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Biology

Gabinete de grafeno de células mamíferas quimicamente fixas para microscopia eletrônica de fase líquida

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

Apresentado aqui é um protocolo para rotular proteínas de membrana em células de mamíferos e revestir a amostra com grafeno para microscopia eletrônica de transmissão de transmissão de fase líquida. A estabilidade das amostras contra os danos causados pela radiação também pode ser estudada com este protocolo.

Abstract

Um protocolo é descrito para investigar o receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) na membrana plasmática intacta das células cancerígenas de mama usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM). Células da linha de células cancerígenas de mama de mamíferos SKBR3 foram cultivadas em microchips de silício com janelas de nitreto de silício (SiN). As células foram quimicamente fixas, e as proteínas HER2 foram rotuladas com nanopartículas de ponto quântico (QDs), usando um protocolo de ligação biotina-streptavidina de duas etapas. As células foram revestidas com grafeno multicamadas para manter um estado hidratado, e para protegê-las contra danos causados pelo feixe de elétrons durante o STEM. Para examinar a estabilidade das amostras sob irradiação do feixe de elétrons, foi realizado um experimento de série de doses. Foram comparadas amostras revestidas de grafeno e não revestidas. Os danos induzidos pelo feixe, na forma de artefatos brilhantes, apareceram para algumas amostras não revestidas no aumento da dose de elétrons D,enquanto nenhum artefato apareceu em amostras revestidas.

Introduction

A análise da função proteica da membrana é essencial para a pesquisa biológica celular e para o desenvolvimento de medicamentos. Uma classe de experimentos importantes envolve o exame de posições de proteína de membrana nas células. Essas informações podem ser usadas para deduzir conclusões sobre a montagem de proteínas em complexos proteicos e seus locais específicos na membrana plasmática, que, através de montagem dinâmica e desmontagem, impulsiona uma grande variedade de funções celulares. Entre outras técnicas, microscopia leve (LM) e microscopia eletrônica (EM) são utilizadas para estudar funções proteicas em células. O LM permite a análise de células inteiras em líquido; no entanto, a resolução é restrita a 200-300 nm para convencional e até 20 nm para microscopia de fluorescência de super resolução em condições práticas1,,2. EM fornece cerca de 1 Å resoluções3,mas a preparação convencional da amostra requer desidratação, coloração metálica para melhorar o contraste da imagem e incorporação em uma substância de montagem, como resina, para microscopia eletrônica de transmissão (TEM)4. Para preservar amostras biológicas em um ambiente mais nativo, as técnicas crio-EM podem ser utilizadas5,,6. As amostras são rapidamente congeladas em gelo amorfo, e, se necessário, seccionadas. Outra opção é o EM7 defraturamento de congelamento .

Técnicas em EM para estudar proteínas de membrana dentro de células intactas em seu estado líquido nativo surgiram na última década8,9,10,11. Uma resolução espacial de 2 nm foi alcançada em proteínas de membrana rotuladas de ponto quântico (QD) em células inteiras cultivadas em uma membrana SiN e fechadas por uma camada de grafeno9.

Aqui, são descritos detalhes de um protocolo para rotulagem de proteínas e revestimento de grafeno9,12. O objetivo deste protocolo é analisar a distribuição espacial de HER2 na membrana de células fixas inteiras, preservando as células em estado hidratado. O revestimento com grafeno evita a secagem das células no vácuo, e também reduz os danos causados pela radiação13. Este método fornece informações sobre proteínas de membrana rotuladas dentro da membrana plasmática intacta, mas o método não é útil para estudar a ultraestrutura celular, como geralmente é feito com EM.

O grafeno é o nanomaterial mais fino conhecido, e consiste em uma única folha cristalina de espessura de átomo de carbono disposta em uma rede de favo de mel14. Possui propriedades únicas, incluindo alta flexibilidade e resistência mecânica. Pesquisas recentes mostraram que o grafeno livre de defeitos é impermeável a gases e líquidos, mas defeitos permitem a permeação de hidrogênio15. Este vazamento pode ser reduzido usando grafeno multicamadas como usado aqui. O grafeno bicamado mostrou-se recentemente útil como suporte para amostras de crio-EM, melhorando a homogeneidade da fina camada de gelo em comparação com o óxido de grafeno, onde apenas camadas não uniformes podem ser formadas16. O grafeno também foi mostrado para reduzir os danos do feixe de amostras biológicas durante a microscopia eletrônica de transmissão em fase líquida13,17. Como um experimento exemplar, o HER2 expresso na linha de células cancerígenas de mama de mamíferos SKBR3 foi rotulado com QDs18 e sua distribuição espacial registrada usando STEM. As células foram semeadas em um microchip Si com uma membrana SiN transparentede elétrons 19. Os microchips foram escolhidos como suporte, pois são robustos, compatíveis com LM e EM, e todo o procedimento de rotulagem pode ser realizado diretamente no microchip19. Após o anexo da célula, o HER2 foi rotulado com um protocolo de rotulagem de duas etapas20. Primeiro, um composto mimético anti-HER2 biotinilado21 foi anexado ao HER2. As células foram então quimicamente fixadas para evitar o agrupamento de receptores induzidos pelo rótulo, e para aumentar a estabilidade da ultraestrutura celular. QDs revestidos de streptavidin foram posteriormente ligados ao complexo mimético de anticorpos HER2. O sinal de fluorescência brilhante e o núcleo eletrônico-denso dos QDs permitiram a fluorescência correlativa e a microscopia eletrônica (CLEM)20. O CLEM é especialmente útil porque as regiões de interesse celular para a análise de STEM podem ser selecionadas a partir da visão geral imagens de microscopia de fluorescência destacando a localização de HER2 nas células. As células foram analisadas por microscopia de fluorescência para identificar regiões celulares com altos níveis de HER2. Depois disso, uma folha de grafeno de 3-5 camadas de espessura foi transferida para as células para revestimento9,22. Posteriormente, a amostra foi montada em um suporte de espécime EM. Os dados STEM foram adquiridos utilizando-se o detector de campo escuro anular (ADF), fornecendo informações sobre a distribuição espacial de HER2 na superfície celular em relação à localização da superfície celular, mas não fornecendo informações sobre a ultraestrutura da célula. Para determinar a estabilidade da amostra sob irradiação do feixe de elétrons, as amostras foram examinadas em dose crescente (D) em uma série de imagens. Foi investigada a diferença entre amostras revestidas de grafeno e não revestidas. Vários tipos de danos causados por radiação foram avaliados.

