Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62086
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

Summary

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Abstract

Somitogenese is een kenmerk van de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. Al jaren bestuderen onderzoekers dit proces in een verscheidenheid aan organismen met behulp van een breed scala aan technieken die ex vivo en in vitro benaderingen omvatten. De meeste studies vertrouwen echter nog steeds op de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvormingsgegevens, wat een goede evaluatie van een ontwikkelingsproces zoals axiale extensie en somitogenese met zeer dynamische interacties in een complexe 3D-ruimte beperkt. Hier beschrijven we technieken die muis live imaging acquisitie, datasetverwerking, visualisatie en analyse in 3D en 4D mogelijk maken om de cellen (bijv. Neuromesodermale voorlopers) te bestuderen die betrokken zijn bij deze ontwikkelingsprocessen. We bieden ook een stapsgewijs protocol voor optische projectietomografie en whole-mount immunofluorescentiemicroscopie in muizenembryo's (van monstervoorbereiding tot beeldacquisitie) en tonen een pijplijn die we hebben ontwikkeld om 3D-beeldgegevens te verwerken en te visualiseren. We breiden het gebruik van sommige van deze technieken uit en benadrukken specifieke kenmerken van verschillende beschikbare software (bijv. Fiji / ImageJ, Drishti, Amira en Imaris) die kunnen worden gebruikt om ons huidige begrip van axiale extensie en somietvorming (bijv. 3D-reconstructies) te verbeteren. Al met al benadrukken de hier beschreven technieken het belang van 3D-gegevensvisualisatie en -analyse in de ontwikkelingsbiologie en kunnen ze andere onderzoekers helpen om 3D- en 4D-beeldgegevens beter aan te pakken in de context van axiale uitbreiding en segmentatie van gewervelde dieren. Ten slotte maakt het werk ook gebruik van nieuwe hulpmiddelen om het onderwijzen van de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren te vergemakkelijken.

Introduction

De vorming van de lichaamsas van gewervelde dieren is een zeer complex en dynamisch proces dat plaatsvindt tijdens de embryonale ontwikkeling. Aan het einde van de gastrulatie [bij de muis, rond embryonale dag (E) 8.0], wordt een groep epiblastvoorlopercellen die bekend staan als neuromesodermale voorlopercellen (NMP's) een belangrijke aanjager van axiale uitbreiding in een kop-staartsequentie, die de neurale buis en paraxiale mesodermale weefsels genereert tijdens nek-, romp- en staartvorming 1,2,3,4 . Interessant is dat de positie die deze NMP's innemen in de caudale epiblast een sleutelrol lijkt te spelen in de beslissing om te differentiëren in mesoderm of neuro-emtoderm5. Hoewel we momenteel geen precieze moleculaire vingerafdruk voor NMP's hebben, wordt over het algemeen gedacht dat deze cellen T (Brachyury) en Sox2 5,6 co-expresseren. De exacte mechanismen die NMP-lotbeslissingen reguleren (d.w.z. of ze neurale of mesodermale routes nemen) beginnen pas nauwkeurig te worden gedefinieerd. Tbx6-expressie in het primitieve streepgebied is een vroege marker van NMP-lotbeslissing, omdat dit gen betrokken is bij de inductie en specificatie van mesoderm 6,7. Interessant is dat vroege mesodermcellen hoge niveaus van Epha18 lijken uit te drukken, en Wnt / β-catenine-signalering, evenals Msgn1 bleken ook een belangrijke rol te spelen bij paraxiale mesodermdifferentiatie en somietvorming 9,10. Een volledige ruimtelijk-temporele analyse van NMP's op eencellig niveau zal zeker instrumenteel zijn om de moleculaire mechanismen die mesodermspecificatie beheersen volledig te begrijpen.

De vorming van somieten (wervelvoorlopers) is een belangrijk kenmerk van gewervelde dieren. Tijdens axiale elongatie wordt het paraxiale mesoderm gesegmenteerd in een reeks bilaterale herhalende eenheden die bekend staan als somites. Het aantal somites en de tijd die nodig is voor de vorming van nieuwe segmenten varieert per soort11,12. Somitogenese omvat periodieke signaaloscillaties (bekend als de "segmentatieklok") die kunnen worden waargenomen door de cyclische expressie van verschillende genen van de Notch-, Wnt- en Fgf-signaalroutes in het presomitische mesoderm (bijv. Lfng)11,12. Het huidige model van somitogenese postuleert ook het bestaan van een "rijpingsgolffront", een reeks complexe signaalgradiënten met Fgf-, Wnt- en retinoïnezuursignalering die de positie van de achterste grens van elke nieuwe somiet bepalen. Een gecoördineerde interactie tussen de "segmentatieklok" en het "rijpingsgolffront" is daarom fundamenteel voor het genereren van deze wervelvoorlopermodules, aangezien verstoringen in deze belangrijke morfogenetische processen kunnen leiden tot embryonale letaliteit of tot de vorming van aangeboren misvormingen (bijv. Scoliose)13,14,15.

Ondanks aanzienlijke recente vooruitgang in beeldvormingstechnieken, biobeeldanalysemethoden en software, zijn de meeste studies van axiale elongatie en somitogenese nog steeds afhankelijk van enkelvoudige / geïsoleerde tweedimensionale beeldgegevens (bijv. Secties), die geen volledige multidimensionale weefselvisualisatie mogelijk maken en een duidelijk onderscheid tussen pathologische misvormingen (d.w.z. als gevolg van mutaties) versus normale morfologische variatie tijdens de embryonale ontwikkeling bemoeilijken16 . Beeldvorming in 3D heeft al nieuwe morfogenetische bewegingen blootgelegd, voorheen niet geïdentificeerd door standaard 2D-methoden 17,18,19,20, wat de kracht van in toto-beeldvorming benadrukt om de mechanismen van gewervelde somitogenese en axiale extensie te begrijpen.

3D- en 4D-microscopie van muizenembryo's, met name live beeldvorming, zijn technisch uitdagend en vereisen kritieke stappen tijdens monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensvoorverwerking om nauwkeurige en zinvolle spatio-temporele analyse mogelijk te maken. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring van muizenembryo's, dat kan worden gebruikt om zowel NMP's als mesodermale cellen te bestuderen tijdens axiale extensie en segmentatie. Daarnaast beschrijven we ook een protocol voor optische projectietomografie (OPT) van oudere embryo's en foetussen, dat 3D in toto visualisatie en kwantificering van pathologische afwijkingen mogelijk maakt die het gevolg kunnen zijn van problemen tijdens somitogenese (bijv. Botfusie en scoliose)13,21,22. Ten slotte illustreren we de kracht van 3D-beeldvormingsreconstructies in de studie en het onderwijs van gewervelde segmentatie en axiale elongatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dierproeven volgden de Portugese (Portaria 1005/92) en Europese (Richtlijn 2010/63/EU) wetgevingen met betrekking tot huisvesting, houderij en welzijn. Het project werd beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het 'Instituto Gulbenkian de Ciência' en door de Portugese nationale entiteit 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (licentiereferentie: 014308).

1. Monstervoorbereiding voor 3D- en 4D-beeldvorming

OPMERKING: Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van het ontleden en voorbereiden van muis E8.25 tot E10.5 embryo's voor levende beeldvorming (1.1), E7.5 tot E11.5 embryo's voor whole mount immunofluorescentie microscopie (1.2) en foetussen voor optische projectietomografie (1.3).

