Summary
Evaluatie van motorisch herstel blijft de benchmark uitkomstmaat in experimentele perifere zenuwstudies. De isometrische tetanische krachtmeting van de tibialis voorste spier in de rat is een onschatbaar hulpmiddel om functionele resultaten na reconstructie van ischiaszenuwdefecten te beoordelen. De methoden en nuances worden in dit artikel beschreven.
Abstract
Traumatische zenuwletsels resulteren in aanzienlijk functioneel verlies en segmentale zenuwdefecten vereisen vaak het gebruik van autologe interpositiezenuwtransplantaten. Vanwege hun beperkte beschikbaarheid en bijbehorende morbiditeit aan de donorzijde, richten veel studies op het gebied van zenuwregeneratie zich op alternatieve technieken om een segmentale zenuwkloof te overbruggen. Om de resultaten van chirurgische of farmacologische experimentele behandelingsopties te onderzoeken, wordt het ischiaszenuwmodel van ratten vaak gebruikt als een bioassay. Er zijn verschillende uitkomstmetingen die worden gebruikt in rattenmodellen om de mate van zenuwregeneratie te bepalen. De maximale uitgangskracht van de doelspier blijft de meest relevante uitkomst voor klinische vertaling van experimentele therapieën. Isometrische krachtmeting van tetanische spiercontractie is eerder beschreven als een reproduceerbare en geldige techniek voor het evalueren van motorisch herstel na zenuwletsel of herstel in zowel ratten- als konijnenmodellen. In deze video geven we een stapsgewijze instructie van deze onschatbare procedure voor de beoordeling van functioneel herstel van de tibialis voorste spier in een model van een ischiaszenuwdefect van een rat met behulp van geoptimaliseerde parameters. We zullen de noodzakelijke prechirurgische preparaten beschrijven naast de chirurgische aanpak en dissectie van de gemeenschappelijke peroneale zenuw en tibialis voorste spierpees. De isometrische tetanische krachtmetingstechniek wordt gedetailleerd beschreven. Het bepalen van de optimale spierlengte en stimuluspulsfrequentie wordt uitgelegd en het meten van de maximale tetanische spiercontractie wordt aangetoond.
Introduction
Verlies van motorische functie na traumatisch perifere zenuwletsel heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven en de sociaaleconomische status van patiënten1,2,3. De prognose van deze patiëntenpopulatie blijft slecht als gevolg van minimale verbeteringen in chirurgische technieken in de loop der jaren4. Directe end-to-end spanningsvrije epineurale reparatie vormt de gouden standaard chirurgische reconstructie. Echter, in gevallen met uitgebreide zenuwspleten interpositie van een autologe zenuwtransplantaat is gebleken superieur te zijn5,6. De daarmee gepaard gaande morbiditeit van de donorplaats en de beperkte beschikbaarheid van autologe zenuwtransplantaten hebben de noodzaak van alternatieve techniekenopgelegd 7,8.
Experimentele diermodellen zijn gebruikt om het mechanisme van perifere zenuwregeneratie te verduidelijken en om de resultaten van een verscheidenheid aan reconstructieve en farmacologische behandelingsopties te evalueren8,9. Het rat ischiaszenuwmodel is het meest gebruikte diermodel10. Hun kleine formaat maakt ze gemakkelijk te hanteren en huis. Vanwege hun superlatieve neuroregeneratieve potentieel kan de verminderde tijd tussen interventie en evaluatie van uitkomsten leiden tot relatief lagere kosten11,12. Andere voordelen van het gebruik ervan zijn morfologische overeenkomsten met menselijke zenuwvezels en het hoge aantal vergelijkende/ historische studies13. Hoewel dit laatste voorzichtig moet worden benaderd , omdat een grote verscheidenheid aan verschillende uitkomstmaten tussen studies het moeilijk maakt om de resultaten14,15,16,17,18te vergelijken .
Uitkomstmaten om zenuwregeneratie te beoordelen variëren van elektrofysiologie tot histomorfometrie, maar deze methoden impliceren een correlatie, maar meten niet noodzakelijkerwijs direct de terugkeer van motorische functie14,15. Het regenereren van zenuwvezels kan geen geschikte verbindingen maken die een overschatting van het aantal functionele verbindingen14,15,19,20kunnen veroorzaken . De beste en klinisch meest relevante meting om de juiste renervatie van eindorganen aan te tonen , blijft de beoordeling van spierfunctie21,22,23. Het maken van motorische functiebeoordelingstools voor diermodellen is echter een uitdaging. Medinaceli et al. beschreven voor het eerst de wandelrouteanalyse, die sindsdien de meest gebruikte methode is om functioneel herstel te evalueren in experimentele perifere zenuwstudies21,24,25,26,27,28. De wandelpadanalyse kwantificeert de ischias functionele index (SFI) op basis van metingen van pootafdrukken van wandelende ratten21,29. Grote beperkingen van de analyse van het wandelpad, zoals teencontracturen, automutilatie, uitstrijkjes van de afdruk en slechte correlatie met andere metingen van renervatie, hebben het gebruik van andere parameters voor kwantificering van functioneel herstel30,31noodzakelijk gemaakt .