O protocolo descrito aqui usa a linha de células cancerígenas de mama her2 superexpressivas DE mamíferos SKBR3 como um sistema modelo para atingir HER223. O protocolo inclui a preparação de uma amostra revestida de grafeno, e uma amostra semelhante, mas sem revestimento de grafeno para comparação. O experimento é preparado em duplicata, uma vez que a janela SiN pode quebrar de vez em quando, e para obter uma duplicata experimental na maioria dos casos. O rendimento geral do método é alto, o que significa que microchips com células cobertas de grafeno são geralmente obtidos com um erro excepcional, embora nem toda a janela SiN possa ser coberta com grafeno em todos os casos. Duplicatas não são descritas no protocolo.

O protocolo de rotulagem (etapas 1-5) é comparável ao protocolo de rotulagem do receptor do fator de crescimento epidérmico em células fibroblastos COS7 publicados anteriormente24; detalhes nesse papel são referidos em relação ao manuseio dos microchips e ao uso das placas do poço. O protocolo a seguir é otimizado para rotular HER2, revestimento de grafeno9e examinar a tolerância à radiação da amostra.

Protocol

1. Limpeza de microchips e revestimento com poli-L-lysine (PLL) e proteína semelhante à fibronectina (FLP)

  1. Coloque dois microchips com uma membrana SiN (2,0 x 2,6 mm) em 50 mL de acetona. Manuseie os microchips cuidadosamente com o lado plano voltado para cima. Evite quebrar as bordas usando pinças de bico liso. Evite tocar na superfície superior dos microchips ao manusear com pinças para evitar a quebra da janela SiN.
    NOTA: Pode-se também usar pinças revestidas de politetrafluoroetileno ou ponta de carbono para evitar danos aos microchips.
  2. Lave os chips por 2 minutos agitando cuidadosamente o béquer, observando que os microchips não se virarem.
  3. Transfira os microchips para 50 mL de etanol e lave por 2 minutos agitando cuidadosamente o béquer. Certifique-se de que a transferência é rápida para que o excesso de acetona não seque.
  4. Lave os microchips com 50 mL de água por 10 minutos.
  5. Mergulhe os microchips em um béquer recém-preparado de 20 mL de etanol.
  6. Coloque microchips em um tecido de sala de limpeza para secar.
  7. Plasma limpa os microchips com 11,5 sccm O2 e 35 sccm Ar a 70 mTorr e radiofrequência (RF) alvo de 50 W por 5 min.
  8. Coloque os microchips em uma capa de fluxo laminar para o trabalho celular estéril.
  9. Prepare uma solução de 0,01% de PLL na água. Prepare uma solução de 15 μg/mL FLP em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
  10. Prepare uma placa de 24 poços sob o capô de fluxo laminar e encha 5 poços individualmente com 1 mL das soluções na seguinte ordem: bem 1 – PLL; bem 2 – água; poço 3 – água; bem 4 – FLP; bem 5 – PBS e bem 6 – PBS.
    NOTA: Conduza as etapas de lavagem mergulhando um microchip no poço indicado 24 ou 96 por alguns segundos usando pinças. Realize etapas de incubação incubando os microchips no poço 24 ou 96 na solução indicada para tempo e temperatura indicados. Transfira os microchips para outro poço em poucos segundos.
  11. Incubar os microchips na solução PLL por 5 min. Em seguida, lave os microchips na água duas vezes.
  12. Incubar os microchips em FLP por 5 minutos. Em seguida, lave os microchips em PBS duas vezes.
  13. Transfira ambos os microchips para poços (um para cada microchip) de uma nova placa de 96 poços pré-preenchida com 50 μL de meio livre de soro para semeadura celular.
  14. Incubar os microchips a 37 °C e 5% de CO2 até que a suspensão da célula esteja preparada.