  1. Monstervoorbereiding voor live beeldvorming
    1. Dissectie van muizenembryo's en voorbereiding op live beeldvorming (bijv. LuVeLu-verslaggever 23).
      1. Ontleed muizenembryo's tussen E8.25 en E10.5 in voorverwarmd M2-medium (37 °C). Verwijder de dooierzak voorzichtig met een schone tang en was het embryo eenmaal met vers M2-medium om bloed en vuil te verwijderen dat tijdens de dissectie is geproduceerd.
        OPMERKING: Het is belangrijk om te voorkomen dat het embryo op enigerlei wijze wordt beschadigd, anders zal het zich niet goed ontwikkelen tijdens de live beeldvormingsprocedure.
      2. Incubateer tijdens de live imaging-procedure embryo's in een verwarmde kamer (37 °C), in een 65% O2 - en 5% CO2-omgeving (N2 gebalanceerd), in DMEM-medium met lage glucose, aangevuld met 10% HyClone gedefinieerd foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine.
        OPMERKING: Deze kweekomstandigheden zorgen ervoor dat de embryonale ontwikkeling ongeveer 10 uur kan plaatsvinden. Andere protocollen 9,10, met andere kweekomstandigheden, kunnen nog langere perioden toestaan.
  2. Monstervoorbereiding voor immunofluorescentiemicroscopie
    1. Muisembryodissectie en fixatieprocedure
      1. Ontleed muizenembryo's van E7.5 tot E11.5 in koud (4 °C) fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of M2 medium. Na verwijdering van alle extra-embryonale membranen (bijv. Reichart's membraan of dooierzak) wast u het embryo in vers PBS om bloed en puin te verwijderen dat tijdens de dissectieprocedure is geproduceerd.
      2. Fixeer embryo's bij 4 °C in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, gedurende de in tabel 1 vermelde tijd.
        LET OP - PFA moet worden gehanteerd in een zuurkast
        Ontwikkelingsfase Aanbevolen fixatietijd (PFA 4%)
        E7,5 1u30
        E8,5 2u
        E9,5 3u
        E10,5 4u
        E11,5 4u
        Tabel 1 - Fixatietijden voor embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia
      3. Was embryo's na fixatie minstens twee keer (elk 5-10 minuten) in PBS om PFA volledig te verwijderen. Op dit punt kunnen embryo's rechtstreeks in het immunofluorescentiekleuringsprotocol worden gebracht (stap 1.2.2) of kunnen ze worden gedehydrateerd en opgeslagen voor toekomstig gebruik (stap 1.2.1.4).
      4. Bewaar embryo's indien nodig bij -20 °C in 100% methanol gedurende lange perioden.
        1. Om het weefselbehoud te verbeteren, droogt u het embryo geleidelijk uit met 10% toename van de methanolconcentratie (verdund in PBS), elke stap 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een shaker, totdat 100% methanol wordt bereikt. Vervang de 100% methanol eenmaal met een verse aliquot.
        2. Herstel ingevroren embryo's door rehydratatie na een omgekeerde methanol/PBS-serie, elke stap 10 minuten bij RT op een shaker, en met de laatste wasbeurten in PBS (tweemaal, 5-10 min elk) voordat het immunostainingprotocol wordt ingevoerd.
          LET OP - Methanol moet in een zuurkast worden gehanteerd.
    2. Whole-mount immunofluorescentiekleuring
      OPMERKING: Het volgende immunofluorescentiekleuringsprotocol is aangepast van de procedure beschreven in Osorno et al.24. Alle wasbeurten moeten worden uitgevoerd op een shaker. Na de blokkerende stap worden incubaties uitgevoerd bij 4 °C om de integriteit/conservering van antilichamen te waarborgen.
      1. Was embryo's drie keer (elk 30 min) in PBS met 0,1% Triton X-100 (0,1% PBST) en vervolgens eenmaal in 0,5% PBST gedurende 1 uur (RT) om de permeabilisatie te verbeteren.
      2. Om niet-specifieke binding te verminderen, wast u 1 M glycine in PBS (pH 7,5) gedurende 30 minuten bij RT.
      3. Was drie keer in 0,1% PBST gedurende 30 minuten om de glycine volledig te verwijderen.
      4. Incubeer de embryo's 's nachts bij 4 °C in blokkerende oplossing die: 3% serum (van de diersoorten waarbij de secundaire antilichamen zijn geproduceerd), 1% runderserumalbumine (BSA) en 0,1% Triton X-100 in PBS bevat.
      5. Verdun primaire antilichamen in blokkerende oplossing (normaal 1:200 voor T- en Sox2-antilichamen) en incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 4 °C.
      6. Voordat u de secundaire antilichamen toevoegt, wast u de embryo's driemaal (elk 30 min) in 0,1% PBST bij 4 °C. Verdun secundaire antilichamen in blokkerende oplossing (1:1000) en incubeer gedurende 2 dagen bij 4 °C, beschermd tegen licht.
      7. Was embryo's zes keer (elk 30 min) in 0,1% PBST bij 4 °C.
      8. Voor nucleaire counterstaining incubeer embryo's in 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI), verdund 1:500 in PBST, 's nachts op een shaker bij 4 °C, beschermd tegen licht.
      9. Was embryo's ten slotte driemaal (elk 30 min) in 0,1% PBST bij 4 °C.
    3. Weefsel opruimen en glijpreparatie
      1. Weefselverwijdering met methylsalicylaat of een mengsel van benzylalcohol met benzylbenzoaat (BABB)
        1. Alvorens te zuiveren met methylsalicylaat of BABB, moet u embryo's volledig uitdrogen door ze op 100% methanol te brengen, door middel van een methanol / PBS-serie bestaande uit opeenvolgende 10% verhogingen van de methanolconcentratie (incubatietijden van 10 min elk bij 4 °C). Om volledige uitdroging te bereiken, vervangt u de 100% methanol voor een nieuwe en wacht u nog eens 10 minuten.
        2. Voer embryo-clearing uit door in te bedden in een reeks methylsalicylaat of BABB in methanol met 20% opeenvolgende verhogingen van de concentratie, 20 minuten incubatie voor elke stap. Wanneer de methylsalicylaat- of BABB-oplossing 100% bereikt, breng dan twee extra wijzigingen aan voor een nieuwe oplossing.
          LET OP: Zowel methylsalicylaat als BABB moeten in een zuurkast worden gehanteerd.
          OPMERKING: Voor een goede clearing is het essentieel dat embryo's volledig uitgedroogd zijn. Het is ook essentieel dat de methanol volledig wordt gemengd met methylsalicylaat of BABB in de serie clearingoplossingen.
        3. Nadat de embryo's volledig transparant zijn geworden, behandel ze individueel, bij voorkeur met behulp van een fluorescentieseroscoop, om de kans op weefselbeschadiging te verminderen.
        4. Monteer embryo's voor beeldvorming in een 75 mm x 25 mm depressie concave glasplaat of een 20 mm x 60 mm # 1.5 afdekglas. De laatste optie maakt beeldvorming van beide kanten mogelijk, indien nodig, maar het is veel kwetsbaarder en moeilijker af te sluiten. Breng embryo's over naar de microscoopglaasjes met behulp van een tandenstoker, een fijn wattenstaafje, een Pasteur-pipet of een ander soortgelijk instrument.
        5. Om te voorkomen dat de embryo's worden samengedrukt, voegt u afstandhouders toe die zijn gemaakt van # 1 coverglass-scherven (170 μm dik), siliconen of dunne metalen ringen. Voeg vervolgens een druppel montagemedium toe, dek af met een # 1 of # 0 20x20 mm afdekglas en sluit af.
        6. Als u glazen of metalen afstandhouders gebruikt, sluit dan af met gesmolten paraffine om het preparaat beter te stabiliseren - sluit niet af met nagellak omdat het oplost met methylsalicylaat of BABB. Om bubbels te voorkomen, plaatst u de deklip aan één kant en schuift u deze vervolgens geleidelijk en voorzichtig zijwaarts; voeg indien nodig meer medium toe.
          OPMERKING: Zie de video om beter te begrijpen hoe u de geruimde embryo's kunt manipuleren en hoe u ze op de microscoopglaasjes kunt monteren.
      2. Weefsel opruimen met RapiClear
        1. Bij gebruik van RapiClear is uitdroging van het embryo niet nodig. Plaats na stap 1.2.2.9 de embryo's in het midden van een concave glasglaas van 75 mm x 25 mm, verwijder alle PBST in de microscoopdepressiefglaasjes en voeg 200 μL clearingoplossing toe.
        2. Na 10 minuten beschermd tegen licht, wanneer embryo's transparant beginnen te worden, vervangt u de opruimoplossing, wacht u nog eens 20 minuten (beschermd tegen licht) en bedek dan met een deklip, beginnend aan de ene kant en voorzichtig naar de andere kant bewegend.
          OPMERKING: De tijd om het embryo volledig te wissen kan van een paar minuten tot 's nachts gaan, afhankelijk van het stadium en de grootte van de embryo's. Ook moet het hele proces onder een stereomicroscoop worden gedaan. Voor een beter begrip van het opruimen en de voorbereiding van het microscoopglaasje, raadpleegt u het videoprotocol.
  3. Monstervoorbereiding voor optische projectietomografie
    OPMERKING: De volgende procedures zijn aangepast van eerdere protocollen19,25,26. Het protocol zal worden beschreven voor de analyse van E18.5 muisfoetussen.
    1. Muisfoetusdissectie en fixatieprocedure
      1. Ontleed E18.5 muisfoetussen in koude (4 °C) PBS, verwijder alle extra-embryonale membranen en was de foetussen vervolgens meerdere keren in verse PBS om bloed en puin te verwijderen dat tijdens de dissectieprocedure is geproduceerd.
      2. Fix fetuses in 4% PFA gemaakt in PBS, bij 4 °C gedurende 5 tot 7 dagen.
      3. Was foetussen eenmaal (15 min) in PBS en vervolgens drie keer (elk 30 min) in gedemineraliseerd water of PBS. Voer de wasbeurten uit op een shaker.
      4. Droog de foetussen uit door incubatie (25 min series bij RT op een shaker) in methanoloplossingen van toenemende concentraties (10% verhoogt verdund in gedemineraliseerd water of PBS) tot 100% methanol.
      5. Vervang de 100% methanoloplossing (gebruik een verse aliquot) drie keer (elk 20 minuten) om volledige uitdroging te garanderen. Embryo's kunnen vervolgens bij -20 °C worden bewaard of direct (een dag later) naar het bleekproces worden gebracht (stap 1.3.2).
    2. Bleekproces
      1. Om de natuurlijke pigmentatie te verwijderen, incubeer foetussen (afzonderlijk) op een shaker, eerst gedurende één dag in 5% H202 in methanol en vervolgens in 10% H202 in methanol gedurende maximaal 3 dagen totdat de embryo's alle natuurlijke pigmentatie verliezen.
        LET OP: H2O2 moet voorzichtig in een zuurkast worden gehanteerd. De bleekoplossing die H2O2 bevat wanneer deze in contact komt met het monster, creëert dampen en daarom moet de buis met de foetussen open blijven tijdens de hele bleekprocedure. Sommige bleekprotocollen suggereren de combinatie van H2O2 met formamide. Als dit alternatief wordt gebruikt, moet extra voorzichtig worden omgesprongen, omdat het toevoegen van H2O2 aan onverdund formamide kan leiden tot een explosie.
      2. Rehydrateer de embryo's geleidelijk in een omgekeerde methanolreeks (met 10% afname) in gedemineraliseerd water, elk gedurende 20 minuten geïncubeerd bij RT op een shaker en ten slotte drie keer (elk 30 min) gewassen in gedemineraliseerd water. Wacht een dag, ververs het gedemineraliseerd water en ga verder.
        OPMERKING: Zie aanvullende figuur 1 voor een representatief resultaat van het bleekproces.
    3. Demineralisatieprotocol
      OPMERKING: Demineralisatie is optioneel, maar wordt aanbevolen voor foetussen of pups.
      1. Voer demineralisatie uit door de foetussen gedurende een paar uur in 0,1 M EDTA bij 42 °C te wassen [zie ook Cho et al.27] gevolgd door vijf wasbeurten (elk 20 minuten) met gedemineraliseerd water om de EDTA volledig te verwijderen. Voer alle procedures uit op een shaker.
    4. Monstervoorbereiding voor clearing
      1. Sluit foetussen in een 1% agaroseblok in. Om deze blokken voor te bereiden, vult u een plastic buis of spuit van 50 ml (een cilindrische ruimte bouwen door de uitgang van de spuit af te snijden en de zuiger te gebruiken om de andere kant te blokkeren) met gesmolten agarose, plaatst u de foetus in de agarose in een verticale positie en houdt u deze positie in het midden van het blok met behulp van een tang tijdens het stollen van de agarose.
      2. Plaats de vorm met het blok op 4 °C (30 min) zodat de agarose volledig is uitgekookt. In geval van onjuiste positionering van de foetus in het blok of het verschijnen van luchtbellen, smelt de agarose door het blok 's nachts op 50 ° C te plaatsen en herhaal de procedure de volgende dag.
      3. Verwijder het agaroseblok met de foetus uit de mal en plaats het in een container met gedemineraliseerd water. Vervang na 15 min door vers gedemineraliseerd water.
      4. Voordat u met BABB klaarmaakt, droogt u het monster uit. Om de weefselintegriteit beter te behouden, voert u de uitdroging van de foetus geleidelijk uit met 10% toename van de methanolconcentratie (verdund in gedemineraliseerd water of PBS), elke stap gedurende meer dan 45 minuten bij RT op een shaker, totdat 100% methanol wordt bereikt.
      5. Vervang de 100% methanol (gebruik een verse aliquot), eerst vier keer in intervallen van een uur en dan opnieuw op de volgende dag om volledige uitdroging te garanderen.
    5. Clearingproces en monstermontage voor OPT-beeldvorming
      1. Verwijder de foetussen op een shaker door middel van een reeks (elk 2,5 uur) BABB-oplossing in methanol, met 25% toename van de BABB-concentratie, totdat 100% BABB wordt bereikt.
      2. Vervang de BABB-oplossing elke dag door een nieuwe, totdat de foetus volledig transparant is. Dit proces kan 3 tot 5 dagen duren. Houd het blok met de foetus op een shaker tijdens de hele procedure. Foetussen kunnen gedurende lange perioden in 100% BABB-oplossing blijven.
        OPMERKING: Als de foetus niet correct is uitgedroogd, wordt deze licht doorschijnend ("witachtige" emulsie) na het eerst toevoegen van BABB. Als dit gebeurt, stap dan terug in pure methanol en voer twee extra wasbeurten uit in verse methanol. Koel monsters nooit tijdens het uitdrogen en opruimen, omdat de temperatuurveranderingen kunnen leiden tot watercondensatie.
      3. Bevestig het gewiste agaroseblok aan de motoras van de OPT-scanner, pas de optiek aan om een beeld van de hele foetus te verkrijgen en ga verder met het verkrijgen van een volledige projectiedataset19,28.