In eerdere studies bij Lewis ratten32 en Nieuw-Zeelandse konijnen33, hebben we de isometrische tetanische kracht (ITF) meting voor de tibialis anterior (TA) spier gevalideerd en de effectiviteit ervan aangetoond bij de evaluatie van spierherstel na verschillende soorten zenuwherstel34,35,36,37,38,39. De TA-spier is zeer geschikt vanwege zijn relatief grote omvang, innervatie door de peroneale tak van de heupzenuw en goed opgehelderde biochemische eigenschappen40,41,42,43. Wanneer spierlengte (voorspanningskracht) en elektrische parameters zijn geoptimaliseerd, biedt de ITF een zij-aan-zij variabiliteit van respectievelijk 4,4% en 7,5% bij ratten32 en konijnen33.
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol van de ITF-meting in het ischiaszenuwmodel van de rat, inclusief een grondige beschrijving van de noodzakelijke prechirurgische planning, chirurgische aanpak en dissectie van de gemeenschappelijke peroneale zenuw en de distale TA-spierpees. Met behulp van vooraf bepaalde waarden voor de stimulusintensiteit en -duur worden de optimale spierlengte en stimuluspulsfrequentie gedefinieerd. Met deze vier parameters kan de ITF vervolgens consistent en nauwkeurig worden gemeten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd met goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A334818).
1. Kalibratie van de krachtomvormer
- Zorg ervoor dat de computer correct is aangesloten op het multifunctionele I/O-apparaat (DAQ) van de USB-6009, dat op zijn beurt moet worden aangesloten op de krachtomvormer.
OPMERKING: Andere rattenstammen en soorten kunnen een andere load-cell force transducer nodig hebben, omdat hogere krachten te verwachten zijn 44. - Bevestig een aangepaste klem van een gemodificeerde chirurgische hemostase aan de krachtomvormer die is gemonteerd op een vacuümvoet verstelbare hendelarm.
OPMERKING: De op maat gemaakte klem bestaat uit een chirurgische hemostase die is aangepast met een aanhaalschroef die het mogelijk maakt de spanning aan te passen (figuur 1). - Plaats het op maat gemaakte acrylglas testplatform, dat twee houten blokken bevat voor fixatie van de achterpoot van de rat, op de tafel.
OPMERKING: Andere materialen zoals urethaan kunnen ook worden gebruikt in plaats van hout, zolang de K-draden kunnen doordringen en fixeren. - Bevestig de klem, krachtomvormer en verstelbare hendelarmcombinatie verticaal aan het testplatform met behulp van de vacuümbasis.
- Bevestig een klittenband aan de klem voor de kalibratiegewichten.
- Schakel de computer in en open de software (bijv. LabVIEW).
- Zodra de software is geopend, start u het op maat gemaakte virtuele instrument (VI) voor ITF-meting (figuur 2).
OPMERKING: Figuur 2 bevat de LabVIEW-code in een VI-fragment. Dit VI-fragment kan naar het blokdiagram in LabVIEW worden gesleept. Het wordt automatisch omgezet in een grafische code. Voor dit experiment werd de bemonsteringsfrequentie vastgesteld op 2000 Hz met 25 monsters die voor elke iteratie moesten worden afgelezen. - Voer de VI uit door op de witte pijl in de linker bovenhoek te drukken en selecteer Nieuwe kalibratie. Er gaat een nieuw venster open.
- Start het kalibratieproces met nul gewicht (alleen de klem met een aangesloten klittenband) en druk op OK.
- Voeg achtereenvolgens 10, 20, 30 en 50 gram gewicht toe en druk op OK tussen elke gewichtsmeting.
- Zodra alle vijf de metingen zijn verzameld, klikt u op Verwerken.
- Accepteer de waarden alleen als de grafiek op de VI een positieve lineaire curve weergeeft (figuur 3).
- Plaats de klem, krachtomvormer en verstelbare hendelarmcombinatie horizontaal op het testplatform. Dit is de positie die wordt gebruikt voor het meten van de ITF.
- Klik op Nul en het venster wordt automatisch gesloten.
2. Onderwerpen van dieren
- Gebruik mannelijke Lewis ratten met een gewicht tussen 300-500 g.
OPMERKING: Voor de vergelijking van zenuwregeneratie is het noodzakelijk om dezelfde rattenstam te gebruiken in zowel de controle- als experimentele groepen, omdat het gewicht en de incidentie van autotomie stamafhankelijk zijn en de resultaten van de ITF10,32,45,46,47enorm kunnen beïnvloeden .