2. Células de semeadura em microchips de membrana SiN

  1. Configure todos os suprimentos e equipamentos em uma coifa de fluxo laminar para garantir o trabalho estéril.
  2. Lave a linha celular do câncer de mama, SKBR3, em um frasco de cultura celular com meio de crescimento uma vez. Use o meio de águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco contendo 10% de soro fetal da panturrilha (FCS), e 1% aminoácidos não essenciais (NEAAs) como meio de crescimento.
  3. Incubar as células com 1 mL da solução de descolamento celular até que as células se desvinculem do frasco.
  4. Adicione 5 mL de meio de crescimento às células separadas no frasco. Transfira esta suspensão para um tubo de centrífuga.
  5. Pipeta 20 μL da suspensão celular em um hemótmetro para obter a concentração celular. Use a seguinte fórmula.
    Equation 1.
  6. Prepare uma suspensão celular dispersa de 2,5 x 105 células/mL. Calcule a quantidade necessária da suspensão do celular preparado por:
    Equation 2
    e encher com meio de crescimento para o volume desejado.
  7. Adicione 100 μL da suspensão celular aos dois poços de uma placa de poço de 96 contendo os microchips revestidos PLL e FLP com a membrana SiN voltada para cima e 50 μL de meio livre de soro para que cada poço contenha 25.000 células.
  8. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 por 5 minutos para esperar que as células se conectem ao microchip.
    NOTA: Neste ponto, as células podem se desprender do microchip porque ainda não aderiram.
  9. Verifique a densidade das células no microchip com um microscópio invertido. Certifique-se de que as células cobrem a janela com espaço suficiente para achatar e aderir (ver Figura 1A).
    NOTA: Mais células podem ser adicionadas neste momento, se necessário.
  10. Transfira os microchips para novos poços contendo 200 μL de meio de crescimento e incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.
  11. Na tarde do dia seguinte, transfira os dois microchips para o meio sem soro (meio de fome de soro) se as células tiverem achatado e aderido a uma confluência visualmente inspecionada (ou seja, a fração da área da janela coberta com células) de cerca de 2/3 (ver Figura 1B). Mude para meio livre de soro, conforme necessário, para trazer as células em uma condição inicial definida, conforme necessário para comparação entre diferentes experimentos25.
  12. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.
    NOTA: Esteja ciente de que as quantidades de células podem diferir de acordo com as taxas de crescimento e morfologia celular para outras linhas celulares.

3. Rotulagem e fixação HER2

  1. Preparar as soluções conforme descrito na Tabela Suplementar 1.
    1. Trabalhe sob a coifa de fluxo laminar para garantir o trabalho estéril. Use uma placa de 96 poços referida como placa de rotulagem I, e encha 6 poços por microchip com 200 μL das soluções de placa I de rotulagem: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, mimético de anticorpos, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Use uma linha (uma letra por linha, por exemplo, A1 a A6) da placa do poço por microchip. Aqueça a placa de rotulagem a 37 °C.
    2. Sob um capô de fumaça, prepare uma placa de 24 poços referida como placa de fixação, e encha 8 poços por microchip com 500 μL das soluções da placa de fixação: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS/glycine, PBS/BSA.
      ATENÇÃO: O CB é extremamente tóxico por inalação ou ingestão oral e é perigoso para as águas. Trabalhe sob o capô da fumaça com proteção adequada e descarte o CB de acordo com a ficha técnica de segurança (SDS). A FA é corrosiva e prejudicial para a pele e a saúde. Trabalhe sob o capô da fumaça e consulte a SDS para obter informações sobre manuseio e descarte.
    3. Prepare uma placa de 96 poços referida como placa de rotulagem II e encha 4 poços por microchip com 200 μL das soluções de placa de rotulagem II: QDs, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA.
      NOTA: Aqui, uma placa de 24 poços é usada para ver melhor os microchips nos poços. Para usar menos anticorpos miméticos (etapa 3.2) e QDs (etapa 3.4), use 96 placas de poço para estas etapas.
  2. Rotule HER2 nas células.
    1. Uma vez que estas placas estejam prontas, comece a rotular colocando os microchips nos poços da primeira linha de rotulagem da placa 1.
    2. Lave os microchips com PBS/BSA na placa 96 bem marcada como placa de rotulagem I.
    3. Bloqueie locais inespecíficos para evitar a ligação inespecífica do mimetético de anticorpos incubando com PBS/BSA/GS por 5 min a 37 °C e 5% de CO2.
    4. Incubar com anticorpos miméticos de 200 nM por 10 min a 37 °C e 5% de CO2.
    5. Lave o microchip três vezes em PBS/BSA.
  3. Conserte as células.
    1. Transfira os microchips para a placa de fixação de 24 poços no capô da fumaça.
      NOTA: Não é necessário trabalho estéril daqui.
    2. Lave uma vez com cb por alguns segundos.
    3. Fixar células com 3% de FA por 10 minutos.
    4. Lave uma vez com CB e três vezes com PBS.
    5. Bloqueie grupos de aldeídos livres de FA incubando com PBS-glicina por 2 min.
    6. Lave microchips com PBS-BSA uma vez.
  4. Anexar os QDs.
    1. Mova os microchips para a placa de rotulagem de poços 96 II.
    2. Incubar com QDs de 20 nM por 12 min.
    3. Lave os microchips com PBS/BSA duas vezes.
    4. Armazene os microchips em um poço contendo PBS/BSA.

4. Microscopia leve das células fixas

  1. Prepare um prato de fundo de vidro de 3,5 cm de diâmetro com 2 mL de solução PBS/BSA.
  2. Pegue os primeiros microchips, coloque-o de cabeça para baixo (células voltadas para baixo) no prato de fundo de vidro e coloque o prato no microscópio de fluorescência. Abaixe o microchip lentamente no líquido para evitar danos nas células.
  3. Adquira imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e fluorescência de cada microchip com um objetivo de 40x e o canal de fluorescência apropriado.
    NOTA: Aqui, um comprimento de onda de excitação de 540-580 nm e um comprimento de onda emissor de 607-683 nm é usado para detectar QD655.
  4. Repita o procedimento para o segundo microchip.