2. Microscoop / beeldverwerving

  1. Kies voor correcte 3D- en 4D-beeldvorming de microscoop die het beste bij het experimentele doel past. Tabel 2 bevat algemene informatie om de selectie te begeleiden.
Optische microscopietechnieken Beeldvormingsprincipe Experimenteel doel en overwegingen
Widefield beeldvorming Maakt gebruik van fluorescentie, gereflecteerd of doorgelaten licht. Ideaal voor een snel en algemeen overzicht van het embryo (bijvoorbeeld voor screenings en om ontwikkelingsstadia en voor de hand liggende fenotypes te beoordelen). De verminderde scherptediepte, vergeleken met de waarneembare dikte bij hoge vergrotingen, maakt geen nauwkeurige interpretatie of analyse van 3D-morfologie mogelijk.
Confocal (laserscannen; CLSM) Maakt gebruik van laserscanverlichting en detectie van fluorescentie door een gaatje. Maakt beeldvorming van optische plakjes fluorescerend gelabelde monsters mogelijk, idealiter met een sterk signaal. Beeldvorming door een gaatje verwijdert het signaal uit de scherptediepte, waardoor nauwkeurige discriminatie van informatie in 3D mogelijk is. De acquisitie is ordes van grootte langzamer dan widefield, maar met ongeëvenaard contrast en 3D-discriminatie van morfologie. Een hoge temporele resolutie is niet haalbaar omdat beelden 1 pixel per keer worden verkregen. Goed voor 3D-beeldvorming van vaste muizenembryo's tot E9.5. Beeldvorming door het hele presomitische mesoderm of somites vereist weefselzuivering, vanwege lichtverstrooiing in diepere weefsels. Fototoxiciteit en bleken is een overweging. Fotobleaching kan, binnen grenzen, a posteriori worden gecompenseerd. Fototoxische effecten in levende monsters kunnen en zijn vaak niet gemakkelijk te bepalen. Dit is duidelijker als monsters een lage expressie vertonen en hoge laservermogens nodig zijn.
Twee-foton excitatie fluorescentie (TPEFM) Het maakt gebruik van gepulseerde nabij-infrarood (NIR) laserexcitatie in plaats van zichtbare laserverlichting. TPEFM maakt optische snijbewerking mogelijk door dikkere monsters dan CLSM. De resolutie is iets lager, maar het contrast in diepere weefsels is aanzienlijk beter, waardoor het ideaal is voor live beeldvorming van muizenembryo's. Hoewel TPEFM vaak als minder fototoxisch wordt beschouwd dan conventionele CLSM, vereist het hoge laservermogens die ook schadelijke effecten op cellen en weefsels kunnen hebben. Ideaal voor 3D-beeldvorming van embryo's tot E11.5, hoewel beeldvorming door het hele presomitische mesoderm nog steeds weefselverwijdering vereist.
Confocal (draaiende schijf) Een vorm van confocale die, in plaats van een enkele laser, meerdere puntachtige bronnen gebruikt. Het gebruik van meerdere puntachtige structuren maakt het mogelijk om sneller optische segmenten te maken (meerdere frames per seconde of stapels per minuut zijn haalbaar) dan CLSM. De overname gaat praktisch net zo snel als widefield, met redelijke 3D-discriminatie. Het maakt echter alleen beeldvorming van de meest oppervlakkige weefsels van het muizenembryo mogelijk. Maakt meer gevoelige detectie mogelijk dan CLSM, waardoor het een alternatief is voor embryo's met een lage expressie van fluorescentie-eiwitten.
Lichtplaat / enkelvlaks (LSFM/SPIM) In plaats van widefield- of puntachtige verlichting wordt het monster één orthogonaal vlak tegelijk verlicht. In de meeste configuraties maakt het beeldvorming vanuit meerdere hoeken mogelijk. Vereist ook fluorescerend gelabelde monsters. Acquisitie van optische plakjes acquisitie is extreem snel (meerdere frames per seconde) en heeft verminderde effecten van fototoxiciteit of bleken. Als multiview echter vereist is, kunnen volgende voorbewerkingsstappen voor gegevensset uren/dagen berekening vereisen. LSFM/SPIM maakt een betere detectie van lagere expressieniveaus mogelijk dan CLSM. Ideaal voor 3D-beeldvorming van in toto muisembryo's tijdens gastrulatie. Monsters moeten vaak in suspensie worden gemonteerd en onderhouden (onconventionele voorbereiding).
Optische projectietomografie (OPT) Optische plakjes worden niet gedetecteerd, maar berekend op basis van een reeks widefield-beelden van het hele embryo vanuit verschillende hoeken (de "projecties"). Ideaal voor 3D-beeldvorming van muizenembryo's/foetussen in een later stadium (>5mm), maar alleen gefixeerd en gewist. Heeft het voordeel van het produceren van 3D-stapels optische plakjes van zowel fluorescerende als niet-fluorescerende monsters. Datasets zijn isometrisch (segmenten met gelijke resolutie in alle drie de dimensies) waardoor het ideaal is voor anatomische analyse. Het verkrijgen van een projectiedataset kan slechts enkele minuten duren, gevolgd door 15-30 minuten reconstructie.
Optische Coherentie Tomografie (OCT) Maakt gebruik van NIR-verlichting door het monster om optische plakjes te verkrijgen op basis van interferentie met lichtreflectie. OCT maakt eenvoudige beeldvorming door levend weefsel mogelijk (een paar millimeter diep in het monster zonder fluorescerend contrast) met een resolutie van enkele tientallen micrometers. De acquisitie gaat erg snel (een paar plakjes per seconde). Hoewel het een mogelijk alternatief is voor OPT, is deze techniek niet algemeen beschikbaar.
Superresolutie (SR), atoomkracht (AFM) of near-field imaging (NSOM) SR is normaal gesproken gebaseerd op lokalisatie van één molecuul en AFM/NSOM op scanoppervlakken met subdiffractieresoluties (enkele nanometers). Maakt beeldvorming op subdiffractieniveau (resolutie van <200 nm mogelijk), vaak met de bedoeling om afzonderlijke moleculen of moleculen aan het celoppervlak te detecteren. Niet ideaal voor morfologische analyse van grote monsters zoals muizenembryo's. De acquisitie is meestal een langzaam proces (seconden tot minuten per afbeelding).

Tabel 2 - Algemene informatie om de selectie van de beeldvormende techniek/microscoop te begeleiden die meer geschikt is voor het specifieke experimentele doel van de onderzoeker.

3. Voorbewerking van beeldgegevenssets

OPMERKING: Hier belichten we enkele van de belangrijkste stappen van de voorbewerking van beeldgegevenssets, namelijk ruisonderdrukking (3.1) en deconvolutie (3.2), en bieden we algoritmen die een goede voorbereiding en voorbewerking van 3D-datasets tijdreeksen (3.3) en whole-mount immunofluorescentiekleuringen (3.4) mogelijk maken. Ten slotte geven we referenties aan die in detail een protocol beschrijven voor opt dataset pre-processing en reconstructie.