3. Chirurgische voorbereiding
- Bereid alle vereiste chirurgische instrumenten voor voorafgaand aan de operatie (Tabel van materialen).
- Weeg de dieren om de vereiste hoeveelheid anesthesie te bepalen.
- Induceer anesthesie door de rat in een kamer te plaatsen die is vergast met 3% isofluraan in zuurstof.
- Verdoof de rat diep met behulp van een cocktail van tiendelig ketamine (100 mg/ml) en eendelig xylazine (100 mg/ml) in een dosering van 1 ml/kg lichaamsgewicht via een intraperitoneale injectie. Bewaak de diepte van de anesthesie op basis van de reactie op een teenknijp en door de ademhalingsfrequentie te observeren.
- Ongeveer 30 minuten na de initiële dosering van de ketamine/xylazinecocktail, een aanvullende dosis van 0,3-0,6 ml/kg lichaamsgewicht van alleen ketamine (100 mg/ml) intraperitoneaal toedienen om gedurende de hele procedure voldoende anesthesie te behouden, wat wordt gedefinieerd als een lage ademhalingsfrequentie en een afwezige reactie op een teensnuifje.
LET OP: Het is belangrijk om de vereiste anesthesie zorgvuldig toe te dienen, omdat een overdosis niet kan worden tegengegaan. - Scheer de achterpoten van de rat voorzichtig met behulp van elektrische tondeuses.
- Plaats de rat in een gevoelige positie op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden. Optioneel kan de lichaamstemperatuur worden gecontroleerd met behulp van een rectale thermometer.
- Injecteer 5 ml 0,9% natriumchloride (NaCl) subcutaan in de losse huid over de nek van de rat om een adequate hydratatiestatus gedurende de hele procedure te behouden.
- Vanwege het niet-overlevingskarakter van deze procedure hoeven het chirurgische veld en de instrumenten niet steriel te zijn. De chirurg moet persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) gebruiken en chirurgische loepen worden geadviseerd voor een goede visualisatie van de anatomische structuren.
4. Chirurgische benadering van de gemeenschappelijke peroneale zenuw
- Plaats de rat in de rechter- of linker laterale ligfietspositie, afhankelijk van welke kant als eerste wordt gemeten.
- Maak een incisie van 2-3 cm in de huid van de posterolaterale dij evenwijdig aan het dijbeen, beginnend bij de grotere trochanter met behulp van een chirurgisch nr. 15-mes.
- Identificeer het vlak tussen de biceps femoris spier en de gluteus maximus en vastus lateralis spieren en voer een stompe dissectie uit met behulp van een tenotomie schaar om deze spieren te scheiden en de onderliggende ischiaszenuw bloot te leggen.
- Lokaliseer de trifurcatie van de heupzenuw en plaats een oprolmechanisme om betere toegang te krijgen. De drie takken van de heupzenuw omvatten de gemeenschappelijke peroneale zenuw, de tibialiszenuw en de surale zenuw.
- Isoleer de gemeenschappelijke peroneale zenuwtak (meestal de meest ventrale tak) van de heupzenuw met behulp van een gebogen microchirurgische tang.
OPMERKING: In geval van onzekerheid, stimuleer de geïsoleerde zenuw voorzichtig met een chirurgische zenuwstimulator en observeer de motorische reactie. Stimulatie van de gemeenschappelijke peroneale zenuw resulteert in dorsiflexie van de poot.
5. Dissectie van de distale tibialis voorste spierpees
- Om de TA-spier en het inbrengen ervan bloot te leggen, ingesneden de huid bij het voorste aspect van het onderbeen, beginnend bij het kniegewricht en afdalend naar de middelmatige kant van de achterpoot.
- Ontleed de distale TA spierpees uit het omliggende weefsel met behulp van een scalpel met een chirurgisch mes nr. 15.
- Ontleed met behulp van een muggendop de TA-spierpees botweg naar het inbrengen en snijd de pees zo distaal mogelijk. Laat de proximale TA-spier ongestoord, met behoud van de neurovasculaire pedikel.
OPMERKING: Bevochtig regelmatig (ongeveer om de 5 minuten) de TA-spier met verwarmde 0,9% NaCl (37 °C) om koeling en uitdroging te voorkomen.
6. Isometrische tetanische krachtmeting
- Sluit de bipolaire elektrodekabels en de aardingskabel volgens hun kleur aan op een bipolair stimulatorapparaat.
- Bevestig het andere uiteinde van de bipolaire elektrodekabels aan een subminiatuurelektrode.
OPMERKING: De referentie-elektrode (rood, anode) moet distaal worden geplaatst en de actieve elektrode (zwart, kathode) proximaal. - Breng het dier samen met het verwarmingskussen over naar het testplatform.