5. Pós-fixação

  1. Faça todas as etapas sob o capô da fumaça.
  2. Encha 6 poços por microchip de uma placa de 96 poços com 200 μL das soluções pós-fixação:
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    ATENÇÃO: A GA é perigosa para as águas, prejudicial para a pele, sistema respiratório e olhos. Trabalhe sob o capô da fumaça e consulte a SDS para obter informações sobre manuseio e descarte.
  3. Coloque ambos os microchips em seus respectivos poços com as células voltadas para cima.
  4. Lave uma vez com CB.
  5. Fixar células com 2% de GA por 10 minutos.
  6. Lave uma vez com CB.
  7. Lave três vezes com PBS/BSA.
    NOTA: A primeira etapa de fixação com fa já fixa a estrutura biológica, mas um nível reduzido de difusão de proteína de membrana ainda pode ocorrer, possivelmente levando ao agrupamento induzido pelo rótulo devido à presença de múltiplos streptavidins por QD. Mantenha o tempo das etapas experimentais da fixação da FA até a GA, portanto, o mais curto possível para minimizar a difusão das proteínas na membrana.
  8. Armazene em PBS/BSA para evitar choques osmóticos e 0,02% de azida de sódio (NaN3) para evitar o crescimento bacteriano a 4 °C até o revestimento de grafeno em uma nova placa de poço. Selar bem a placa com filme de parafina para evitar a secagem. Os microchips e células estão estáveis até 2 semanas quando armazenados a 4 °C.
    ATENÇÃO: A NaN3 é perigosa para as águas e agudamente tóxica pela ingestão oral, para a pele e o sistema respiratório. Trabalhe sob o capô da fumaça e consulte a SDS para obter informações sobre manuseio e descarte.

6. Limpeza e transferência de grafeno para cristais de sal

  1. Remova o poli(metil methacrilato) (PMMA)-grafeno do PMMA-grafeno-on-polymer(Figura 2A).
    1. Pipeta algumas gotas de água no polímero ao redor do PMMA-grafeno.
      NOTA: Certifique-se de que o PMMA-grafeno sai facilmente do polímero de suporte enquanto flutua na superfície da água.
    2. Mergulhe o PMMA-grafeno-sobre-polímero em água com um ângulo de 30-45° para liberar o PMMA-grafeno.
      NOTA: O polímero deve ser apenas ligeiramente molhado. A tubulação de muita água no polímero levantará e possivelmente dobrará o PMMA-grafeno.
  2. Contaminantes à base de cobre de etch usando uma solução de persullfato de sódio(Figura 2B).
    NOTA: O grafeno comercial cultivado em papel alumínio de cobre geralmente contém resíduos de cobre subdímetro, que podem ser removidos com uma solução de etchant de cobre22.
    1. Prepare uma solução de 50 mL de 0,42 M de persulfeto de sódio na água.
    2. Transfira PMMA-grafeno para a solução de persulfito de sódio com o lado do grafeno para baixo usando um slide de vidro padrão. O pmma-grafeno flutuará em cima da solução.
    3. Deixe o PMMA-grafeno na solução de persulfeto de sódio durante a noite.
    4. Remova o PMMA-grafeno da solução de persulfito de sódio e coloque-o em cima de água limpa usando um escorregador de vidro. Deixe flutuar na água por meia hora.
    5. Repita a etapa anterior um total de três vezes para remover todos os resíduos de persulfito de sódio do PMMA-grafeno.
  3. Transfira o PMMA-grafeno para um cloreto de sódio (NaCl).
    1. Prepare uma solução saturada de NaCl na água em uma placa de Petri.
    2. Transfira o PMMA-grafeno em cima da solução NaCl com o lado do grafeno para baixo usando um slide de vidro.
    3. Segure um cristal NaCl com pinças e pegue o PMMA-grafeno flutuante.
      NOTA: O tamanho do cristal NaCl deve ser ligeiramente maior do que o tamanho do PMMA-grafeno para evitar dobrar o grafeno saliente na borda do sal ou entrar em contato com o grafeno com pinças. Nestes experimentos, o cristal NaCl de 12 mm x 12 mm x 0,5 mm é usado para pegar uma folha de grafeno de 10 mm x 10 mm e apoiá-la depois.
    4. Segure o PMMA-grafeno-on-salt verticalmente por 2 minutos para deixar o excesso de água fluir.
    5. Deixe o PMMA-grafeno-em-sal secar à temperatura ambiente por 30 minutos e asse-o em um forno a 100 °C por 20 minutos para remover completamente a água.
  4. Remova o PMMA usando uma lavagem de acetona(Figura 2C).
    1. Pré-aqueça acetona em uma placa de vidro Petri a ~50 °C em uma placa quente no capô da fumaça. Observe a temperatura cuidadosamente para evitar o fogo.
    2. Mergulhe o PMMA-grafeno-em-sal na placa de Petri cheia de acetona e deixe dissolver o PMMA por 30 minutos.
    3. Repita a etapa anterior um total de três vezes com acetona nova e limpa.
    4. Deixe o grafeno-sobre-sal secar completamente antes de usá-lo para preparação da amostra.

7. Revestimento de grafeno

NOTA: O procedimento de revestimento do grafeno é mostrado esquematicamente na Figura 3A.

  1. Lave um microchip preparado com células fixas e rotule HER2 em água pura para remover quaisquer resíduos de sal do tampão. Coloque o microchip em um papel filtro. As células são visíveis como manchas escuras(Figura 3B).
  2. Corte o grafeno multicamadas no cristal NaCl em uma peça que se encaixa na janela SiN de um microchip usando uma lâmina de barbear.
  3. Prepare um béquer de água pura e remova o grafeno do cristal NaCl inclinando o cristal sobre o ângulo de 45° em relação à superfície da água e tocando a água. O grafeno flutuará sobre a superfície da água(Figura 3C).
  4. Pegue o grafeno com uma alça metálica da superfície da água. O grafeno flutuará dentro da gotícula abaixo do laço(Figura 3D).
  5. Toque na superfície superior do microchip com a superfície inferior do laço. O microchip grudará na alça metálica. O grafeno pode ser visto em cima do microchip(Figura 3E).
  6. Sob um estereómico, use papel filtro para remover a água restante do microchip, de modo que o grafeno cubra todas as células da janela SiN.
    NOTA: O grafeno se moverá quando estiver apagado. Certifique-se de que o grafeno permaneça na parte superior da janela tocando no microchip apenas com a borda do papel do filtro.
  7. Use pinças para remover o microchip da alça metálica e coloque-o em um papel filtro. O grafeno é visível como um brilho roxo no microchip(Figura 3F).
  8. Transfira o microchip do papel para uma placa de Petri compartimental.
  9. Pipeta uma gota de água em um dos compartimentos livres e feche a tampa para fornecer uma atmosfera saturada de água.
  10. Sele o prato do compartimento com filme de parafina e guarde na geladeira a 4 °C, se necessário para novas medidas.