  1. Ruisonderdrukking
    1. Als de beelden een verminderde signaal-ruisverhouding laten zien, overweeg dan om een klassieke methode toe te passen, zoals een "Mediaan" -filter of "Anisotrope diffusie" beschikbaar in Fiji / ImageJ29, of een meer uitgebreide methode op basis van Machine Learning zoals "CARE"30 of "Noise2Void"31.
      OPMERKING: Dit is vooral relevant voor live imaging datasets, waar de fotobleaching en fotoschade een grote zorg is, en lagere belichtingen en hogere detectorwinsten noodzakelijk zijn.
  2. Deconvolutie
    1. Als de beelden zijn verkregen met een hoge resolutie (in de buurt van of bij Nyquist-bemonstering), overweeg dan om beeldherstel uit te voeren met deconvolutie om de kwaliteit van de dataset vóór analyse te verbeteren. Pas op dat sommige deconvolutietools ook een denoising-stap bevatten.
      OPMERKING: Dit is uitgebreid behandeld in Krull et al.32 en in documentatie die beschikbaar is op de Huygens deconvolution software website (https://svi.nl/HomePage).
  3. Een tijdreeks van een 3D-dataset voorbereiden voor de juiste visualisatie en analyse
    OPMERKING: Vaak kan embryo- of stadiumdrift optreden tijdens time-lapse beeldvorming. Dit moet worden gecorrigeerd voordat de analyse wordt uitgevoerd. Soms is de drift zo ernstig dat de overname moet worden onderbroken en aanpassingen moeten worden gedaan. In dit geval is het het beste om dezelfde X-, Y- en Z-afmetingen te behouden.
    1. Afzonderlijke 4D-stacks kunnen worden samengevoegd tot een enkele 4D-hyperstack met behulp van fiji's "concatenate" -functie. Deze tool verwerkt echter geen composiet / hyperstacks, dus het is noodzakelijk om alle 4D-segmenten om te zetten in eenvoudige stapels met behulp van de bewerking Image | Hyperstacks | Hyperstack om te stapelen. Houd een nummeringssysteem bij om de volgorde van deze 4D-segmenten te handhaven en noteer de informatie over elk segment (kanalen, segmenten, tijdpunten). Herhaal de procedure voor alle segmenten en voeg ze vervolgens samen met behulp van de procedure Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Aaneenschakeling.
    2. Reconstrueer de aaneengeschakelde hyperstack met de bewerking Image | Hyperstacks | Stapel naar Hyperstack en kies de juiste volgorde van de verschillende dimensies. Inspecteer de Hyperstack om er zeker van te zijn dat alle dimensies correct zijn geordend.
      OPMERKING: Het aantal kanalen (c) en segmenten (z) moet hetzelfde zijn voor alle 4D-segmenten; het aantal (tijd) frames (t) moet gelijk zijn aan het totaal aantal toegevoegde tijdspunten voor alle 4D-segmenten. Het is belangrijk om door de stack te bladeren om te begrijpen hoe de verschillende dimensies worden geïnterpoleerd, voordat u de conversie naar hyperstack uitvoert. Fiji/ImageJ is standaard afwisselende kanalen, vervolgens afwisselende Z-segmenten en vervolgens afwisselende tijdspunten ("XYCZT"). Controleer of dit van toepassing is op de gegevens die door de microscoop worden gegenereerd.
    3. Kies Samengesteld als weergavemodus en sla op als TIFF (Tagged Image File Format). Voor grote datasets, overweeg om te converteren naar BigDataViewer33 formaat, door het uitvoeren van de bewerking Plugins | BigDataViewer | Exporteer huidige afbeelding als XML/HDF5. Dit genereert een dataset die efficiënter en in 3D kan worden doorzocht met behulp van de BigDataViewer en kan worden afgehandeld door andere Fiji / ImageJ-tools voor big-data datasets.
    4. Registreer de aaneengeschakelde hyperstack (tijdreeksen van 3D-stacks) om embryo/stage drift te compenseren met behulp van de "Correct 3D Drift" ImageJ plugin34 of de BigStitcher plugin35, afhankelijk van de mate van de drift correctie die nodig is. XML/HDF5-bestanden kunnen worden geopend met BigStitcher.
      OPMERKING: Het is noodzakelijk om de registratie van 3D-time-lapses uit te voeren die embryodrift laten zien voordat wordt geprobeerd celtracking of bewegingsanalyse uit te voeren; corrigeren voor drift is ook nodig om morfogenetische bewegingen goed te interpreteren.
  4. Voorbewerking van datasets van immunofluorescentie beeldvorming
    1. Z-diepte signaalverzwakking
      OPMERKING: Hoewel de methode die we voorstellen om signaalverzwakking te corrigeren nuttig kan zijn, moet dit zorgvuldig worden gebruikt, omdat vaak minder signaal in de diepte een biologisch en geen optisch fenomeen kan weerspiegelen. Overweeg het meten van het verval in een gebied van weefsel waar het molecuul van belang naar verwachting niet aanwezig of uitgedrukt zal zijn en pas de compensatie voor dat gebied aan. Als er nog steeds een lager positief signaal in de diepte is, kan dit een daadwerkelijk biologisch fenomeen onthullen. Bedenk ook dat sommige delen van het monster meer verstrooiing of laserverzwakking kunnen produceren dan andere, en dat het niet volledig zal worden gecorrigeerd met deze eenvoudige methode.
      1. Voor dikkere/late-stadium embryo's kunnen bundelverzwakking, fotobleaching en sferische aberratie veroorzaakt door mismatch van brekingsindices (tussen het montagemedium en het microscoopobjectief) resulteren in datasets waarbij de fluorescentie-intensiteit sterk wordt verzwakt in de diepere segmenten van de Z-stack. Compenseer daarom dit signaalverlies vóór de analyse. Het analytisch bepalen van de meest nauwkeurige demping is complex en sterk steekproefafhankelijk36, maar een snelle benadering kan empirisch worden bepaald in ImageJ / Fiji met behulp van de Process | Wiskunde | Macrofunctie en klik op Voorbeeld.
      2. Laad de Z-stack in Fiji/ImageJ en voer vervolgens de procedure Image | Stapels | Reslice. Begin bij: bovenaan, houd Interpolatie vermijden aangevinkt en OK. Nu zal de "Z" de "Y" -as zijn. Voer vervolgens Afbeelding | | Vuur (of een andere veelkleurige LUT). Dit zal helpen om visueel de beste compensatie te beoordelen tijdens de volgende stappen. Schakel over naar een plak in het midden van het embryo, waar de effecten van verzwakking in de diepte duidelijk zichtbaar zijn (de intensiteit daalt van de bovenkant [oppervlakkig] naar de bodem [dieper]).
      3. Ga verder met het bepalen van de correctie van de verticale ("y") intensiteitsdaling met de procedure Proces | Wiskunde | Macro, en voeg de volgende "Code" precies zoals hier geschreven:
        v = v * A * exp ( B * j/h )
        In deze uitdrukking is "v" de variabele voor pixelintensiteit (die wordt aangepast als een functie op diepte), "y" de variabele voor diepte en "h" voor volledige diepte, en "exp" is een exponentiële functie; "A" moet worden vervangen door een getal tussen 0,5 en 1,0 (kies lagere waarden om oververzadiging van de bovenste lagen van de Z-stack te voorkomen); B vervangen door een getal tussen 0,5 en 2,0, afhankelijk van hoe ernstig de Z-diepteverzwakking is - idealiter zou het 1 moeten zijn, maar in sommige gevallen is minder (of meer) nodig om de onderste lagen correct te compenseren; een hogere waarde van B zal resulteren in een meer verzwakkingscompensatie. Klik op Voorbeeld om een eerste beoordeling te maken. Test verschillende waarden van A en B totdat voldoende compensatie van boven naar beneden van het beeld is verkregen (de "Fire" LUT kan nuttig zijn voor deze beoordeling). Als u tevreden bent, past u de instellingen toe door op OK te klikken.
        OPMERKING: Dit moet in elk kanaal afzonderlijk worden uitgevoerd, omdat rood verschoven kleurstoffen en lasers minder kunnen dempen en sommige kleurstoffen sneller bleken dan andere. Houd er rekening mee dat deze procedure mogelijk niet nauwkeurig genoeg is om betrouwbare kwantificering van fluorescentie-intensiteitsvariaties in diepte mogelijk te maken, hoewel het zeker betrouwbaarder is dan het uitvoeren van kwantificeringen rechtstreeks in de oorspronkelijke 3D-dataset die ernstig wordt beïnvloed door de verzwakking van het signaal in de diepte. Een manier om dit effect te identificeren en te controleren, is door verschillende embryo's van de dorsale of ventrale zijden te vergelijken.
      4. Herstel de oorspronkelijke geometrie van de gecompenseerde Z-stack door Image | Stapels | Reslice, begin bovenaan, houd Interpolatie vermijden aangevinkt en nu moet de "Y" weer het "Z" -vlak worden; vervang de kleur door 'Afbeelding | | opzoektabellen Grays" (of de andere LUT naar keuze). Gooi de oorspronkelijke niet-gecompenseerde z-stack weg en sla de gecompenseerde versie op.
        OPMERKING: Zie aanvullende figuur 2 als representatief resultaat van de Z-dieptesignaalverzwakkingsmethode.
    2. Correctie voor schalen op Z-as
      1. Als beeldvorming met een objectief is ontworpen voor een brekingsindex die verschilt van die welke wordt gebruikt voor het monteren van de embryo's, is het noodzakelijk om de plakdikte opnieuw te schalen, anders zullen dieptemetingen onjuist zijn (mogelijk met 50% bij gebruik van een "droog" objectief op een weefselgeklaard embryo). Dit wordt uitgelegd, beoordeeld en de verschillende methoden besproken, in 37 en 38. Het analytisch bepalen van de werkelijke Z-asvervormingsschaal is complex, maar een aanvaardbare benadering kan eenvoudig worden bepaald door de verhouding te vinden tussen de brekingsindex van het monster en de brekingsindex van het objectief (bijvoorbeeld 1,53/1,0 voor een methylsalicylaat-gewist embryo afgebeeld met een droog 20 x objectief, of 1,56/1,33 voor een embryo dat is gewist met BABB en is afgebeeld met een onderdompelingsdoel in water).
      2. Met de Z-stack dataset al geopend in Fiji/ImageJ (voor meerkanaals afbeeldingen, nadat ze als "composiet" met alle kanalen zijn samengesteld), ga naar Image | Eigenschappen en wijzig de Voxel-diepte in de plakdikte die wordt verkregen tijdens beeldacquisitie vermenigvuldigd met de Z-as schaalcorrectie die in de vorige stap is bepaald (4.2.1; Sectie "Voorbewerking van afbeeldingsgegevenssets"). Bevestig het resultaat met de afbeelding | Stapels | Orthogonale weergaven.
    3. Herpositionering van embryo naar een anatomisch standaardpositie met behulp van Fiji /ImageJ
      OPMERKING: Herpositionering van het embryo (zie de voordelen benadrukt in Aanvullende figuur 3) in een gestandaardiseerde anterieur-posterieure [A-P] en dorsaal-ventrale [D-V] aspositie met behulp van Fiji / ImageJ, vereist de installatie van de TransformJ 39 suite van plug-ins van Fiji's "ImageScience" update website.
      OPMERKING: Deze techniek heeft de voorkeur boven rondes van rotaties in de drie vlakken die aliasing artefacten en degradatie van de resolutie zouden introduceren. Omdat de Fiji/ImageJ 3D-viewerplug-in echter niet goed kan omgaan met datasets groter dan 200-300 Mb (de plug-in mag geen onvoorspelbaar gedrag vertonen of vertonen wanneer de kijkhoek wordt geroteerd), moet de oorspronkelijke 3D-gegevensset eerst worden gedownsampled.
      1. Begin met het verkleinen van de datasetgrootte in Fiji's Image | Schaal en voeg vervolgens de X-, Y- en Z-waarden in die nodig zijn om de dataset te verminderen tot minder dan 200 Mb (bijvoorbeeld een 0,5 x 0,5 x 0,5 down-sampling zal resulteren in een dataset die 8 keer kleiner is). Zorg ervoor dat de optie Nieuw venster maken is aangevinkt.
      2. Ga vervolgens naar Plugins | 3D-viewer. Klik in het 3D-viewervenster op het embryo om het te selecteren en er zou een rood 3D-vak moeten verschijnen. Bij gebruik van deze modus (met het rode vak geactiveerd), kan de rotatie van de dataset worden geregeld met de muis, in tegenstelling tot het standaardgedrag, namelijk het roteren van de kijkhoek. Wanneer u het embryo met de muis verplaatst, klikt u nooit naar buiten, anders wordt de dataset gedeselecteerd.
      3. Wanneer u tevreden bent met de nieuwe positie van het embryo, selecteert u Bewerken | Transformatie | Exporteer getransformeerde afbeelding in het menu van het venster "3D-viewer". Om de verschillende orthogonale vlakken te inspecteren ga naar Image | Stapels | Orthogonale weergaven. Als het embryo niet correct is gepositioneerd, sluit u het venster en gaat u terug naar het 3D-weergavevenster en past u het opnieuw aan. Herhaal stap 4.3.2.
      4. Wanneer het embryo correct is gepositioneerd, selecteert u in het venstermenu "3D-viewer" Bewerken | Transformatie | Sla transformatie op en sla de transformatiematrix op in een tekstbestand met de extensie *.mat. Open dit tekstbestand met Fiji/ImageJ, verwijder de eerste twee regels (tekst) en sla het opnieuw op. Dit creëert een transformatiematrixbestand dat compatibel is met de plug-in "TransformJ" die wordt beschreven in 39.
      5. Schakel over naar de dataset met volledige resolutie (kan een multi-channel composiet hyperstack zijn) en voer de bewerking Plugins | TransformJ | TransformJ affiene. Blader in het nieuwe venster om te zoeken naar het matrixbestand dat eerder is opgeslagen, selecteer de Cubic B-Spline-interpolatie | isotroop opnieuw | Oké.
        OPMERKING: Deze bewerking is geheugen- en CPU-intensief. Afhankelijk van het werkstation en de grootte van de dataset kan de bewerking minuten tot uren duren. Het gebruik van de resample isotropische optie garandeert dat er geen resolutie verloren gaat tijdens de transformatiebewerking, dus de dataset zal aanzienlijk in omvang toenemen en zal niet langer anisotroop zijn zoals de oorspronkelijke confocale z-stack; het is te verwachten dat het aantal segmenten in de Z-as toeneemt tot hetzelfde aantal X- en Y-pixels van elk segment en dat de stapel opgeblazen is tot 5-10x de oorspronkelijke grootte. Dit is nodig om te garanderen dat er geen informatie verloren gaat tijdens de interpolatie van voxels tijdens rotatie en vertaling.
      6. Zodra het embryo goed is verplaatst, is het vaak mogelijk om het grootste deel van de lege ruimte rond het embryo te trimmen. Voer een volledige Z-projectiebeeldafbeelding uit | Stapels | Z Project... en kies Maximale intensiteit; teken de minimale ROI die het hele embryo in X en Y bevat. Schakel over naar de originele datasetafbeeldingsvensters, ga naar Bewerken | Selectie | Herstel de selectie en snijd bij door Afbeelding | bijsnijden te selecteren.
      7. Snijd de plakjes in het begin en het einde die embryoweefsels niet kruisen. Selecteer hiervoor Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Slice remover en geef het eerste en laatste segment op dat moet worden verwijderd, zorg ervoor dat u de "increment" wijzigt in 1 (anders worden alleen elk ander segment verwijderd).
      8. Na het herpositioneren en bijsnijden van de nieuwe dataset moet u opslaan als een nieuw TIFF-bestand. Als deze gegevensset te groot is (meer dan het GPU RAM-geheugen), overweeg dan om BigDataViewer te gebruiken om te exporteren als XML/DHF5, zoals uitgelegd in stap 3.3 (uit de sectie "Image dataset pre-processing").
  5. OPT dataset pre-processing en reconstructie
    1. Gebruik het protocol voor opt dataset pre-processing en reconstructie beschreven in Martins et al.19 en Gualda et al.28.

