è necessaria l'etichettatura delle proteine, un sottoinsieme del protocollo può essere utilizzato per il rivestimento di grafene di un'ampia varietà di campioni biologici. La capacità di studiare intere cellule è rilevante nella ricerca cellulare per comprendere le correlazioni della funzione della proteina della membrana a livello molecolare.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo D. B. Peckys per l'aiuto con il protocollo di coltura cellulare, F. Weinberg per la revisione del manoscritto, T. Trampert per aiuto con gli esperimenti e le figure, S. Smolka per aiuto con le figure, e E. Arzt per il suo sostegno attraverso INM. Questa ricerca è finanziata da Else Kroner-Fresenius-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

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References

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Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

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