8. STEM

  1. Ajuste o STEM em energia de feixe de 200 kV usando uma amostra de alinhamento/teste para um tamanho de sonda de pelo menos 0,2 nm ajustando as lentes do condensador, uma corrente de sonda I = 180 pA (informações sobre a corrente da sonda para diferentes configurações de microscópio são fornecidas pelo fabricante dentro de 5% de precisão) e uma semi-angular de convergência de 13,2 mrad inserindo uma abertura. Ajuste o detector ADF STEM abrindo faixa de semiângulo (interna e externa) para 68-280 mrad ajustando as configurações da lente do projetor. Defina o tamanho da imagem STEM para 2048 x 2048 pixels, e o tempo de moradia do pixel t = 6 μs.
  2. Carregue o microchip com células revestidas de grafeno em um suporte padrão de espécime para TEM de tal forma que as células estejam viradas para cima.
  3. Coloque o suporte no microscópio eletrônico.
  4. Adquirir uma imagem de visão geral na ampliação (M) = 800x (Figura 4) usando as configurações na etapa 8.1.
  5. Identifique uma região de interesse em uma célula.
  6. Imagem dos QDs com um detector ADF em M = 80.000x em um tamanho de pixel d = 1,3 nm(Figura 4) usando as configurações na etapa 8.1.
  7. Adquirir uma imagem da área após exposição com uma ampliação mais baixa (aqui, M = 50.000x) para mostrar a área exposta(Figura 4).
  8. Calcule a dose de elétrons
    Equation 3
    onde e é a carga elementar. Com as configurações dadas no acima,
    Equation 4
    e um erro de 5%.
  9. Adquira 20 imagens para uma série de doses com as mesmas configurações, mas com t = 60 μs resultando em uma dose acumulada de
    Equation 20.
  10. Para confirmar a presença do grafeno, mude o microscópio para TEM em M = 1.200x, selecione uma região perto de uma célula e mude para o modo de difração. Registre um padrão de difração em um tempo de exposição de 0,5 s, 2048 x 2048 x 3 pixels, e uma abertura de área selecionada de 50 μm(Figura 4).
  11. No final da sessão, retire a amostra do microscópio, coloque o microchip de volta no prato do compartimento, sele o prato com filme de parafina e guarde-o na geladeira a 4 °C, se necessário para novas medições.
  12. Selecione o segundo microchip preparado da mesma forma que o primeiro microchip, mas sem revestimento de grafeno.
  13. Repita os passos 8.2-8.11, mas agora para esta amostra. Registo um padrão de difração com as mesmas configurações do anterior, como comparação(Figura 4).

9. Análise

NOTA: Para detecção automatizada de posições QD em uma imagem STEM, a análise utiliza um plugin de design local para ImageJ (NIH), conforme descrito em outros lugares20. O plugin está disponível mediante solicitação.

  1. O software aplica automaticamente as seguintes etapas para detectar partículas em uma imagem STEM:
    1. Aplique um filtro gaussiano para reduzir o ruído dos pixels.
    2. Aplique um filtro de bandpass Fast Fourier Transform (FFT) apenas para obter nanopartículas.
    3. Defina um limiar para binarizar a imagem.
    4. Use um diâmetro de partícula de 10 nm com um fator de tolerância de 2 para detecção de partículas.
    5. Detecte posições de partículas.
  2. Meça a distância centro-centro entre dez pares de QDs por série. Aqui, 10 distâncias com tamanho variado foram medidas por série.
  3. Calcule a alteração relativa na distância das partículas comparando cada distância de partícula com a distância na primeira imagem usando:
    Equation 5.

Representative Results

A Figura 1A mostra as células semeadas de tal forma que a janela é coberta, mas com espaço suficiente para permitir que elas se achatem e aderam, levando à confluência de cerca de 2/3rd (Figura 1B). No caso de muitas células serem semeadas em um microchip(Figura 1C),não há espaço suficiente para todas as células aderirem ao microchip. A Figura 1D mostra o mesmo microchip depois das 24h. Mais da metade das células não achatava. Por outro lado, se poucas células forem semeadas(Figura 1E),a janela SiN acabará com um grande espaço vazio após 24 horas, como visto na Figura 1F. A Figura 1G mostra a imagem DIC das células na Figura 1A e Figura 1B. A Figura 1H mostra a imagem de fluorescência correspondente falsa colorida em amarelo indicando rotulagem bem sucedida de HER2.

Os dados stem representativos são mostrados na Figura 4. Foram investigadas células SKBR3 revestidas de grafeno (coluna esquerda) e não revestidas (coluna direita). Figura 4A,B mostrar M = 800x imagens de visão geral das células na janela. As áreas mostradas como insets foram imagens em M = 80.000x durante a série de dose, ver Figura 4C,D. Os QDs são visíveis como pontos brilhantes aqui. Figura 4E e Figura 4F mostram M = 50.000x imagens ampliadas adquiridas nos locais dos retângulos na Figura 4C,D. Ambas as imagens foram registradas após a aquisição de uma série de doses com D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. A série de doses foi registrada em M = 80.000x. As áreas expostas podem ser reconhecidas como retângulos, pelos quais o retângulo era claramente visível para a amostra não revestida(Figura 4F).