4.3D rendering, visualisatie en analyse

OPMERKING: Hier bieden we een lijst met mogelijke toepassingen van verschillende softwaretools, die de visualisatie en analyse van 3D-beeldvormingsdatasets mogelijk maken of verbeteren.

  1. 3D rendering en visualisatie met Drishti
    OPMERKING: Drishti40 is een gratis wetenschappelijke visualisatiesoftware die is ontworpen om 3D- en 4D-datasets van micro-CT, confocale / multifoton en lichtbladmicroscopie te verkennen en te presenteren. Hier gebruiken we deze software voor 3D-rendering en visualisatie van immunofluorescentiekleuring met hele vatting (stap 2; Sectie "Monstervoorbereiding voor 3D-beeldvorming"). Er zijn meerdere tutorials online om gebruikers te helpen begrijpen hoe drishti te bedienen; zoek online naar "Ajay Limaye Drishti 3D tutorials". Drishti kan stapels TIFF-bestanden niet direct lezen, dus moeten ze eerst worden geconverteerd naar het native "pvl.nc" -formaat.
    1. Voer het hulpprogramma "drishtiimport.exe" uit in de installatiemap van Drishti: Bestanden | | laden Bestanden | kies "Tiff-afbeeldingsbestanden in grijswaarden en laad een 3D-stack met één kanaal, zoals opgeslagen vanuit Fiji/ImageJ. In het geval van een composietstack met meerdere kanalen, splitst u de kanalen in Fiji /ImageJ en slaat u ze afzonderlijk op. Voxel-type is "ushort"; "Bestand"..."Opslaan als"..."TIF", antwoord "y" op alle vragen. Zorg ervoor dat u in het venster Aanvullende informatie om voxelgrootte vraagt om de juiste voxelmaten "X Y Z" toe te voegen.
    2. *.pvl.nc bestanden laden in Drishti en renderen: In het hoofdvenster van Drishti | | laden Laad 1 ( - 4 ) volumes afhankelijk van het aantal beschikbare kanalen (als afzonderlijke bestanden). Druk na het laden op F2 voor render van hoge kwaliteit. Deze actie vereist een krachtige GPU-kaart. Informatie om de renderingparameters te verwerken, Transfer functie-editor, zoeken op de online tutorials. Zodra u tevreden bent met de renderingeigenschappen, gaat u verder met het genereren van een geanimeerde rendering.
    3. Ga naar Weergave en activeer de hoofdframe-editor. Behandel het embryo en plaats het in de gewenste uitgangspositie. Gebruik de rechtermuisknop om het embryo indien nodig naar het midden te "slepen", of de muis scroll om in te zoomen. Druk op Hoofdframe instellen in de hoofdframe-editor, kies vervolgens een andere positie, hoek of zoom, sleep de tijdlijnmarkering naar een ander tijdstip en stel het hoofdframe opnieuw in . Nu zijn er 2 keyframes waarbij het embryo in 2 verschillende posities/hoeken/zoom vertegenwoordigd is, en een aantal frames daartussen. Door op de afspeelknop te drukken, kan Drishti de ontbrekende omstandigheden interpoleren en afspelen als een animatie. Ga naar Bestand | Sla de afbeeldingsreeks op om de geanimeerde reeks van alle frames op te slaan. Deze framereeks kan later worden geopend in Fiji / ImageJ en worden opgeslagen als AVI (File | | importeren Beeldreeks ... Bestand | Opslaan als | JPEG-compressie met een redelijke framesnelheid (we raden 15 - 30 aan).
      OPMERKING: Hoewel Drishti het opslaan van * .wmv video's toestaat, is het raadzaam om in plaats daarvan op te slaan als afzonderlijke frames en pas later de serie te converteren naar AVI- of MOV-videoformaat (dit kan worden gedaan met Fiji / ImageJ).
  2. 3D reconstituties en handmatige segmentatie van weefsels met behulp van Amira
    OPMERKING: Deze commerciële software maakt het mogelijk, handmatig of automatisch / semi-automatisch, 3D-segmentatie van embryonale weefsels in 3D-datasets. Er is een online "Learning Center" voor deze software met meerdere tutorials beschikbaar 41. Hieronder worden de basisstappen beschreven die nodig zijn om embryonale weefsels handmatig te segmenteren uit met immunofluorescentie bevlekte embryo's (stap 1.2). Handmatige segmentatie is veel eenvoudiger nadat het embryo correct is geplaatst in een standaard A-P/D-V-as (zie de sectie "Image dataset preprocessing", stap 4.3).
    1. Laad een 3D TIFF-gegevensset. Zorg ervoor dat u de juiste voxelafmetingen opgeeft wanneer daarom wordt gevraagd. Maak en verbind een visualisatiemodule (bijvoorbeeld "Orthoslice" of "Volren") en inspecteer de dataset in 3D.
    2. Verbind het veld Label (of Nieuw labelveld bewerken in nieuwere versies van Amira). In deze software worden resultaten van handmatige segmentatie opgeslagen in "materialen", dus maak één materiaal voor elk weefsel van belang. Gebruik de "lasso" tool voor handmatige segmentatie. Er zijn verschillende tutorials beschikbaar waarin wordt uitgelegd hoe u dit kunt uitvoeren (zoek online naar "Amira Segmentation Editor tutorial").
    3. Wanneer u klaar bent met segmentatie van alle interessante weefsels, sluit u de segmentatie-editor af door terug te schakelen naar de projectmodus . Na het maken van een nieuwe versie van de dataset (het "labelsveld", dat nu is gekoppeld aan de oorspronkelijke datasetmodule) waarin pixels van elk materiaal dezelfde waarde hebben.
    4. Zet deze "materialen" om in 3D-objecten door 3D-oppervlaktemodellen te genereren uit de dataset "Labels". Dit kan worden gedaan door een module "Oppervlak genereren" te bevestigen en parameters indien nodig aan te passen (activeer de opties "compactify", "border", "Adjust coords" en "Unconstrained Smoothing"). Klik op Toepassen en er wordt een nieuwe module *.surf gegenereerd.
    5. Het visualiseren van de oppervlakteobjecten, het individueel extraheren en exporteren als *obj-bestanden. Een beeldscherm | aansluiten SurfaceView-module naar de *.surf-module en inspecteer in de hoofdviewer. Selecteer in het paneel "eigenschappen" van de module "SurfaceView" in de eigenschap "Materialen" alles + alles en klik op verwijderen, zodat de buffer van de kijker wordt geleegd. Selecteer vervolgens in de tweede pull-down van de eigenschap Materialen slechts één materiaal en klik op Toevoegen aan de buffer; alleen dat materiaal moet zichtbaar zijn.
    6. Klik in de eigenschap Tekenstijl op meer opties | oppervlakte maken en er wordt een nieuwe *.surf module gemaakt en aan het project toegevoegd. Wijzig de naam van het weefsel (druk op F2 op het toetsenbord) en bestand | Gegevens exporteren als... en Opslaan als type: Wavefront (*.obj). Herhaal de bewerking voor elk materiaal.
      OPMERKING: Deze *.obj-bestanden, die elk een van de weefsels bevatten die in Amira zijn gesegmenteerd, kunnen worden gebruikt door andere tools ("3Dviewer" -plug-in van Fiji / ImageJ en SimLab).
  3. Interactieve 3D-visualisatie in een draagbaar documentformaat (PDF) met SimLab Composer
    OPMERKING: Deze 3D Computer Graphics-software vergemakkelijkt het maken van oppervlakte gerenderde afbeeldingen, animaties en simulaties. Handige tutorials zijn te vinden op regel 42. Hier beschrijven we hoe deze software het mogelijk maakt om interactieve 3D PDF-illustraties te maken, met behulp van de wavefront (*.obj) 3D-oppervlaktebestanden die zijn gemaakt met Amira (Stap 2.3; Sectie "3D-rendering, visualisatie en analyse").
    1. Ga naar Bestand | Nieuw en creëer een lege scène. Vervolgens bestand | importeert u het 1e *.obj-bestand dat is opgeslagen bij Amira. Houd alle opties van het venster Bestand importeren uitgeschakeld en klik op OK.
    2. Als er niets wordt weergegeven in het weergavevenster van de Componist, klikt u op Ctrl+F of het pictogram om alles aan te passen. Nu zou het gesegmenteerde object in het midden van het venster moeten verschijnen. Herhaal het proces om nog een gesegmenteerd object toe te voegen en de positie ten opzichte van het 1e object te bevestigen (bijvoorbeeld 2 aangrenzende somites).
    3. Selecteer een van de objecten in het weergavevenster door met de linkermuisknop te klikken, de naam te wijzigen om de naam van de anatomische structuur of het weefsel weer te geven, schakel vervolgens over naar de weergave "3DGeom ~ 1" en wijzig met behulp van het deelvenster Materialen de kleur door de R, G, B-waarden te wijzigen.
    4. Herhaal dit voor alle objecten totdat de 3D-illustratie volledig is samengesteld. Merk op dat sommige materialen ook transparant kunnen worden gemaakt door het "Alpha" -kanaal te manipuleren, naast de RGB-waarden, en daardoor observatie van interne of afgesloten objecten mogelijk maken.