- Fixeer de achterpoot van de rat aan het houten blok met behulp van twee 1 mm Kirschner-draden door de enkel en de laterale condyle van het distale dijbeen en vermijd het achterste aspect van de knie.
LET OP: Vermijd vasculaire schade aan de popliteale slagader en ader die zich dorsaal op de dijbeencondyle bevinden. - Bevestig een houder met een aangepaste klem aan het testplatform met behulp van de vacuümbasis.
- Bevestig de distale TA-spierpees aan de klem die aan de krachttransducer is bevestigd.
OPMERKING: De klem en de krachttransducer moeten evenwijdig aan de loop van de TA-spier worden geplaatst. - Plaats het oprolmechanisme op de posterolaterale dij van de rat om toegang te krijgen tot de gemeenschappelijke peroneale zenuw.
OPMERKING: De heupzenuw en de takken moeten vochtig worden gehouden met verwarmde 0,9% NaCl (37 °C) om koeling en uitdroging te voorkomen. - Steek de aardingskabel in de omliggende spieren (bijv. de vastus lateralis spier).
OPMERKING: De Grass SD9 stimulator vereist een aardingskabel om elektrische artefacten te verminderen. Nieuwere stimulatoren hebben mogelijk geen extra aardingskabel nodig. - Haak de gewone peroneale zenuw aan de subminiatuurelektrode en bevestig de positie met behulp van de houder op het platform (Afbeelding 4).
OPMERKING: Zorg ervoor dat alleen de gewone peroneale zenuw is aangesloten op de subminiatuurelektrode. - Optimalisatie van de spierlengte
- Schakel het bipolaire stimulatorapparaat in en pas de instellingen als volgt aan: vierkante monofasische puls, vertraging 2 ms, stimuluspulsduur 0,4 ms, stimulusintensiteit 2 V.
OPMERKING: De vertraging bepaalt de tijd tussen de synchronisatiepuls en de levering van de voorrand van de puls. - Selecteer Parametertest en schakel Triggerverzameling in de VI in.
- Verhoog de spierlengte (voorbelasting) door de hendelarm aan te passen die aan de krachtomvormer is bevestigd.
- Begin bij 10 g voorbelasting en gebruik stappen van 10 g totdat de maximale actieve spierkracht is bepaald.
- Breng voor elke voorbelasting twee enkele twitches direct na elkaar aan met behulp van de knop op het bipolaire stimulatorapparaat. De uitgang zal zichtbaar zijn op het scherm en de rat moet dorsiflexie van de poot laten zien.
OPMERKING: Verwijder voor het stimuleren van de zenuw altijd overtollige 0,9% NaCl rond de zenuw met behulp van applicators met katoenen punt om ervoor te zorgen dat het signaal niet naar het omliggende weefsel wordt geleid. - Om de meting te stoppen, klikt u nogmaals op Trigger collection in de VI.
- Als het programma automatisch de twee piekuitgangskrachten detecteert, klikt u op Accepteren. Als deze uitvoerkrachten niet automatisch worden geselecteerd, drukt u op Weigeren en selecteert u de pieken handmatig. De twee piekoutputkrachten worden gemiddeld tot een gemiddelde piekoutputkracht (figuur 5).
- Bereken de actieve spierkracht door de voorbelasting af te trekken van de gemiddelde piekoutputkracht.
- Noteer de actieve kracht voor elke voorbelasting om de trend te visualiseren en de maximale actieve kracht te herkennen (Figuur 6). Er kan ook een spreadsheet worden gebruikt.
- Schakel het bipolaire stimulatorapparaat in en pas de instellingen als volgt aan: vierkante monofasische puls, vertraging 2 ms, stimuluspulsduur 0,4 ms, stimulusintensiteit 2 V.
- Meting van isometrische tetanische kracht
- Na het bepalen van de ideale spierlengte, laat de spier rusten op nul preload gedurende 5 minuten voorafgaand aan het starten van de tetanische spiersamentrekkingen.
- Schakel ondertussen over van parametertest naar frequentietest op de VI en pas de stimulusintensiteit aan op 10 V op het bipolaire stimulatorapparaat.
- Houd de duur van de vertraging en stimuluspuls op respectievelijk 2 ms en 0,4 ms.
- Meet de isometrische tetanische spierkracht met behulp van toenemende stimulusfrequenties vanaf 30 Hz met stappen van 30 Hz totdat het maximale krachtplateau wordt waargenomen.
- Klik op Trigger collection en stel in op de vooraf bepaalde optimale spierlengte.
- Druk op de herhaalknop op het bipolaire stimulatorapparaat om maximaal 5 seconden een tetanische stimulatie te induceren of totdat een krachtpiek duidelijk wordt waargenomen.