Para verificar a presença de grafeno, foram adquiridos padrões de difração de áreas sem células, mas com ou sem grafeno na janela sin. A estrutura hexagonal do grafeno foi observada no padrão de difração da amostra revestida de grafeno(Figura 4G),enquanto estava ausente para a amostra não revestida(Figura 4H). O padrão de difração do grafeno de cristal único terá simetria de seis vezes devido à estrutura hexagonal altamente ordenada do grafeno. Assim, a estrutura hexagonal indica a presença de grafeno nas amostras.

Para investigar o efeito da iluminação do feixe de elétrons na amostra, as imagens STEM foram adquiridas em uma série de imagens com uma dose eletrônica acumulada. Os resultados representativos para amostras não revestidas e revestidas de grafeno são mostrados nas Figuras 5A-D e Figura 5E-G,respectivamente. Todos os dados foram adquiridos na borda da célula, onde a célula é a mais plana, e a estrutura observada é, portanto, a mais próxima da membrana SiN. A exposição de amostras não revestidas levou a estruturas brilhantes que aparecem nas superfícies celulares em D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (Figura 5B). Essas estruturas tornaram-se maiores com doses mais altas, por isso foram claramente visíveis na última imagem da série em D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Figura 5C,D). Essas manchas não apareceram em nenhuma das amostras revestidas de grafeno(Figura 5E-G).

Microchips adicionais foram preparados e examinados usando o protocolo descrito no anterior. No total, foram investigadas seis amostras revestidas e sete não revestidas. Duas das sete amostras não revestidas mostraram esses artefatos. Nenhuma das amostras revestidas mostrou nenhum ponto brilhante adicional.

Como outra medida de dano por radiação, a distância entre os QDs foi examinada. Se os danos estruturais ocorressem, seria de esperar que as distâncias entre os QDs mudassem. Mudanças nas distâncias foram medidas para diferentes pares de QDs com o acúmulo de D para uma gama de distâncias de pares. A Figura 5H mostra que a variação relativa das partículas para amostras não revestidas permaneceu abaixo de 1,3% em média, enquanto a distância relativa média permaneceu abaixo de 0,8% para as amostras revestidas. Pode-se, portanto, concluir que o revestimento de grafeno estabilizou a amostra, mas as amostras secas sem revestimento de grafeno também foram notavelmente estáveis.