    5. Met deze software kan de geassembleerde embryo-illustratie worden geëxporteerd als een "3D PDF" -bestand, dat kan worden opgenomen in publicaties. Maak eerst een "sjabloon" met tekst en actieve links om "Scènestatussen" te wijzigen om instructies en drie verschillende fasen in dezelfde illustratie te kunnen opnemen. Dit kan worden gedaan door over te schakelen van de modus "Scènes bouwen" naar "Delen" (knoppen aan de linkerkant van het venster Componist), vervolgens op PDF-instellingen weergeven te klikken en een nieuwe paginasjabloon te maken. Als u een eenvoudige interactieve figuur wilt maken om in een manuscript op te nemen, gebruikt u geen sjabloon en exporteert u eenvoudig PDF.
      OPMERKING: Gebruik Adobe Acrobat Reader-software om te werken met de 3D-PDF's (de werking van de functies in de interactieve 3D PDF-illustratie kan variëren, afhankelijk van de beschikbare versies van Acrobat Reader). De meeste andere viewers zijn niet compatibel met de 3D PDF-indeling, inclusief webbrowsers. Dergelijke interactieve 3D PDF-illustraties kunnen worden opgenomen in publicaties; vraag redacteuren vooraf naar deze mogelijkheid.
  4. 3D visualisatie en analyse met Imaris
    OPMERKING: Deze software maakt uitgebreide beeldvormingsvisualisatie, analyse en interpretatie van 2D-4D-microscopiedatasets mogelijk, met intuïtieve interface en workflows. Er zijn verschillende handige tutorials online over hoe u aan de slag kunt gaan met deze software, beschikbaar op de website (https://imaris.oxinst.com/tutorials). Om effectiever te laden en te communiceren met grote datasets in Imaris (meestal die groter dan het GPU-geheugen), is het raadzaam om de dataset eerst te converteren naar "*.ims", met behulp van het programma "ImarisFileConverter.exe" dat is geïnstalleerd in de Imaris-installatiemap. De ImarisFileConverter kan vele microscopie-afbeeldingsformaten lezen, waaronder OME- en "h5" -bestanden zoals opgeslagen door Fiji's BigDataViewer.
    1. 3D visualisatie
      1. Deze software kan een 3D-visualisatie van de dataset renderen met behulp van de "3D View" -modus en de gebruiker kan verschillende aanpassingen aanbrengen in de manier waarop de dataset wordt weergegeven [bijvoorbeeld kiezen tussen MIP (Maximale intensiteitsprojectie) of overvloeimodus (betere weergave met dieptesignalen en schaduwen)].
      2. Orthogonale weergaven" -modus - Met de juiste embryopositionering (stap 4.3; "Image dataset pre-processing" sectie) kan men het tabblad "Sectie" gebruiken en door het hele embryo navigeren en optische secties zien vanuit de normale vlakken (transversaal, coronaal en sagittaal). Als embryo's niet goed worden geherpositioneerd, is het interpreteren van hun anatomie met orthogonale vlakken uiterst moeilijk (zie aanvullende figuur 3). Hoewel Imaris een functie heeft die bekend staat als "referentiekader" om dit probleem te omzeilen bij het analyseren van 3D-embryo's, verdient het de voorkeur om de datasets a priori te herpositioneren.
    2. 3D-analyse
      OPMERKING: Deze software heeft ook verschillende hulpmiddelen voor het analyseren van morfologie en fluorescentie-intensiteiten. Als voorbeeld beschrijven we hier een eenvoudige workflow om variaties in de intensiteit van weefselfluorescentie in de loop van de tijd te analyseren met behulp van de Imaris "Spots" -tool, waarbij de gebruiker handmatig sferische gebieden van belang (ROIs) in het embryo in 3D plaatst, en Imaris kan vervolgens de weefselfluorescentie in deze bolvormige ROI's meten.
      1. Laad een 3D- of 4D-gegevensset in Imaris en voeg een nieuwe plek toe in de 3D-weergavemodus . Vervolgens kan men specifieke punten van het embryo selecteren (ook gedurende meerdere tijdspunten als men een 4D-dataset gebruikt) en binnen die vlekken kwantificeren, bijvoorbeeld het intensiteitsgemiddelde.
        OPMERKING: Met deze software kunt u ook de intensiteit in de loop van de tijd plotten. Hierdoor kan de gebruiker gemakkelijk vragen beantwoorden als: "hoe verandert de fluorescentie in een somite in de loop van de tijd?".
      2. Voeg de spotmodule toe door op de knop Nieuwe spot toevoegen te klikken of 3D-weergave te selecteren | Spots in Imaris menu. Kies Automatische reactie overslaan, handmatig bewerken. Schakel de Imaris-aanwijzermodus van Navigeren naar Selecteren (dit kan ook worden gedaan door op de ESC-toets op het toetsenbord te drukken).
      3. Selecteer in het venster Eigenschappen van Spots het specifieke kanaal waaraan de spot wordt gekoppeld (bijvoorbeeld "Kanaal 1") en activeer in Handmatig bijhouden de opties Automatisch verbinden met geselecteerde plek en Vertraging inschakelen voordat u automatisch vooruitgaat .
      4. Verplaats de muiscursor naar het visualisatievenster en de cursor moet veranderen in een holle gele draadbol. Ga naar tijdpunt 1 en voeg een vlek (=bol) toe door in het betreffende weefsel te klikken. De bol ("Spot") wordt alleen toegevoegd als u klikt terwijl u de Shift-toets ingedrukt houdt. Herhaal dit voor alle gewenste tijdspunten en zorg ervoor dat u hetzelfde deel van het weefsel in de loop van de tijd bijhoudt.
      5. Schakel in het venster Eigenschappen van vlekken over naar het tabblad Statistieken en schakel binnen de statistieken over van Algemeen naar Gedetailleerde statistieken. Kies in de eerste vervolgkeuzelijst Specifieke waarden en kies in de tweede vervolgkeuzelijst "Intensiteitsgemiddelde Ch=*...", waarbij Ch* het kanaal is waarin de meting zal worden uitgevoerd. Een knop rechts van het "Klik om tijdplotpaneel te openen" bevindt zich linksonder in het venster met spoteigenschappen. Als u op deze knop klikt, wordt een plot geopend met de mediane fluorescentie-intensiteit in de "vlekken", uitgezet in de tijd. Deze waarden kunnen ook worden geëxporteerd naar een spreadsheet voor verdere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representatieve resultaten die in dit artikel worden getoond voor zowel de live als de immunofluorescentiebeeldvorming, werden verkregen met behulp van een twee-fotonensysteem, met een 20 × 1.0 NA waterobjectief, de excitatielaser afgestemd op 960 nm en GaAsP-fotodetectoren (zoals beschreven in Dias et al. (2020)43. Optische projectietomografie werd gedaan met behulp van een op maat gemaakte OPenT-scanner (zoals beschreven in Gualda et al. (2013)28.

Live imaging (4D-analyse)
Een representatieve analyse van de LuVeLu reporteractiviteit in muizenembryo's tijdens axiale extensie, verkregen volgens de beschreven protocollen voor "Monstervoorbereiding voor live beeldvorming" (Stap 1.1; Sectie "Monstervoorbereiding voor 3D-beeldvorming"), "Voorbewerking van livebeeldgegevenssets" (stap 3; Sectie "Voorbewerking van beeldgegevenssets") en "3D-visualisatie en -analyse met imaris" (stap 4.4; "3D rendering, visualisatie en analyse") kan worden waargenomen in figuur 1 en video 1.

3D visualisatie en analyse
Een representatief resultaat voor het gebruik van immunofluorescentietests om potentiële NMP's en belangrijke regulatoren van mesodermosdifferentiatie te detecteren, verkregen volgens de protocollen die worden beschreven voor "Sample preparation for immunofluorescence microscopy" ("Sample preparation for 3D and 4D imaging" section, step 1.2), "Deconvolution" en "Immunofluorescence imaging dataset pre-processing" ("Image dataset preprocessing" section, step 3.2 and 3.4 respectievelijk), and "3D visualization and analysis using Imaris" ("3D rendering, visualisatie en analyse", stap 4.4) is waar te nemen in figuur 2.

3D-renderisatie van immunofluorescentiekleuringen
Video 2 toont een representatief resultaat voor een immunofluorescentietest om potentiële NMP's te detecteren die zijn verkregen volgens de beschreven protocollen voor "Monstervoorbereiding voor immunofluorescentiemicroscopie" (stap 1.2; Sectie "Monstervoorbereiding voor 3D- en 4D-beeldvorming"), de sectie "Deconvolutie" en "Immunofluorescentiebeeldvormingsdataset voorverwerking" (respectievelijk stap 3.2 en 3.4; "Image dataset pre-processing" sectie) en de "3D rendering en visualisatie met drishti" (Stap 4.1; Sectie "3D-rendering, visualisatie en analyse").

3D reconstructies
Video 3 werd gegenereerd volgens de beschreven methoden voor "Monstervoorbereiding voor immunofluorescentiemicroscopie" (stap 1.2; Sectie "Monstervoorbereiding voor 3D- en 4D-beeldvorming"), "Immunofluorescentiebeeldvormingsdataset voorbewerking" (stap 3.4; Sectie "Voorbewerking van beeldgegevenssets") en "3D-reconstructies en handmatige segmentatie van weefsels met behulp van Amira" (stap 4.2; "3D rendering, visualisatie en analyse"). Het toont een 3D-reconstructie, gebaseerd op immunofluorescentiekleuring, van de caudale weefsels van een E9.5 wild type (WT) muizenembryo.