OPMERKING: Verwijder voor het stimuleren van de zenuw altijd overtollige 0,9% NaCl rond de zenuw met behulp van applicators met katoenen punt om ervoor te zorgen dat het signaal niet naar het omliggende weefsel wordt geleid. - Als u de gegevens wilt verzamelen, drukt u nogmaals op Triggerverzameling en documenteert u de maximale uitvoerkracht. Als het programma niet automatisch de maximale uitvoerkracht van de piek detecteert, drukt u op Weigeren en selecteert u de piek handmatig.
- Laat de spier weer rusten op nul preload gedurende 5 minuten voordat u begint met de volgende tetanische spiersamentrekkingen.
OPMERKING: Bevochtig regelmatig (ongeveer elke 5 min) de TA-spier met verwarmde 0,9% NaCl (37 °C) om koeling en uitdroging te voorkomen. - Blijf de stimulusfrequentie verhogen totdat het maximale krachtplateau is bereikt. Het krachtplateau wordt gedefinieerd als de maximale isometrische tetanische kracht.
OPMERKING: Verwijder na deze stap de K-draden, niet of hecht de huid en herhaal de hele procedure naar de contralaterale achterpoot, te beginnen bij stap 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vijf parameters worden gebruikt om de ITF-meting te meten. Deze omvatten spierspanning (preloadkracht), stimulusintensiteit (spanning), stimuluspulsfrequentie, stimulusduur van 0,4 ms en een vertraging van 2 ms. Voorafgaand aan het meten van de ITF moet de optimale spierspanning worden bepaald met behulp van twee enkelvoudige twitch spiersamentrekkingen bij een intensiteit van 2 V tijdens de parametertest. Deze stimuli veroorzaken dorsiflexie van de poot en produceren een uitgangssignaal op de grafiek in de VI (Figuur 5). Deze enkele twitch-curven hebben idealiter een snelle verticale stijging die de samentrekkingsperiode direct vertegenwoordigt, gevolgd door een langzamere verticale afnameperiode die de ontspanningsperiode aantoont. Het programma zal deze twee piek uitgangskrachten gemiddelden, maar de actieve kracht moet handmatig worden berekend door de voorspanningskracht af te trekken van de gemiddelde uitgangskracht. In het voorbeeld in figuur 5resulteert een voorbelasting van 10 g in twee piekvermogens van 411,09 g (4,03 N) en 379,78 g (3,73 N), wat gemiddeld 395,43 g (3,88 N) is. Wanneer de actieve krachten van elke voorbelasting in een grafiek worden uitgezet, kan de maximale actieve kracht worden geïdentificeerd. Deze actieve krachten produceren meestal een klokvormige curve en de maximale actieve kracht voor Lewisratten met een gewicht van 300-500 g moet ongeveer 30-40 g (0,29-0,39 N) zijn (figuur 6).
Voor de tetanische stimulaties tijdens de frequentietest wordt de stimulusintensiteit verhoogd tot een supramaximale spanning (10 V) om maximale activering van alle TA-spiermotorische eenheden met toenemende frequenties te garanderen. De optimale tetanische curve neemt sterk toe en af en heeft een langzaam afnemende plateaufase met minimale oscillaties. Figuur 7 toont een voorbeeld van een tetanische curve met een stimulusfrequentie van 30 Hz met een isometrische tetanische kracht van 803,25 g (7,88 N). Het plateau met de hoogste kracht wordt gedefinieerd als de maximale ITF.