Figure 1
Figura 1: Semeadura celular em uma janela SiN de um microchip de silício e HER2 rotulado. (A) Imagem exemplar de uma região da janela SiN com células SKBR3 5 min após a semeadura no microchip. (B) As mesmas células se espalham na mesma janela sin após 24 h. (C) células SKBR3 em um microchip Si 5 min após a semeadura. (D) Mesmas células que em (C) após 24 h. As células não se achataram corretamente, pois havia muitas células nos chips ao semear. (E) Células em um microchip 5 min após a semeadura. (F)Apenas poucas células eram visíveis na janela porque poucas células foram semeadas no microchip. (G) Imagem DIC das mesmas células SKBR3 após a rotulagem QD de HER2. (H) Imagem de sobreposição de DIC e imagem de fluorescência correspondente de células SKBR3 rotuladas com HER2-QD655 (cor falsa em amarelo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Limpeza e transferência de grafeno para cristais NaCl. (A) PMMA-grafeno-on-polymer está imerso em água pura para liberar grafeno PMMA. O grafeno PMMA pode ser pego com um escorregador de vidro. (B) As contaminações à base de cobre foram gravadas utilizando-se uma solução de persulfato de sódio. Para limpar o grafeno, foi transferido para um béquer contendo água deionizada. Esses passos foram repetidos 3 vezes. O PMMA-grafeno foi então transferido para solução saturada de NaCi em água pura. Um cristal NaCl foi usado para pegar o grafeno da solução de sal. (C) O PMMA-grafeno no cristal NaCl foi seco por 30 minutos à temperatura ambiente. PMMA foi removido incubando o bloco em acetona por 30 minutos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Revestimento de grafeno de células semeadas em um microchip Si. (A) Procedimento de revestimento de grafeno. O grafeno no cristal NaCl é liberado na superfície da água. A peça de grafeno é então capturada com um laço de metal e transferida para o microchip Si. (B) Microchip (2,0 x 2,6 mm) com uma janela SiN de dimensões 400 x 160 μm sem grafeno. As células SKBR3 eram visíveis como manchas escuras. (C) Grafeno (círculo vermelho) flutuando na superfície de um béquer cheio de água. (D) Grafeno pego com um laço de metal. (E) O microchip anexado à gota d'água de modo que o grafeno estivesse em cima da janela SiN. (F) Microchip após revestimento de grafeno. O grafeno era visível como um brilho roxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: HAS de células SKBR3 revestidas de grafeno e não revestidas na janela SiN. (A) Imagem STEM de uma amostra revestida de grafeno adquirida a uma imagem DE M = 800x. (B) STEM de uma amostra não revestida adquirida em M = 800x. (C) M = imagem de 80.000x registrada na posição do retângulo azul em A. Linhas amarelas representam exemplos de distâncias medidas dentro de partícula. (D) M = imagem de 80.000x registrada na posição do retângulo azul em B. Linha amarela representa exemplos de distâncias medidas dentro de partículas. (E) M = imagem de 50.000x da mesma região que C exposta a D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. (F) M = imagem de 50.000x da mesma região de D e exposta a D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. A área exposta foi claramente vista. (G) Padrão de difração de uma amostra revestida de grafeno de uma área sem células. A simetria de seis vezes do grafeno é visível como pontos brilhantes. (H) Padrão de difração de uma amostra sem grafeno não mostrando pontos brilhantes de 6 vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Artefatos surgidos em amostras sem revestimento de grafeno. (A) Primeiras imagens de regiões em amostras sem revestimento de grafeno adquiridas em M = 80.000x, e expostas a D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) Imagens com os primeiros artefatos surgidos em D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (setas amarelas). (C, D) Última imagem da série adquirida com D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Artefatos eram visíveis como pontos brilhantes. (E-G) Amostras revestidas de grafeno sem surgir artefatos. (E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. (H) Mudança relativa nas distâncias de partículas para amostras revestidas de grafeno e não revestidas. Duas das amostras não revestidas que mostram artefatos, uma das quais mostradas em (A-C), e a última imagem da segunda amostra em D, bem como três amostras revestidas foram analisadas (uma é mostrada em E-G). No total, foram examinados dez pares de QD por amostra com distâncias que variavam entre 250 nm e 3 μm. A mudança relativa reflete a média de todas as medidas em um grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Receitas para soluções e tampões. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Para entender melhor a função proteica, é importante obter informações sobre locais proteicos na membrana plasmática de células intactas. Os métodos para obtenção dessas informações incluem microscopia de fluorescência de super resolução1,2. Embora a microscopia de super resolução tenha se desenvolvido ainda mais nos últimos anos, sua resolução ainda está limitada a cerca de 20 nm para condições práticas de experimentos celulares, enquanto proteínas receptoras típicas têm tamanhos na faixa de 1-10 nm. A imagem de proteínas em nível de célula única e molécula única com resolução suficiente para visualizar proteínas é possível com EM. Mas devido à secção, os métodos de EM convencionais normalmente não deixam a célula intacta26,o que leva à perda de informações importantes sobre o contexto e a distribuição espacial de proteínas na membrana plasmática. Métodos para células inteiras com crio-TEM foram desenvolvidos6, é viável combinar rotulagem proteica com crio-EM27, também crio-STEM foi demonstrado28. No entanto, os fluxos de trabalho crio-EM são otimizados para estudar a ultraestrutura celular e estrutura proteica, e não tanto para analisar distribuições espaciais de proteína de membrana. A secagem de pontos críticos é outro método de preparação celular inteiro, mas as amostras são submetidas a várias etapas de secagem, e a técnica é altamente demorada29. Proteínas de membrana também foram examinadas através da fratura congelante7. Neste método, as células são fixas, congeladas e fraturadas. As partes fraturadas são replicadas por camadas de carbono e platina, e a amostra biológica é removida. As réplicas podem então ser analisadas com EM30. A análise celular inteira é impossível com a fração de congelamento porque se perde informações sobre a distribuição de proteínas na membrana dentro do contexto de toda a célula.

O método aqui apresentado permite que a membrana celular seja estudada sem a necessidade de fatiar o espécime9,31. As células são mantidas intactas para que a localização das proteínas da membrana seja visível a partir das imagens de fluorescência, que estão correlacionadas com as imagens EM. Estudar proteínas no nível de célula única e molécula única dentro de células intactas em estado hidratado mostrou-se possível com uma resolução de 2 nm usando STEM de proteínas rotuladas por QD usando este método de invólucro de grafeno9. Manter as células em seu estado natal é crucial, pois preserva a distribuição espacial de proteínas de membrana de tal forma que as análises são possíveis no nível de célula única e molécula única, o que é importante para entender as funções proteicas, e desenvolver novos medicamentos para abordagens terapêuticas.

Outro aspecto crítico das amostras biológicas de imagem com EM é o dano de radiação das amostras causadas pelo feixe de elétrons. As soluções geralmente incluem a redução da dose de elétrons tanto quanto possível ou vários métodos de revestimento, como encapsular o espécime entre camadas finas de carbono32. Nosso método mostra que o revestimento de grafeno reduz artefatos induzidos por feixe que emergem na superfície celular para amostras não revestidas. O exame das amostras biológicas quimicamente fixas e revestidas de grafeno é possível sob a irradiação do feixe de elétrons a 200 keV de energia do feixe até D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2 sem danos à radiação, como pontos brilhantes, aparecendo na amostra. Comparado com outros métodos EM que envolvem preparação elaborada de amostras, por exemplo, coloração, incorporação, secção (crio-) fratura, etc., o método descrito aqui é menos demorado. A rotulagem das proteínas é realizada dentro de algumas horas, e o revestimento de grafeno requer apenas cerca de 15 minutos para pesquisadores treinados. A preparação da amostra é comparável com os procedimentos necessários para microscopia de fluorescência.

O protocolo pode ser modificado em algumas etapas. O grafeno no microchip também pode ser seco ao ar para garantir que o grafeno não se mova quando manchado com um papel filtro. Se o grafeno estiver contaminado com sal, é possível deixá-lo flutuar na superfície da água por cerca de uma hora para dissolver o sal e, assim, minimizar a contaminação. A contaminação por cobre ou PMMA no grafeno pode ser reduzida estendendo as etapas de gravação correspondentes no protocolo. Outros métodos de revestimento de grafeno foram descritos onde, por exemplo, o grafeno-PMMA foi depositado diretamente nas células, e o PMMA foi removido por lavagem em acetona depoisde 33. Em nosso método, o PMMA foi removido antes do revestimento para evitar possíveis danos às células causados por etapas adicionais de lavagem de acetona. O NaCl foi escolhido como substrato aqui porque é plano, por isso não enruga o grafeno, e dissolve-se em água para liberar o grafeno9. Além disso, pode ser cortado no tamanho desejado e nenhum resíduo de substrato é deixado no grafeno. Mas levando esses critérios em consideração, outros substratos como cloreto de potássio também podem ser usados.

Para reduzir a chance de agrupamento potencial induzido pelo rótulo, a etapa de fixação de GA pode ser implementada diretamente após a fixação da FA, após a qual todas as proteínas de membrana são imobilizadas. A primeira etapa de fixação com fa já fixa a estrutura biológica, mas um nível reduzido de difusão de proteína de membrana ainda pode ocorrer34, possivelmente levando ao agrupamento induzido pelo rótulo devido à presença de múltiplos Streptavidin por QD. A fixação com GA pode levar a um sinal de autofluorescência durante o LM, e é, portanto, feita após O LM no protocolo descrito, mas pode ser reduzida conforme descrito em outros lugares34. O tampão de cacodilato é bastante tóxico, e outros fixativos também podem ser usados, mas o cacodilato é usado aqui, pois é um tampão comumente usado para protocolos EM, evita precipitados, previne o crescimento de bactérias e fungos, e é compatível com íons de cálcio que são necessários para preservar a integridade ultraestrutural das membranas lipídicas35. Se necessário, o tetroxida de ósmio pode ser usado como fixação adicional para estabilizar os lipídios. Isso ajudaria a melhorar o contraste da estrutura celular, mas também adicionar outro metal ao sistema e reduzir o contraste obtido nos QDs.

O protocolo descrito aqui contém muitas etapas que requerem boas instruções. Alguns treinamentos são necessários antes de manusear microchips para evitar arranhar a superfície sin dos microchips e evitar quebras. Como mencionado anteriormente, recomenda-se preparar microchips em duplicatas, pois a janela SiN pode quebrar de tempos em tempos. A obtenção do número necessário de células em um microchip também requer alguma experiência. Revestir as células com grafeno precisa de algum treinamento, pois pode ser difícil encontrar o ângulo de inclinação reto para flutuar grafeno na água. Ao pegar o grafeno da água, também pode ser difícil ver o grafeno fino. Assim que o grafeno estiver no microchip, o excesso de água precisa ser apagado com um papel filtro. Isso só deve ser feito com a ponta de um papel filtro, de tal forma, para evitar a remoção do grafeno do microchip.

O revestimento de grafeno impediu que artefatos aparecessem na amostra. Mas para D < 4 x 102 e-/Å2 também não surgiram artefatos para a amostra não revestida, e artefatos apareceram apenas para 2 amostras não revestidas. Assim, exames de células não revestidas também parecem possíveis, embora seria melhor usar grafeno e evitar o risco de formação de artefatos. A composição desses artefatos pode ser analisada no futuro para dar dicas sobre como evitar sua formação. Quanto à estabilidade estrutural das células, observou-se apenas uma pequena melhora do revestimento do grafeno. As células fixas foram aparentemente estabilizadas nas áreas finas examinadas, onde sua estrutura estava próxima da membrana SiN. O que não examinamos aqui, no entanto, foram a secagem de artefatos que são conhecidos por ocorrer em amostras celulares quando expostos ao vácuo4. A secagem das células levaria ao encolhimento das células para que as distâncias de QD mudassem como consequência. Para a dose eletrônica usada aqui, a distância de QDs de amostras revestidas de grafeno e não revestidas permaneceu estável. Outros estudos são necessários para examinar o efeito do revestimento de grafeno nas células para EM.

Uma limitação deste método é que a fixação química das células é necessária; portanto, nenhum experimento de células vivas pode ser realizado. Mas caso a rotulagem não seja necessária e as células com maior estabilidade estrutural sejam usadas, por exemplo, bactérias, então as células não fixadas podem ser fechadas em grafeno para EM36, embora com uma tolerância de dose de elétron diferente. Além disso, as proteínas não são diretamente detectáveis, por isso os QDs são necessários para visualizar as proteínas. O método beneficiaria de rótulos menores. Um ponto de discussão é se é bom ou ruim que a ultraestrutura não seja claramente visível. Nosso método é semelhante ao da microscopia de fluorescência, onde apenas proteínas selecionadas são visíveis37. Aumentar a visibilidade da ultraestrutura também adicionaria muito mais informações à imagem e, em algum momento, impediria a detecção das posições individuais do rótulo. Além disso, o método descrito aqui é para uma espécie de proteína, e adições do protocolo são necessárias para ser capaz de rotular múltiplas proteínas. Por último, o método funciona quando uma pequena molécula de alta afinidade especificamente vinculativo, como anticorposmiméticos 21 ou nanocorpo38, está disponível. Anticorpos comumente usados são muito maiores e impediriam a detecção do estado funcional das subunidades proteicas em oligômeros.

Nosso método é útil para estudar a função proteica em células inteiras usando EM, mantendo as células em estado hidratado. É facilmente possível examinar séries de células. Outros tipos de células e proteínas também podem ser estudadas. Se a rotulagem de proteínas não for necessária, um subconjunto do protocolo pode ser usado para revestimento de grafeno de grande variedade de espécimes biológicos. A capacidade de estudar células inteiras é relevante na pesquisa celular para entender correlações da função da proteína da membrana no nível molecular.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a D. B. Peckys por ajuda com o protocolo de cultura celular, F. Weinberg por revisar o manuscrito, T. Trampert por ajuda com os experimentos e os números, S. Smolka por ajuda com os números, e E. Arzt por seu apoio através do INM. Esta pesquisa é financiada por Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

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Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

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