Interactieve 3D illustraties
In figuur 3 presenteren we een interactieve 3D-visualisatie van een reconstructie van de caudale weefsels van muizenembryo's in een draagbaar documentformaat (3D PDF), opgesteld volgens de beschreven protocollen voor "Monstervoorbereiding voor immunofluorescentiemicroscopie" (Stap 1.2; Sectie "Monstervoorbereiding voor 3D- en 4D-beeldvorming"), "Immunofluorescentiebeeldvormingsdataset voorbewerking" (stap 3.4; Sectie "Image dataset preprocessing"), "3D reconstructies en handmatige segmentatie van weefsels met behulp van Amira", en "Interactieve 3D visualisatie binnen in een draagbaar documentformaat (PDF) met behulp van SimLab" ("3D rendering, visualisatie en analyse", respectievelijk stap 4.2 en 4.3). Dit type formaat kan gemakkelijk worden gebruikt om het communiceren van wetenschappelijke inhoud naar een meer algemeen publiek te vergemakkelijken, met name in een onderwijsomgeving. Interactieve visualisatie vereist het gebruik van Adobe Acrobat Reader (sta de 3D-plug-in toe).

OPT dataset visualisatie
Video 4 toont een representatief voorbeeld van een opt gereconstrueerde dataset, na het afbeelden van een E18.5 muis foetus. Het monster werd voorbereid zoals beschreven in de protocollen voor "Monstervoorbereiding voor optische projectietomografie" ("Monstervoorbereiding voor 3D- en 4D-beeldvorming"; Stap 1.3) de "OPT dataset pre-processing and reconstruction" (Stap 3.5) en verschillende modules van de "3D rendering, visualisatie en analyse" (Stap 4). Een gedetailleerde anatomische analyse (bijv. metingen) kan ook worden uitgevoerd in deze dataset met behulp van Fiji / ImageJ, Amira of de Imaris-software. De film bevat vier videosegmenten: de eerste toont een reeks zwart-wit sagittale plakjes geproduceerd met Fiji / ImageJ; de tweede, orthogonale weergaven geproduceerd met Imaris die interactieve 3D-slicing en weergave van orthogonale weefselporties toont; de derde toont de foetus "assemblerend" uit gekleurde sagittale plakjes, zoals bereid in Amira; het laatste videosegment toont een animatie van de foetus in 3D vanuit verschillende weergaven, voorbereid met Drishti.

Video 1 -Two-photon live imaging of LuVeLu reporter expression in Snai1-cKO and control E8.5 embryos (aangepast van ref. 43). De eerste segmenten tonen de reporteractiviteit op tijdstip = 0 (z-stack van 5 μm stapgrootte) en het tweede deel bevat de volledige live imaging (10 μm z-stacks elke 8,5 min). Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2 - 3D renderisatie van een whole-mount immunofluorescentiekleuring voor T (Brachyury) en Sox2 van een E10.5 wild type tailbud. De T-expressie wordt weergegeven in magenta, Sox2 in geel en DAPI in grijs. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3 - 3D-reconstructie van het caudale deel van een laat E9.5 wild type muizenembryo, met een focus op de contouren van verschillende caudale weefsels, waaronder mesoderm. Klik hier om deze video te downloaden. 

Video 4 - E18.5 wild type embryo zoals afgebeeld met optische projectie tomografie, met de nadruk op de in toto beeldvorming en verschillende technieken voor het visualiseren en renderen van 3D datasets. Het eerste segment toont een reeks sagittale plakjes bereid in Fiji/ImageJ, de tweede "live" orthogonale weergaven zoals weergegeven in Imaris, de derde een sequentiële weergave van gekleurde sagittale plakjes bereid in Amira, en de vierde een geanimeerde weergave voorbereid in Drishti. Klik hier om deze video te downloaden.

Figure 1
Figuur 1: 4D-analyse van LuVeLu reporter expressie in E8.5 Snai1-cKO en controle-embryo's (aangepast van ref. 43). (A) Snapshot at time-point = 0 van de LuVeLu reporter, in Snai1-cKO(Meox2-Cre+/0::Snai1flox/-) (Aa) en controle (Ab) embryo's. Naast het normale LuVeLu-signaal in het presomitische mesoderm, vertonen Snai1-cKO-embryo's ook LuVeLu-expressie in de buitenbaarmoederlijke uitstulping die ontstaat uit de primitieve streep (witte pijlen). (B) Snai1-cKO::LuVeLu+/0 temporele intensiteit gemiddelde kwantitatieve analyse in het gebied gemarkeerd door de rode vlek (Ba) wijst op het bestaan van twee pieken (bij t = 1,3 h en t = 3,6 h van de time-lapse) en een substantiële afname tussen hen, wat wijst op fietsactiviteit in de uitstulping van het voorwaardelijke mutante embryo. Er werden geen tekenen van LuVeLu-fietsactiviteit waargenomen in de buurt van de primitieve streep (groene vlek; Bb) in LuVeLu+/0 controle-embryo's. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Whole-mount immunohistochemie in E9.5 Snai1-cKO en WT embryo's (aangepast van ref. 43). (A) Immunostainings voor T (groen) en Sox2 (rood). (B) Immunostainings voor Tbx6 (groen) en Lam1 (rood). DAPI wordt blauw weergegeven. 3D-rendering (blend-modus) van het caudale deel van de verschillende embryo's (Aa, Ab, Ba en Bb). Transversale (Aa1, Ab1, Ba1, Ba2, Bb1 en Bb2) en sagittale (Aa2, Ab2, Ba3 en Bb3) optische secties samen met vergrotingen (Mag.) worden ook getoond voor de verschillende embryo's. Vergrotingen worden weergegeven zonder DAPI. Witte pijlen markeren verschillen in de locatie van sommige NMP's (T- en Sox2 dubbelpositieve cellen) in de gemuteerde embryo's. Gele pijlen en pijlpunten wijzen respectievelijk op ectopische/abnormale Tbx6- en Lam1-expressie in de Snai1-cKO-embryo's . Schaalbalken komen overeen met 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 - 3D PDF - Interactieve 3D-illustratie in 3D PDF-formaat met de 3D-reconstructies van gesegmenteerde caudale weefsels van wildtype muisembryo's tijdens axiale extensie (E8.5, E9.5 en E10.5). Segmentatie gebeurde handmatig in Amira en de 3D PDF werd geassembleerd en geëxporteerd in Simlab Composer. Interactieve visualisatie vereist Adobe Acrobat Reader (sta de 3D-plug-in toe). Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 1 - Representatief resultaat van een gebleekt embryo (na stap 3.2; Sectie "Monstervoorbereiding voor 3D- en 4D-beeldvorming"). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2 - Representatief resultaat van Z-dieptesignaalverzwakking (stap 4.1; Sectie "Voorbewerking van afbeeldingsgegevenssets"). A - vóór Z-diepte signaalverzwakking; B - goede Z-diepte signaalverzwakking; C - onjuiste Z-diepte signaalverzwakking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3 - Representatief resultaat van een whole-mount immunofluorescentiekleuring en E7.5-muizenembryo dat is geherpositioneerd (A) na "Herpositionering van embryo naar een anatomisch standaardpositie met fiji/imageJ" (stap 3.4.3; "Image dataset pre-processing" sectie) versus hetzelfde embryo zonder te worden geherpositioneerd (B). Visualisatie werd verkregen met behulp van Imaris (zie stap 4.1.2; Sectie "3D-rendering, visualisatie en analyse"). T in geel, Sox2 in magenta en DAPI in blauw. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Axiale verlenging en segmentatie zijn twee van de meest complexe en dynamische processen die plaatsvinden tijdens de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. Het gebruik van 3D- en 4D-beeldvorming met single-cell tracking wordt al enige tijd toegepast om deze processen te bestuderen bij zowel zebravis- als kippenembryo's, waarvoor toegankelijkheid en kweekomstandigheden complexe beeldvormingvergemakkelijken 19,44,45,46,47,48,49 . Daarentegen blijven de midden- en late organogenesestadia van het muizenembryo zo gedetailleerd bestudeerd, hoewel er enige vooruitgang is geboekt, bijvoorbeeld in intravitale beeldvorming50. In dit manuscript bieden we specifieke protocollen voor verschillende methodologieën die kunnen worden gebruikt voor de verwerving van multidimensionale afbeeldingen en hun analyse om de studie van NMP's en hun mesodermderivaten tijdens nek-, romp- en staartvorming te vergemakkelijken. Hoewel deze protocollen zijn ontworpen voor muizenembryo's, kunnen ze gemakkelijk worden afgestemd om te werken voor explantatiesystemen en in vitro modellen zoals 3D embryonale stamcelaggregaten zoals gastruloïden51,52. Inderdaad, indien toegepast op menselijke gastruloïden53 zouden deze methoden een betere into beeldvorming en data-analyse van menselijke axiale elongatie en segmentatie vergemakkelijken, vooral gezien de compatibiliteit van deze in vitro modelsystemen met langdurige 4D live beeldvorming. Naast deze protocollen geven we ook algemene informatie over verschillende beschikbare microscopietechnieken en hoe deze kunnen worden gebruikt om specifieke experimentele doelen te bereiken. We hopen dat deze informatie onderzoekers helpt om hun experimentele ontwerpen te verbeteren en ten volle te profiteren van de microscopie-apparatuur en beeldanalysetools die beschikbaar zijn in hun laboratoria en instellingen.

Monstervoorbereiding is een van de belangrijkste stappen van de protocollen die in dit manuscript worden beschreven, omdat een goede bewaring en verwerking van het embryo tijdens de hele procedure, van dissectie tot montage in de microscoop, essentieel is om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen. Uitdroging (en rehydratatie), bleken en opruimen zijn de meest kritieke stappen tijdens de monstervoorbereiding, die het uiteindelijke resultaat van de beeldvorming sterk beïnvloeden. Daarom hebben we deze stappen in ons protocol gedetailleerd en tips gegeven die onderzoekers zullen helpen om een vlekkeloze voorbereiding van hun monsters te bereiken. In het bijzonder hebben we het gebruik van drie verschillende oplossingen voor het opruimen van post-implantatie muizenembryo's (tot E11.5) gedetailleerd beschreven. Hoewel methylsalicylaat en BABB al enkele jaren worden gebruikt en efficiënte reinigingsreagentia zijn, is volledige laserpenetratie in sommige weefsels, met name mesoderm, soms moeilijk te bereiken. Omgekeerd bleek RapiClear zeer effectief te zijn bij het opruimen van muizenembryo's in deze ontwikkelingsstadia. In onze handen bleek het volledige laserpenetratie in de verschillende embryonale weefsels mogelijk te maken en, omdat het niet giftig is en geen uitdroging van het embryo vereist, vereenvoudigt het de belangrijkste stap van het monteren van de embryo's in de microscopie-dia aanzienlijk. Om ook de noodzaak van het manipuleren van de embryo's in de dia te overwinnen (gewiste embryo's worden erg fragiel en moeilijk te manipuleren zodra ze transparant zijn) of de noodzaak om hun toevlucht te nemen tot commerciële software (bijv. Amira of Imaris), hebben we een eenvoudige maar efficiënte pijplijn geleverd, met behulp van Fiji / ImageJ (gratis open-source software), die embryo-herpositionering naar een anatomisch standaard / specifieke positie mogelijk maakt tijdens beeldvoorbewerking zonder de gegevenskwaliteit te verliezen. Daarom verwachten we dat de methoden en details die we in dit manuscript verstrekken, de belangrijkste stap van monstervoorbereiding tijdens immunofluorescentietests zullen vergemakkelijken en bijdragen aan het verbeteren ervan.