Figuur 1: Afbeelding van een aangepaste klem gemaakt van een chirurgische hemostase en aangepast met een aanhaalschroef die het mogelijk maakt om de spanning aan te passen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Grafische code voor virtueel instrument voor isometrische tetanische krachtmeting op LabVIEW. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kalibratie van de krachtomvormer. Een succesvolle kalibratie van de krachtomvormer met vijf gewichten (0, 10, 20, 30 en 50 g) moet resulteren in een positieve lineaire curve. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Schematisch overzicht van experimentele opstelling voor isometrische tetanische krachtmeting. (Auteursrechtelijk beschermd en gebruikt met toestemming van de Mayo Foundation for Medical Education and Research; alle rechten voorbehouden. Herdrukt van: Shin, R. H. et al. Isometrische tetanische krachtmetingsmethode van de tibialis anterieure in de rat. Microchirurgie. 28 (6), 452-457 (2008)). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Representatieve enkelvoudige twitch curves voor optimalisatie van spierlengte. Voor elke preloadmeting worden twee enkele twitches toegepast. Deze enkelvoudige twitch-curven hebben een snelle verticale stijging (krimpperiode) gevolgd door een verticale afname (ontspanningsperiode). De twee piekoutputkrachten worden gemiddeld tot een gemiddelde piekoutputkracht. In dit voorbeeld met een Lewis rat resulteert een voorbelasting van 10 g in twee piekvermogenskrachten van 411,09 g (4,03 N) en 379,78 g (3,73 N), wat gemiddeld een gemiddelde piekoutputkracht van 395,43 g (3,88 N) is. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Optimale spierlengte (preload). De actieve spierkracht kan worden berekend door de voorbelasting af te trekken van de gemiddelde piekoutputkracht. De actieve spierkracht voor elke voorbelasting moet worden gedocumenteerd totdat een daling van de actieve spierkracht zichtbaar is. De voorbelasting die de hoogste actieve spierkracht oplevert, wordt gebruikt om de isometrische tetanische kracht te meten. De optimale voorbelasting voor Lewisratten met een gewicht van 300-500 g moet ongeveer 30-40 g (0,29-0,39 N) (N = 10) zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Representatieve isometrische tetanische krachtcurve. De optimale tetanische curve neemt sterk toe en heeft vervolgens een langzaam afnemende plateaufase gevolgd door een scherpe afname. Het plateau met de hoogste kracht wordt gedefinieerd als de maximale ITF. Dit voorbeeld toont de tetanische curve bij een stimulusfrequentie van 30 Hz met een isometrische tetanische kracht van 803,25 g (7,88 N). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een eerder gevalideerde methode voor het verkrijgen van nauwkeurige maximale ITF-metingen van de TA-spier in het rattenmodel32. Het herstel van maximale kracht na experimentele zenuwreconstructiebehandelingen is van primair belang in de klinische setting, omdat het bewijst dat de zenuw niet alleen regenereerde, maar ook werkverbindingen maakte met de doelspier. De ITF kan worden gebruikt in een klein zenuwspleetmodel, zoals het rat ischiaszenuwmodel32, en met een paar wijzigingen in het protocol kan het ook worden gebruikt in een groter zenuwspleetkonijn model33.
Er zijn verschillende kritieke stappen die moeten worden overwogen om consistente en betrouwbare maximale isometrische spierkrachtmetingen te garanderen. Het belang van het zorgvuldig selecteren van het type anesthesie om bijwerkingen van skeletspieren te voorkomen is eerder beschreven32,33. Het gebruik van isofluraan heeft een tijdsafhankelijke afname van de spierkracht aangetoond, wat kan worden verklaard door het vermogen om sarcoplasmatisch reticulum te induceren gestimuleerde afgifte van calcium33,48. Het effect van ketamine/xylazine op de spierkracht is minimaal gebleken op basis van onze ervaring en eerdere studie32. Veilige aanhechting van de distale TA spierpees aan de krachttransducer is ook van groot belang voor nauwkeurige metingen. Uitglijden of scheuren van de pees moet worden voorkomen of direct worden gecorrigeerd. Daarom is een op maat gemaakte klem gemaakt van een chirurgische hemostase en aangepast met een aanhaalschroef. Andere onderzoeksgroepen hebben een techniek beschreven om de pees ongeveer 30 minuten te drogen om de interface tussen de pees en een klem mechanisch te versterken49. Om het uithoudingsvermogen van de spier te behouden, is het van cruciaal belang om uitdroging van de TA-spier en pees met warme 0,9% NaCl te voorkomen en een rustperiode van 5 minuten tussen elke tetanische stimulatie te implementeren. De rustperiode is gebaseerd op de activiteit van het phosphagen-systeem, ook bekend als de directe energiebron, wat belangrijk is voor explosieve spiersamentrekkingen. Het bestaat uit adenosinetrifosfaat (ATP) en creatinefosfaatactiviteit en levert energie voor minder dan 10 seconden maximale activiteit. Het duurt ongeveer 3-5 minuten om 100% van de fosfagenen aan te vullen50.
We herkennen de beperkingen van de methode die in deze video wordt beschreven. Het niet-overlevingskarakter van de procedure maakt het niet mogelijk om in de loop van de tijd seriematige metingen uit te voeren. Bovendien is het een gedetailleerd en tijdrovend testprotocol. Tijdens de testtijd van 1 tot 2 uur ondergaan de zenuw en de spier een aanzienlijk aantal stimulaties die kunnen leiden tot spiervermoeidheid met een mogelijke afname van ITF. Dit is echter minder prominent gebleken in het rattenmodel in vergelijking met het konijn33.
Concluderend, de ITF-meting beschreven in deze video is een onschatbaar hulpmiddel in experimentele perifere zenuwstudies om motorisch herstel te kwantificeren. Wanneer andere uitkomstmaten zoals elektrofysiologie en histomorfometrie worden gepresenteerd, kan een globale beoordeling van de zenuwfunctie worden gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke van de National Institutes of Health onder awardnummer RO1 NS 102360. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA | G130203 | |
| 1 mm Kirshner wires | Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ | N/A | |
| Adson Tissue Forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-6801226 | |
| Bipolar electrode cables | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Bipolar stimulator device | Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Cotton-tip Applicators | Cardinal Health, Waukegan, IL, USA | C15055-006 | |
| Curved Mosquito forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-1201112 | |
| Force Transducer MDB-2.5 | Transducer Techniques, Temecula, CA | N/A | |
| Gauze Sponges 4x4 | Covidien, Mansfield, MA, USA | 2733 | |
| Ground cable | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Isoflurane chamber | N/A | N/A | Custom-made |
| Ketamine | Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ | 42023-115-10 | |
| LabView Software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Loop | N/A | N/A | Custom-made |
| Microsurgical curved forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JFA-5B | |
| Microsurgical scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | SAS-15R-8-18 | |
| Microsurgical straight forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JF-3 | |
| Retractor | ASSI, Westbury, NY, USA | AG-124426 | |
| Scalpel Blade No. 15 | Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA | 371115 | |
| Slim Body Skin Stapler | Covidien, Mansfield, MA, USA | 8886803512 | |
| Subminiature electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | N/A | |
| Surgical Nerve Stimulator | Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA | 9094 | |
| Terrell Isoflurane | Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA | H961J19A | |
| Testing platform | N/A | N/A | Custom-made |
| Tetontomy Scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | ASIM-187 | |
| Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S407992 | |
| USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| Vacuum Base Holder | Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal | N/A | Attached clamp is custom-made |
| Weight (10 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820010.4 | |
| Weight (20 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820020.4 | |
| Weight (50 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820050.4 | |
| Xylazine | Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada | 1XYL002 |
References
- Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The incidence of peripheral nerve injury in extremity trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87 (5), 381-385 (2008).
- Huckhagel, T., Nuchtern, J., Regelsberger, J., Lefering, R., TraumaRegister, D. G. U. Nerve injury in severe trauma with upper extremity involvement: evaluation of 49,382 patients from the TraumaRegister DGU(R) between 2002 and 2015. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 26 (1), 76 (2018).
- Tapp, M., Wenzinger, E., Tarabishy, S., Ricci, J., Herrera, F. A. The Epidemiology of Upper Extremity Nerve Injuries and Associated Cost in the US Emergency Departments. Annals of Plastic Surgery. 83 (6), 676-680 (2019).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
- Terzis, J., Faibisoff, B., Williams, B. The nerve gap: suture under tension vs. graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 56 (2), 166-170 (1975).
- Millesi, H. Forty-two years of peripheral nerve surgery. Microsurgery. 14 (4), 228-233 (1993).
- Wood, M. D., Kemp, S. W., Weber, C., Borschel, G. H., Gordon, T. Outcome measures of peripheral nerve regeneration. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger. 193 (4), 321-333 (2011).
- Alvites, R., et al. Peripheral nerve injury and axonotmesis: State of the art and recent advances. Cogent Medicine. 5 (1), 1466404 (2018).
- Diogo, C. C., et al. The use of sheep as a model for studying peripheral nerve regeneration following nerve injury: review of the literature. Journal of Neurology Research. 39 (10), 926-939 (2017).
- Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
- Brenner, M. J., et al. Role of timing in assessment of nerve regeneration. Microsurgery. 28 (4), 265-272 (2008).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: a systematic review. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
- Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Selection of the appropriate parameter to measure neural regeneration. Annals of Plastic Surgery. 23 (3), 197-202 (1989).
- Munro, C. A., Szalai, J. P., Mackinnon, S. E., Midha, R. Lack of association between outcome measures of nerve regeneration. Muscle Nerve. 21 (8), 1095-1097 (1998).
- Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Journal of Neurology Research. 26 (2), 186-194 (2004).
- Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
- Kanaya, F., Firrell, J. C., Breidenbach, W. C. Sciatic function index, nerve conduction tests, muscle contraction, and axon morphometry as indicators of regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery. 98 (7), 1264-1271 (1996).
- Nichols, C. M., et al. Choosing the correct functional assay: a comprehensive assessment of functional tests in the rat. Behavioural Brain Research. 163 (2), 143-158 (2005).
- Terzis, J. K., Smith, K. J. Repair of severed peripheral nerves: comparison of the "de Medinaceli" and standard microsuture methods. Experimental Neurology. 96 (3), 672-680 (1987).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Doi, K., Hattori, Y., Tan, S. H., Dhawan, V. Basic science behind functioning free muscle transplantation. Clinics in Plastic Surgery. 29 (4), (2002).
- Vathana, T., et al. An Anatomic study of the spinal accessory nerve: Extended harvest permits direct nerve transfer to distal plexus targets. Clinical Anatomy. 20 (8), 899-904 (2007).
- Chaiyasate, K., Schaffner, A., Jackson, I. T., Mittal, V. Comparing FK-506 with basic fibroblast growth factor (b-FGF) on the repair of a peripheral nerve defect using an autogenous vein bridge model. Journal of Investigative Surgery. 22 (6), 401-405 (2009).
- Lee, B. K., Kim, C. J., Shin, M. S., Cho, Y. S. Diosgenin improves functional recovery from sciatic crushed nerve injury in rats. Journal of Exercise Rehabilitation. 14 (4), 566-572 (2018).
- Lubiatowski, P., Unsal, F. M., Nair, D., Ozer, K., Siemionow, M. The epineural sleeve technique for nerve graft reconstruction enhances nerve recovery. Microsurgery. 28 (3), 160-167 (2008).
- Luis, A. L., et al. Use of PLGA 90:10 scaffolds enriched with in vitro-differentiated neural cells for repairing rat sciatic nerve defects. Tissue Engineering, Part A. 14 (6), 979-993 (2008).
- Shabeeb, D., et al. Histopathological and Functional Evaluation of Radiation-Induced Sciatic Nerve Damage: Melatonin as Radioprotector. Medicina. 55 (8), Kaunas. (2019).
- Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 83 (1), 129-138 (1989).
- Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
- Lee, J. Y., et al. Functional evaluation in the rat sciatic nerve defect model: a comparison of the sciatic functional index, ankle angles, and isometric tetanic force. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (5), 1173-1180 (2013).
- Shin, R. H., et al. Isometric tetanic force measurement method of the tibialis anterior in the rat. Microsurgery. 28 (6), 452-457 (2008).
- Giusti, G., et al. Description and validation of isometric tetanic muscle force test in rabbits. Microsurgery. 32 (1), 35-42 (2012).
- Bulstra, L. F., et al. Functional Outcome after Reconstruction of a Long Nerve Gap in Rabbits Using Optimized Decellularized Nerve Allografts. Plastic and Reconstructive Surgery. 145 (6), 1442-1450 (2020).
- Giusti, G., et al. The influence of vascularization of transplanted processed allograft nerve on return of motor function in rats. Microsurgery. 36 (2), 134-143 (2016).
- Giusti, G., et al. The influence of nerve conduits diameter in motor nerve recovery after segmental nerve repair. Microsurgery. 34 (8), 646-652 (2014).
- Hundepool, C. A., et al. Comparable functional motor outcomes after repair of peripheral nerve injury with an elastase-processed allograft in a rat sciatic nerve model. Microsurgery. 38 (7), 772-779 (2018).
- Lee, J. Y., et al. The effect of collagen nerve conduits filled with collagen-glycosaminoglycan matrix on peripheral motor nerve regeneration in a rat model. Journal of Bone and Joint Surgery. 94 (22), 2084-2091 (2012).
- Shin, R. H., Friedrich, P. F., Crum, B. A., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Treatment of a segmental nerve defect in the rat with use of bioabsorbable synthetic nerve conduits: a comparison of commercially available conduits. Journal of Bone and Joint Surgery. 91 (9), 2194-2204 (2009).
- Coombes, J. S., et al. Effects of vitamin E deficiency on fatigue and muscle contractile properties. Eur J Appl Physiol. 87 (3), 272-277 (2002).
- Kauvar, D. S., Baer, D. G., Dubick, M. A., Walters, T. J. Effect of fluid resuscitation on acute skeletal muscle ischemia-reperfusion injury after hemorrhagic shock in rats. Journal of the American College of Surgeons. 202 (6), 888-896 (2006).
- Murlasits, Z., et al. Resistance training increases heat shock protein levels in skeletal muscle of young and old rats. Experimental Gerontology. 41 (4), 398-406 (2006).
- Zhou, Z., Cornelius, C. P., Eichner, M., Bornemann, A. Reinnervation-induced alterations in rat skeletal muscle. Neurobiology of Disease. 23 (3), 595-602 (2006).
- Schmoll, M., et al. In-situ measurements of tensile forces in the tibialis anterior tendon of the rat in concentric, isometric, and resisted co-contractions. Physiological Reports. 5 (8), (2017).
- Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. 10 (4), 01580 (2020).
- Kingery, W. S., Vallin, J. A. The development of chronic mechanical hyperalgesia, autotomy and collateral sprouting following sciatic nerve section in rat. Pain. 38 (3), 321-332 (1989).
- Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
- Kunst, G., Graf, B. M., Schreiner, R., Martin, E., Fink, R. H. Differential effects of sevoflurane, isoflurane, and halothane on Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Anesthesiology. 91 (1), 179-186 (1999).
- Schmoll, M., et al. A novel miniature in-line load-cell to measure in-situ tensile forces in the tibialis anterior tendon of rats. PLoS One. 12 (9), 0185209 (2017).
- Paul, R. J. Cell Physiology Source Book (Fourth Edition). Sperelakis, N. , Academic Press. 801-821 (2012).