Tijdens beeldacquisitie is het belangrijk om rekening te houden met de configuratie van het systeem, die van invloed is op hoe monsters moeten worden onderhouden voor live beeldvorming of moeten worden gemonteerd voor optimale observatie in 3D. Muizenembryo's vereisen bijvoorbeeld een verwarmingsbron, hoge niveaus van O2 en vloeibare voedingsrijke media (niet vast), waardoor het moeilijker wordt om levend te worden gehouden in een microscoop met een rechtopstaande of een conventionele lichtplaatconfiguratie. Voor een correcte 3D-beeldvorming van embryo's is immobilisatie ook belangrijk. Beschikbare optica is ook een andere belangrijke factor om te overwegen; voor een goede 3D-beeldvorming moet de voorkeur worden gegeven aan objectieven met een hoog numeriek diafragma, maar die zijn niet altijd beschikbaar, vooral wanneer grote werkafstanden vereist zijn (meer dan een paar honderd micrometer). Fysiologische (d.w.z. "dippen") lenzen zijn heel gebruikelijk voor live beeldvorming, maar deze zijn niet ideaal voor beeldvorming door een schotel met glazen bodem of voor gewiste monsters gemonteerd op BABB of methylsalicylaat. Hoewel doelstellingen die zijn geoptimaliseerd voor geklaarde weefsels steeds vaker voorkomen, zijn ze nog steeds relatief zeldzaam om te vinden in de meeste laboratoria. Het is ook mogelijk om geklaarde weefsels met conventionele doelstellingen in beeld te brengen, maar gebruikers moeten zich bewust zijn van de beperkingen en de nodige zorg voordat ze de datasets interpreteren en analyseren, zoals we in de bovenstaande secties uitleggen. Bovendien vereist nauwkeurige detectie en interpretatie van beeldvormingsresultaten altijd een zorgvuldige keuze, niet alleen van het instrument, maar ook van de bedrijfsomstandigheden en het instellen van parameters. Gebruikers worden aangemoedigd om de volgende beoordelingen 54,55,56,57 te lezen om de principes van de juiste digitale beeldvorming en interpretatie van biobeelden volledig te begrijpen.

Immunofluorescentie toegepast op (2D) histologische secties is het kenmerk geweest van studies die weefsel- en celorganisatie in embryo's proberen te begrijpen. De opkomst van whole-mount immunolabeling-methoden en niet-destructieve 3D-beeldvormingstechnieken (zoals die hier worden beschreven) heeft ontwikkelingsbiologen de middelen geboden om weefsel- en celruimtelijke organisatie in intacte embryo's te onderzoeken, waar het gemakkelijker en nauwkeuriger is om gen- en eiwitexpressie en hun relatie tot morfogenetische processen te begrijpen. Met in toto-beeldvorming is het nu mogelijk om virtuele histologie uit te voeren (virtuele sectie in willekeurige segmenten; Aanvullende figuur 3) en de 3D-visualisatie- en analysetools kunnen worden gebruikt om eenvoudig verschillende hypothesen over cel- en weefselarchitectuur en communicatie te verkennen (zie figuur 2, video 2 en video 4). Gezien het feit dat veel tijdschriften (bijv. eLife en Development) nu de mogelijkheid bieden om video's op te nemen in de online versie van het artikel, dringen we er bij onderzoekers op aan om van deze gelegenheid gebruik te maken en niet alleen 3D- en 4D-beeldvormingsexperimenten en -analyses uit te voeren, maar ook om 3D-video's te maken die hun resultaten benadrukken. Deze belangrijke verandering in de manier waarop gegevens worden gepresenteerd en gepubliceerd, zal een beter begrip van de resultaten door de onderzoekers en hun collega's mogelijk maken. Uiteindelijk hebben deze methoden het potentieel om ons begrip van gewervelde segmentatie te verbeteren, met name met betrekking tot de rol van NMP's (Attardi et al. (2018)45 en Dias et al. (2020)43 zijn twee goede voorbeelden).

In dit werk hebben we benadrukt hoe het gebruik van sommige softwaretools (bijv. Amira en Imaris, maar ook gratis open-source tools zoals Fiji / ImageJ en Drishti) 3D-gegevensvisualisatie en -analyse mogelijk maakt en verbetert in de context van axiale uitbreiding van gewervelde dieren en somitogenese. In de meeste gevallen, zoals voor verschillende bio-informaticatools, kan de hier beschreven software mogelijk worden vervangen door een andere (d.w.z. er zijn verschillende softwareoplossingen en redundanties). We vinden echter dat de "3D View" -functie in Imaris een 3D-visualisatie mogelijk maakt met een veel betere kwaliteit dan degene die is verkregen met de Fiji / ImageJ-plug-in "3D Viewer", waardoor bijvoorbeeld kan worden gekozen tussen MIP- of blend-modi. Daarnaast vinden we de functie "Orthogonal Views" in Imaris en zijn pijplijn voor 3D-analyse en kwantificering (bijv. "Spot" -module) gebruiksvriendelijker. In deze kwestie, hoewel vrijwel alle softwaretools een vorm van 3D-rendering mogelijk maken, raden we Drishti aan vanwege het unieke lichtmodel en de schaduw die het genereren van zeer realistische renderisaties mogelijk maakt (zie laatste segment van Video 4). De vuistregel voor alle bioinformatische verwerking van beelddatasets (pre-processing en 3D renderings) is dat het eindresultaat een getrouwe weergave moet blijven van wat er in het embryo wordt waargenomen. Daarom hebben we eenvoudige methoden geleverd om de problemen te verminderen die worden veroorzaakt door Z-as scaling distortion (als gevolg van refractieve indexmismatch) en dieptesignaalverzwakking (veroorzaakt door lichtverstrooiing in diepe monsters) die de kwaliteit en interpretatie van de beelddatasets ernstig beïnvloeden. Met behulp van deze algoritmen hebben we instructies gegeven om mesodermale weefsels handmatig te segmenteren en 3D te reconstrueren uit immunofluorescentiekleuringen met hele vattingen, door handmatige contouring (vaak niet mogelijk met hulpmiddelen voor geautomatiseerde segmentatie) met behulp van de Amira-software. We vinden deze software vooral nuttig voor het handmatig tellen van weefsels waar er geen duidelijke fysieke scheiding of contrastverschillen tussen hen zijn (bijvoorbeeld expressie van een specifieke transcriptiefactor). Een niet-commercieel aanbevolen alternatief voor Amira, hoewel minder krachtig, is de LabKIT Fiji / ImageJ-plug-in (https://imagej.net/Labkit).

We hebben ook onder de representatieve resultaten een voorbeeld opgenomen van een 3D-visualisatie van in toto E18.5 muisfoetus afgebeeld met optische projectietomografie, die de mogelijkheden van optische beeldvorming en 3D-beeldanalyse uitbreidt naar de volledige muisembryogenese22. Deze methodologieën kunnen worden gebruikt om skeletafwijkingen, zoals gefuseerde wervels, scoliose of spondylocostale dysostose, die later kunnen optreden als gevolg van problemen tijdens somitogenese (bijv. Lfng-mutatie)13,58,59,60,61,62 te begrijpen en te analyseren (bijv. . Belangrijk is dat deze beeldvormingsbenadering observatie van skeletmisvormingen in een globale context mogelijk maakt, inclusief andere weefsels (bijv. Spieren) die ook kunnen bijdragen aan de fenotypen die de wervelkolombeïnvloeden 63.

Ten slotte, en in overeenstemming met recent werk dat volumetrische modellen benadrukt die zijn gemaakt met beeldgegevenssets van het eMouse Atlas Project64, hebben we een gedetailleerde stapsgewijze methode beschreven die zowel kan worden gebruikt om de kracht van 3D-modellen (bijv. 3D PDF) aan een meer algemeen publiek te illustreren als om te helpen bij het bestuderen en onderwijzen van gewervelde axiale elongatie en segmentatie. We hopen dat de informatie in dit manuscript bijdraagt aan het veranderen van de manier waarop onderzoekers hun experimenten ontwerpen, analyseren en presenteren, en om onze kennis van de vorming van gewervelde lichaamsassen te verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgments

We willen Olivier Pourquié en Alexander Aulehla bedanken voor de LuVeLu reporter-stam, het SunJin-laboratorium voor het RapiClear-testmonster, Hugo Pereira voor de hulp bij het gebruik van BigStitcher, Nuno Granjeiro voor het helpen opzetten van het live beeldvormingsapparaat, de IGC-dierenfaciliteit en voormalige en huidige leden van het Mallo-lab voor nuttige opmerkingen en ondersteuning tijdens dit werk.

We danken de technische ondersteuning van de Advanced Imaging Facility van de IGC, die wordt ondersteund door Portugese financiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 en ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, medegefinancierd door het regionaal operationeel programma van Lissabon (Lisboa 2020), in het kader van de partnerschapsovereenkomst van Portugal 2020, via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (FEDER) en Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Het werk beschreven in dit manuscript werd ondersteund door subsidies LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) en SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) aan M.M., de onderzoeksinfrastructuur Congento, project LISBOA-01-0145-FEDER-022170, en de PhD fellowship PD/BD/128426/2017 aan A.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher - Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) - Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) - Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0 (any) - 100um thick
Coverglass 20x20 mm #1 (any) - 170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5 (any) - To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) - Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) - Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging - Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments - Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500 -
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft - Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm (any) - To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
  41. Thermofisher.com. , Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020).
  42. Simlab-soft.com. , Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020).
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Nummer 168 3D-reconstructie live beeldvorming gewervelde dieren embryonale ontwikkeling van muizen somitogenese mesoderm axiale extensie NMP's immunofluorescentie clearingtechnieken beeldvormingsanalyse onderwijs.
Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., … More

Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter