Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch kodierten Wasserstoffperoxid (H2O2)-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven zur Beurteilung der physiologischen Signalfunktionen vonH2O2während der Entwicklung des Nervensystems. Es kann auf verschiedene Zelltypen angewendet und mit experimentellen Behandlungen modifiziert werden, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in der allgemeinen Entwicklung zu untersuchen.

Abstract

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind gut etablierte Signalmoleküle, die für die normale Entwicklung, Homöostase und Physiologie wichtig sind. Unter den verschiedenen ROS istWasserstoffperoxid (H2O2) am besten in Bezug auf die Rolle in der zellulären Signalübertragung charakterisiert. H2O2 wurde während der Entwicklung an mehreren Arten beteiligt. Beispielsweise wurde in denersten Tagen nach der Befruchtung ein vorübergehender Anstieg vonH2O2 in Zebrafischembryonen nachgewiesen. Darüber hinaus beeinträchtigt die Erschöpfung einer wichtigen zellulärenH2O2-Quelle,der NADPH-Oxidase (NOX), die Entwicklung des Nervensystems wie die Differenzierung, das axonale Wachstum und die Führung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) sowohl in vivo als auch in vitro. Hier beschreiben wir eine Methode zurAbbildung intrazellulärer H2O2-Spiegel in kultivierten Zebrafischneuronen und ganzen Larven während der Entwicklung unter Verwendung des genetisch kodiertenH2O2-spezifischenBiosensors roGFP2-Orp1. Diese Sonde kann vorübergehend oder stabil in Zebrafischlarven exprimiert werden. Darüber hinaus verringert die ratiometrische Auslesung die Wahrscheinlichkeit, Artefakte aufgrund differentieller Genexpression oder Volumeneffekte zu erkennen. Zunächst zeigen wir, wie man RGCs aus Zebrafischembryonen isoliert und kultiviert, die vorübergehend roGFP2-Orp1 exprimieren. Dann verwenden wir ganze Larven, um H2O2-Spiegelauf Gewebeebene zu überwachen. Der Sensor wurde durch Zugabe vonH2O2validiert. Darüber hinaus könnte diese Methodik verwendet werden, umH2O2-Spiegelin bestimmten Zelltypen und Geweben zu messen, indem transgene Tiere mit gewebespezifischer Biosensorexpression erzeugt werden. Da Zebrafische genetische und entwicklungswirkende Manipulationen erleichtern, könnte der hier demonstrierte Ansatz als Pipeline dienen, um die Rolle vonH2O2 während der neuronalen und allgemeinen Embryonalentwicklung bei Wirbeltieren zu testen.

Introduction

Die Signalisierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) reguliert die Entwicklung und Funktion des Nervensystems1. Eine wichtige zelluläre ROS-Quelle sind NADPH-Oxidasen (NOX), bei denen es sich um Transmembranproteine handelt, die Superoxid und Wasserstoffperoxid(H2O2)2erzeugen. NOX-Enzyme finden sich im gesamten zentralen Nervensystem (ZNS), und NOX-abgeleitetes ROS trägt zur neuronalen Entwicklung bei3,4,5,6. Es wurde gezeigt, dass die Erhaltung und Differenzierung neuronaler Stammzellen, die Etablierung neuronaler Polarität, Neuritenauswuchs und synaptischer Plastizität ausreichende Mengen an ROS7,8,9,10,11erfordern . Auf der anderen Seite trägt die unkontrollierte Produktion von ROS durch NOXen zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Multipler Sklerose und traumatischen Hirnverletzungen bei12,13,14. Daher ist die Produktion von physiologisch relevantem ROS entscheidend für die Aufrechterhaltung gesunder Bedingungen.

Die Entwicklung genetisch kodierter Biosensoren erleichterte den Nachweis von zellulärem ROS erheblich. Ein wichtiger Vorteil genetisch kodierter Biosensoren ist die erhöhte zeitliche und räumliche Auflösung des ROS-Signals, da diese Sensoren gezielt auf unterschiedliche Orte ausgerichtet werden können. Redox-sensitive GFP (roGFP) ist eine Art solcher ROS-Biosensoren. Die roGFP2-Orp1-Variante detektiert spezifischH2O2durch seine Orp1-Domäne, die ein Glutathion-Peroxiredoxin-Familienprotein aus Hefe15,16ist. Die Oxidation des Orp1-Proteins wird auf roGFP2 übertragen, um seine Konformation zu verändern (Abbildung 1A). Die Sonde weist zwei Anregungsspitzen nahe 405 nm und 480 nm sowie einen einzigen Emissionspeak bei 515 nm auf. Bei der Oxidation ändert sich die Fluoreszenzintensität um Anregungsspitzen: Während die Anregung um 405 nm zunimmt, nimmt die Anregung um 480 nm ab. Somit ist roGFP2-Orp1 ein ratiometrischer Biosensor, undH2O2-Spiegelwerden durch das Verhältnis der Fluoreszenzdicken detektiert, die bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt werden ( Abbildung1B). Insgesamt ist roGFP2-Orp1 ein vielseitiges Werkzeug für die ROS-Bildgebung, das in vivoeffizient eingesetzt werden kann.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung und Anregungsspektren von roGFP2-Orp1. (A) Oxidationsmitteltransfer findet zwischen Orp1 und roGFP2 als Reaktion aufH2O2statt, was zu Konformationsänderungen in roGFP2 führt. (B) Die Anregungsspektren des roGFP2-Orp1 weisen zwei Anregungspeaks bei 405 nm und 480 nm und einen einzelnen Emissionspeak bei 515 nm auf. Bei Oxidation durchH2O2nimmt die 405 nm Anregung zu, während die 480 nm Anregung abnimmt. Daraus ergibt sich eine ratiometrische Auslesung für H2O2-Anwesenheit. Die Figur wurde von Bilan und Belousov (2017)16 und Morgan et al. (2011)25modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das Modellsystem Danio rerio (Zebrafisch) hat mehrere Vorteile für die Anwendung genetisch kodierter Biosensoren. Die optische Transparenz der Embryonen und Larven ermöglicht eine nicht-invasive In-vivo-Bildgebung. Neue Bildgebungswerkzeuge werden entwickelt, um eine höhere Auflösung und eine tiefere Durchdringung zu erreichen17. Darüber hinaus gibt es etablierte Werkzeuge zur genetischen Manipulation (ektopische mRNA-Expression, Tol2-Transgenese usw.) und Genom-Editing (TALENs, CRISPR/Cas9 usw.), die die Erzeugung transgener Tiere fördern18. Da sich die Zebrafischembryonen außerhalb der Mutter entwickeln, ermöglicht dieses System einen leichteren Zugang und eine einfachere Manipulation der Embryonen. Zum Beispiel können Injektionen und medikamentöse Behandlungen im Einzelzellstadium leicht durchgeführt werden.

Hier verwendeten wir Zebrafische, um denH2O2-spezifischenBiosensor roGFP2-Orp1 transient zu exprimieren, indem wir in vitro-transkribierte mRNA injizierten. Diese Embryonen können sowohl für die In-vitro-Bildgebung von kultivierten Neuronen als auch für die In-vivo-Bildgebung verwendet werden (Abbildung 2). Wir beschreiben ein Protokoll zur Sezierung und Beschichtung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) aus Zebrafischembryonen, gefolgt von der Beurteilung derH2O2-Spiegelin kultivierten Neuronen. Anschließend stellen wir eine Methode zur In-vivo-Bildgebung von roGFP2-Orp1-exprimierenden Embryonen und Larven mittels konfokaler Mikroskopie vor. Dieser Ansatz ermöglicht nicht nur dieBestimmung physiologischerH2O2-Spiegel,sondern auch potenzielle Veränderungen, die in verschiedenen Entwicklungsstadien oder -bedingungen auftreten. Insgesamt bietet dieses System eine zuverlässige Methode zum Nachweis vonH2O2inlebenden Zellen und Tieren, um die Rolle vonH2O2in Entwicklung, Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.

Figure 2
Abbildung 2. Überblick über den experimentellen Ansatz. Kurz gesagt, nach der Embryoentnahme wird roGFP2-Orp1 mRNA in das Eigelb von einzelligen Zebrafischembryonen injiziert. Sich entwickelnde Embryonen können sowohl für (A) in vitro als auch (B) in vivo Bildgebung verwendet werden. (A) GFP-positive Embryonen werden verwendet, um Netzhäute für die RGC-Sammlung bei 34 HPF zu sezieren. Dissoziierte RGCs werden auf PDL/Laminin-beschichteten Deckschichten in ZFCM(+)-Medien plattiert. Wachstumskegelbildgebung kann durchgeführt werden, wenn RGCs ihre Axone nach 6-24 Stunden Beschichtung erweitern. Zellen können verschiedenen Behandlungen unterzogen werden, um die möglichen Veränderungen derH2O2-Spiegelzu messen. Hier haben wirH2O2-Spiegelin den Wachstumskegeln von RGCs (rot) gemessen. (B) GFP-positive Embryonen werden für die In-vivo-Bildgebung verwendet. Im gewünschten Alter können Embryonen betäubt und auf 35 mm Glasbodenschalen für die konfokale Bildgebung montiert werden. Hier werden Embryonen ventral für die netzhautale Bildgebung montiert. Schematisch zeigt die Netzhautentwicklung bei Zebrafischen. RGCs bilden die Ganglienzellschicht (GCL), die die innerste Schicht in der Netzhaut ist. RGC-Axone entwickeln sich zu Sehnerven, um die Mittellinie zu überqueren und optisches Chiasmus zu bilden. Dann wachsen RGC-Axone dorsal, um Synapsen im optischen Tectum im Mittelhirn zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC) ethisch überprüft und genehmigt, wobei die NIH-Richtlinien mit dem Protokoll 2006002050 am 24.07.2020 genehmigt wurden.

1. Herstellung von Lösungen

  1. E2 Medien (1x)
    1. Bereiten Sie 100x E2A (500 ml), 500 x E2B (100 ml) und 500 x E2C (100 ml) Lösungen vor, indem Sie alle in Tabelle 1aufgeführten Komponenten kombinieren. Autoklav E2A, E2B und E2C Lösungen. Bei 4 °C lagern.
    2. Für 1x E2-Medien: Kombinieren Sie 5 mL von 100x E2A, 1 mL von 500x E2B und 1 mL von 500x E2C. Bringen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 500 ml. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0-7,5 ein.
    3. Bereiten Sie 50 ml Aliquoten von 1x E2-Medienspeicher bei -20 °C für die Langzeitlagerung vor. Beim Auftauen können jedoch Niederschläge auftreten. Stellen Sie sicher, dass der Niederschlag vollständig aufgelöst ist, bevor Sie die Stammlösung verwenden.
Lösung Bestandteil Menge Konzentration
100X E2A (500mL)
NaCl 43,8 g 1500 mM
Kcl 1,88 g 50 mM
MgSO4 6 g 100 mM
KH2PO4 1,03 g 15 mM
Na2HPO4 0,34 g 5 mM
500X E2B (100 ml)
CaCl2 5,5 g 500 mM
500X E2C (100 ml)
NaHCO3 3 g 350 mM
1X E2 (500 ml)
100X E2A 5 ml 1X
500X E2B 1 ml 1X
500X E2C 1 ml 1X

Tabelle 1: Bestandteile von 1x E2-Medien für die Zebrafischzellkultur.

  1. E3 Medien (1x)
    1. Lösen Sie die Komponenten in 1 L sterilem Wasser auf, wie in Tabelle 2 gezeigt, um 100x Brühe zu machen. Verdünnen Sie den Schaft in sterilem Wasser, um 1x E3-Medien herzustellen.
    2. Fügen Sie 0,2% Methylenblau hinzu. Für 20 ml 1x E3-Medien 40 μL Methylenblau hinzufügen.
    3. Machen Sie eine weitere Charge ohne Methylenblau für die fluoreszierende Bildgebung.
Bestandteil Betrag (g) Konzentration in 100X Stock (mM)
NaCl 29.22 500
Kcl 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

Tabelle 2: Bestandteile von 100x E3-Medien zur Erhaltung von Zebrafischembryonen.

  1. 80x salzhaltige Stammlösung
    1. Kombinieren Sie alle in Tabelle 3aufgeführten Komponenten. Fügen Sie Wasser hinzu, um 100 ml Lösung herzustellen. Mischen, bis alle Komponenten gelöst sind. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.
Bestandteil Betrag (g) Konzentration auf Lager (mM)
Traubenzucker 1.44 80
Natriumpyruvat 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
HEPES 6.1 256

Tabelle 3: Bestandteile der 80-fachen Kochsalzlösung für Zebrafisch-Zellkulturmedien.

  1. Zebrafisch-Zellkulturmedium (ZFCM+)
    1. Kombinieren Sie alle in Tabelle 4 aufgeführten Komponenten zu 250 ml Medien. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein. Medien mit 0,22 μm Filter filtern und bei 4 °C lagern.
Bestandteil Betrag (ml) Volumen %
L-15 Medium (mit Phenolrot) 212.75 85.1
Fetales Rinderserum (FBS) 5 2
Penicillin/Streptomycin 1 0.4
80X Kochsalzlösung 3.125 1.25
Wasser 28.125 11.25

Tabelle 4: Bestandteile des Zebrafisch-Zellkulturmediums mit Serum und Antibiotika.

  1. Zebrafisch-Zellkulturmedium für die Bildgebung (ZFCM-)
    1. Kombinieren Sie alle in Tabelle 5 aufgeführten Komponenten zu 250 ml Medien. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein. Filtern Sie Medien mit 0,22 μm Filter.
    2. Machen Sie Einweg-Aliquoten (50 ml Chargen), um eine Kontamination zu verhindern. Bei 4 °C aufbewahren.
Bestandteil Betrag (ml) Volumen %
L-15 Medium (kein Phenolrot) 212.75 85.1
80X Kochsalzlösung 3.125 1.25
Wasser 34.125 13.65

Tabelle 5: Bestandteile des Zebrafisch-Zellkulturmediums ohne Serum und Antibiotika für die In-vitro-Bildgebung.

  1. Spritzgussformen
    1. 1,5% Agarose in E3-Medien auflösen. Gießen Sie ~ 25 ml Agarose in eine 100 x 15 mm Petrischale.
    2. Legen Sie die Form mit einem Winkel von 45 ° zur Oberfläche auf die Agarose und lassen Sie sie mit einer Zeitlupe auf Agarose schweben. Dies wird helfen, Blasen zu vermeiden. Lassen Sie die Agarose abkühlen und auf der Tischplatte erstarren.
    3. Sobald sie vollständig erstarrt sind, entfernen Sie die Form langsam, um ein Brechen der Agarose zu verhindern. Fügen Sie frische E3-Medien hinzu, fügen Sie Paraffinfilm um die Schüssel hinzu, um Verschütten zu verhindern, und lagern Sie bei 4 °C ( Abbildung 3).

Figure 3
Abbildung 3:Spritzgussformbilder. (A) Die Kunststoffform, die zur Herstellung von Spritzplatten verwendet wird. Die Form hat sechs Rampen, eine 90° und eine 45° abgeschränkte Seite zum Halten von Embryonen. (B) Die Spritzplatte nach der Agarose erstarrt und Schimmel wird entfernt. Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Herstellung und Injektion von roGFP2-Orp1 mRNA

HINWEIS: das roGFP2-Orp1-Konstrukt wurde von Dr. Tobias Dick, DKFZ, Deutschland, bezogen. Es wurde in dr. Qing Deng's Lab, Purdue University, in den pCS2+-Vektor subkloniert. Um den Abbau durch RNase zu verhindern, müssen mehrere Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. RNase-freie Reagenzien und Röhrchen müssen jederzeit verwendet werden, Handschuhe müssen für alle Schritte getragen werden und alternativ können Materialien und Oberflächen mit einem Reinigungsmittel zur RNase-Entfernung abgewischt werden.

  1. Linearisieren Sie den 3-10 μg pCS2+/roGFP2-Orp1 Vektor mit NotI.
  2. Reinigen Sie das linearisierte Plasmid mit einem PCR-Reinigungskit.
  3. In vitro transkribieren Sie die roGFP2-Orp1 mRNA mit einem In-vitro-Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Capped Transkriptionsreaktionsbaugruppe
      1. Legen Sie RNA-Polymerase und linearisierte/gereinigte DNA auf Eis. Vortex 10x Reaktionspuffer und 2x NTP/CAP bis sie vollständig in Lösung sind. Lagern Sie NTP/CAP auf Eis, aber halten Sie den Puffer bei Raumtemperatur (RT), während Sie die Reaktion zusammenbauen. Drehen Sie alle Reagenzien vor dem Öffnen der Röhrchen, um eine Kontamination zu vermeiden.
      2. Richten Sie die RNA-Synthesereaktion in der unten angegebenen Reihenfolge bei RT in einem RNase-freien 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen ein. Das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 μL. Der Reaktionsaufbau ist in Tabelle 6 dargestellt.
      3. Fügen Sie 10 μL Ribonukleotidmischung, 2x NTP / CAP und nukleasefreies Wasser hinzu, falls erforderlich, in das Röhrchen. Fügen Sie 2 μL 10X Reaktionspuffer hinzu. Fügen Sie 1-1,5 μg lineare DNA (bis zu 6 μL) hinzu. Fügen Sie bei Bedarf nukleasefreies Wasser hinzu, um 20 μL Reaktionsvolumen zu bilden.
      4. Schließen Sie das Röhrchen, den Wirbel kurz und die Mikrofuge berühren und drehen. Fügen Sie 2 μL 10x SP6 Enzymmischung hinzu. Schließen Sie mit einem Fingerklick und Touch-Spin in einer Mikrofuge.
      5. In 37 °C für 2-2,5 h platzieren (kann bis zu 18 h gehen).
        HINWEIS: Im vorgestellten Experiment über Nacht wurde eine Inkubation von 16-18 h bei 37 °C durchgeführt, um beste Ergebnisse zu erzielen.
      6. Fügen Sie 1 μL DNase hinzu, um die DNA-Schablone zu entfernen, mit den Fingern zu klicken, zu berühren und bei 37 °C für 15 Minuten zu inkubieren.
Reagenz Volumen (μL) Menge in Reaktion
2X NTP/CAP 10 1X
10x Reaktionspuffer 2 1X
Vorlage DNA Bis zu 6 1-1,5 μg
Nukleasefreies Wasser Hinzufügen, um 20 μL zu machen
10X SP6 Enzymmischung 2 1X

Tabelle 6: Reaktionsaufbau für roGFP2-Orp1 mRNA in vitro Transkription.

  1. RNA-Wiederherstellung
    1. Fügen Sie 25 μL Lithiumchlorid (LiCl) hinzu, das im In-vitro-Transkriptionskit enthalten ist. Bei -20 °C für mindestens 30 min in einen frostfreien Gefrierschrank geben.
    2. 25 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge bei 4 °C drehen. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, um das Pellet nicht zu stören. Fügen Sie 25 μL kaltes 75% Ethanol hinzu und spinnen Sie für 5 min bei 4 °C.
    3. Vorsichtig entfernen und den Überstand verwerfen. Pellets bei RT mindestens 5 min an der Luft trocknen lassen. Nicht übertrocknen lassen. Fügen Sie 12 μL nukleasefreien Tris-EDTA (TE)-Puffer (pH 7,0) hinzu und halten Sie die Probe auf Eis.
    4. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. 0,5- 1 μg/μL wird normalerweise erhalten.
    5. 100 ng/μL mRNA in phenolroter Lösung (0,5% phenolrot in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung -DPBS) und Aliquot für den einmaligen Gebrauch (3-5 μL) zubereiten. Lagern Sie die mRNA-Aliquoten bei - 80 °C.
  1. Mikroinjektion von mRNA
    1. Verwenden Sie am Tag der Injektion eines der mRNA-Aliquoten und befolgen Sie das Injektionsprotokoll des Zebrafischembryons, um 1 nL der mRNA durch ihr Eigelb in die einzelligen Embryonen zu injizieren19. Eine kurze Beschreibung finden Sie unten.
    2. Züchten Sie erwachsene Fische und sammeln Sie Embryonen wie zuvor beschrieben20.
    3. Ziehen Sie Mikroinjektionsnadeln mit Pipettenzieher. Schneiden Sie die Spitze der Nadeln mit einer Zette ab, um eine 10 μm Spitzenöffnung zu erzeugen.
    4. Richten Sie Embryonen in einer Spritzgießform aus, die in Schritt 1.6 beschrieben wurde.
    5. Injizieren Sie 1 nL der mRNA in Phenolrot mit einer Glasmikroinjektionspipette.
    6. Sammeln Sie Embryonen und bewahren Sie sie in E3-Medien auf.
    7. Bewahren Sie die Embryonen im 27 °C-Inkubator in E3-Medien auf, bis das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist. Injizierte Embryonen können sowohl für die In-vitro- (Abschnitt 3 und Abschnitt 4) als auch für die In-vivo-Bildgebung (Abschnitt 5) verwendet werden. Embryonen, die roGFP2-Orp1 exprimieren, können vor Experimenten mit einem normalen Dissektionsmikroskop mit fluoreszierendem Licht und einem Blau/Grün-Filterset vorgewählt werden.

3. Primäre retinale Ganglienzellkultur aus Zebrafischembryonen

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von einer zuvor veröffentlichten Methode 21angepasst. Führen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 in einer Laminar-Flow-Haube aus.

  1. Vorbereitung von Coverlips
    1. Bereiten Sie in jedem Experiment 4-6 Kulturplatten vor. Verwenden Sie säurereinigte Abdecklippen (22 x 22 mm quadratisch; 0,16-0,19 mm Dicke), die in 100% Ethanol gelagert werden.
    2. Entfernen Sie einen Abdeckr aus dem Aufbewahrungsbehälter, indem Sie eine Zette verwenden und ihn anzünden, um Ethanolreste zu entfernen.
    3. Trocknen Sie den Abdeckr vollständig an der Luft, indem Sie ihn schräg in eine 35-mm-Kulturschale legen.
    4. Poly-D-Lysin (PDL) Arbeitslösung (1x) durch Verdünnen von 10x Brühe (5 mg/ ml) in sterilem Wasser vorbereiten.
    5. Tragen Sie 100 μL von 0,5 mg/ml PDL auf die Mitte jedes Abdecks auf und vermeiden Sie, dass sich die Lösung auf die Kanten ausbreitet.
    6. Inkubieren Sie die PDL auf Abdecklippen für 20-30 min bei Raumtemperatur (RT). Stellen Sie sicher, dass die PDL nicht austrocknet.
    7. Waschen Sie die PDL dreimal mit 0,5 ml sterilem Wasser. Lassen Sie die Teller vollständig trocknen.
    8. Laminin-Arbeitslösung (1x) durch Verdünnen von 50x Brühe (1 mg/ml) in 1x PBS vorbereiten.
    9. Tragen Sie 100 μL 20 μg/ml Laminin in PBS auf die Mitte jedes Abdecks auf und vermeiden Sie die Ausbreitung der Lösung auf die Kanten.
    10. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator für 2-6 h. Vermeiden Sie das Trocknen der Lamininlösung.
  2. Embryo-Dissektion und Beschichtung von RGCs
    1. Bereiten Sie vier 35-mm-Gewebekulturschalen vor und beschriften Sie sie und füllen Sie sie am Tag der Dissektion mit 4 ml von: 70% Ethanol, "E2 Media 1", "E2 Media 2", "E2 Media 3". Bewahren Sie das Geschirr im Kühlschrank auf, bis es sektioniert ist.
    2. Wenn Zebrafischembryonen 34 Stunden nach der Befruchtung (hpf) sind, nehmen Sie die mit Laminin beschichteten Kulturschalen aus dem Inkubator und waschen Sie die Deckschichten dreimal mit 0,5 ml 1x PBS.
    3. Nach der endgültigen Wäsche 4 ml ZFCM(+)-Medien in jede Kulturschale geben und das Trocknen des Tellers vermeiden.
    4. Rufen Sie die zubereiteten Kulturgerichte aus Schritt 3.2.1 ab. Lassen Sie sie zu RT ausgleichen.
    5. Füllen Sie 4-6 PCR-Röhrchen mit 15 μL ZFCM(+)-Medien. Ein Röhrchen wird benötigt, um RGCs aus 4 Augen vorzubereiten, die auf einen Abdeckel plattiert werden.
    6. Holen Sie Zebrafischembryonen aus dem Inkubator und tauchen Sie die Embryonen in eine 35-mm-Gewebekulturschale mit 70% Ethanol für 5-10 s, um sie zu sterilisieren.
    7. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette in die Schale von E2 Media 1, die sterile E2-Medien enthält, um überschüssiges Ethanol zu waschen.
    8. Übertragen Sie die Embryonen in die E2 Media 2-Schüssel und entfernen Sie ihre Chorionen mit einer scharfen Zette.
    9. Übertragen Sie die Embryonen in die endgültige E2 Media 3-Schüssel, um Dissektionen durchzuführen.
    10. Sezieren Sie mit einer feinen Zange die Netzhaut wie zuvor beschrieben 22.
    11. Positionieren und halten Sie Embryonen mit einer der Zinnen vor ihrem Eigelb und entfernen Sie den Schwanz hinter dem Dottersack mit der anderen Zette.
    12. Schnappen Sie sich den Hals mit einer Zette und nehmen Sie den Kopf ab, um Gehirn und Augen dem E2-Medium auszusetzen. Vermeiden Sie es, den Dottersack zu schneiden.
    13. Rollen Sie mit der Spitze einer feinen Zette die Augen sanft vom Kopf ab, während Sie das Schädelgewebe mit der zweiten Zette nach unten halten. Halten Sie die Augen von den angrenzenden Gewebeablagerungen isoliert.
    14. Geben Sie vier Augen in eine der zuvor vorbereiteten Röhrchen, die ZFCM(+) enthalten.
    15. Mit der P20-Pipette und einer gelben Spitze etwa 45-mal vorsichtig auf und ab titrieren, um Zellen zu dissoziieren. Vermeiden Sie Luftblasen.
    16. Übertragen Sie das ZFCM(+) mit dissoziierten Zellen in die Mitte des Coverlips. Wiederholen Sie die Schritte 10-12 für zusätzliche Abdecklippen.
    17. Halten Sie Kulturen auf der Tischplatte bei 22 °C auf einem Polystyrolschaumgestell, um Vibrationen zu absorbieren.
    18. Führen Sie die Bildgebung 6-24 Stunden nach der Beschichtung durch.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Transferpipette, um Embryonen in verschiedene Kulturschalen zu translozen. Wechseln Sie die Pipette für jede Lösung, um das Übertragen von Ethanol zu verhindern (Schritte 6-8).

4. In-vitro-ROS-Bildgebung von kultivierten RGC-Neuronen

  1. Überprüfen Sie am Tag der Bildgebung (typischerweise 6-24 h nach der Zellbeschichtung) die Zellen unter dem Mikroskop, um das Wachstum von RGC-Axonen zu validieren.
  2. Für die Lebendzellbildgebung übertragen Sie Coverlips von der Kulturschale in eine Lebendzellbildgebungskammer. In diesem Fall wurde eine maßgefertigte offene Kammer verwendet, die zuvor beschrieben wurde23.
  3. Richten Sie ein Mikroskop für die Bildgebung ein. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, das mit einem DIC-Objektiv (Differential Interference Contrast), einem OG590-Langpass-Rotfilter und einer EM-CCD-Kamera ausgestattet ist.
  4. Ersetzen Sie vor dem Imaging das Medium ZFCM(+) durch ZFCM(-).
  5. Sobald die Zellen mit einem 10-fachen Objektiv positioniert sind, erfassen Sie Bilder mit 60-facher Vergrößerung mit einem hohen NA-Öl-Immersionsobjektiv. Verwenden Sie eine zusätzliche 1,5-fache Vergrößerung.
  6. Erfassen Sie zunächst DIC-Bilder. Dann bilden Sie roGFP2-Orp1 mit einem geeigneten Filterset ab. RoGFP2-Orp1 mit 405/20 und 480/30 nm Anregungsfiltern sequentiell anregen und Bilder mit 535/30 nm Emissionsfilter erfassen, nachdem das Emissionslicht den dichroitischen Spiegel 505DCXR passiert hat.
  7. Nachdem Sie den ersten Satz von Bildern genommen haben, tauschen Sie Medien mit Medien aus, die verschiedene Behandlungslösungen enthalten. Die Medien sollten alle 30 Minuten der Bildgebung gewechselt werden, um pH- und Osmolaritätsänderungen zu vermeiden.

5. In-vivo-ROS-Bildgebung von sich entwickelnden Embryonen

  1. Für die In-vivo-Bildgebung sollten Embryonen in E3-Medien mit 0,003% Phenylthiourea (PTU) ohne Methylenblau von 22-24 hpf gehalten werden. Tauschen Sie täglich Medien aus und entfernen Sie tote Embryonen.
  2. Im gewünschten Alter betäuben Embryonen in 0,016% Tricain. Montieren Sie betäubte Embryonen in 1% niedrigschmelzender Agarose auf 35-mm-Glasbodenkulturschalen. Embryonen können dorsal, ventral oder seitlich ausgerichtet werden, abhängig von der Region, die für die Bildgebung von Interesse ist.
  3. Nachdem sich die Agarose verfestigt hat, füllen Sie das Geschirr mit E3-Medien ohne Methylenblau / 0,016% Tricain.
  4. Stellen Sie das Mikroskop für die Bildgebung auf. Verwenden Sie ein invertiertes laserscannungskonfokales Mikroskop. Alternativ können Sie ein aufrechtes konfokales Mikroskop verwenden, das mit einer Wasserimmersionslinse ausgestattet ist, um Embryonen abbilden, die auf einem Agarosetropfen montiert sind.
  5. Erregen Sie roGFP2-Orp1 mit 405 nm und 488 nm Anregungsfiltern sequentiell und erfassen Sie entsprechende Bilder mit Emissionsfiltern im Bereich von 515-535 nm.
  6. Erwerben Sie Z-Stacks mit 5 μm Querschnittsdicke durch den gewünschten Teil der Embryonen. Embryonen können für die Bildgebung in späteren Entwicklungsstadien aufbewahrt werden.
  7. Nach der Bildgebung embryonieren Sie mit einer feinen Zange aus der Agarose entfernen und bis zum gewünschten Alter in methylenblaufreien Medien mit PTU im Inkubator aufbewahren.

6. Bildanalyse und -verarbeitung

  1. Messung vonH2O2 Pegeln anhand von 405/480 Verhältniswerten
    1. Verwenden Sie eine geeignete Software zur Bildanalyse. Zur Bildanalyse und -verarbeitung wurde hier die Software ImageJ eingesetzt.
    2. Öffnen Sie DIC-, 405/535- und 480/535-Bilder in der ImageJ-Software, indem Sie entweder die Dateien ziehen oder auf Datei | Öffnen Sie. Wenn noch nicht geschehen, konvertieren Sie Bilder in 32-Bit, indem Sie auf Image | Typ | 32-Bit-.
    3. Definieren Sie region of interest (ROI) mit einem Freihandwerkzeug aus der Kontrollleiste (Zellkörper, Wachstumskegel, Netzhaut usw.). Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie auf | analysieren klicken Werkzeuge | ROI-Manager. Klicken Sie auf der Registerkarte ROI Manager auf Hinzufügen, um den definierten ROI hinzuzufügen.
    4. Zeichnen Sie eine Region in der Nähe des ROI und fügen Sie als Hintergrund-ROI hinzu. Messen Sie durchschnittliche Hintergrundwerte, indem Sie den ROI auswählen und auf der Registerkarte ROI-Manager auf Measure klicken.
    5. Notieren Sie sich die durchschnittlichen Intensitätswerte aus der Messung. Subtrahieren Sie den Wert des durchschnittlichen Hintergrunds von den fluoreszierenden Bildern, indem Sie auf Prozess | klicken Mathematik | SubtrahierenSie . Führen Sie diesen Schritt für 405/535- und 480/535-Bilder aus.
    6. Fügen Sie den Wert von "1" zu 480/535 fluoreszierendem Bild hinzu, um "0" Werte zu eliminieren, indem Sie auf Prozess | Mathematik | Fügen Sie eine Funktion vor der Verhältnisberechnung hinzu.
    7. Klicken Sie auf | Bildrechner | Divide-Funktion in ImageJ, um 405/535 Bild durch 480/535 Bild Pixel für Pixel zu teilen. Wählen Sie 405/535 Bild, das durch 480/535 Bild geteilt werden soll. Wählen Sie ein 32-Bit-Ausgabebild aus.
    8. Wenden Sie ROI auf Ratio-Bild an, indem Sie zuerst auf das Ratio-Image und dann auf den ROI auf der Registerkarte ROI-Manager klicken.
    9. Messen Sie die durchschnittlichen Verhältniswerte von 405/535 Bild zu 480/535 Bild, indem Sie auf der Registerkarte ROI Manager auf Measure klicken.
    10. Führen Sie die Schritte 6.1.2-6.1.9 für so viele Proben wie möglich aus, um die entsprechende statistische Analyse durchzuführen.
  2. Verhältnisbild anzeigen
    HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird der Hintergrund außerhalb der Probe subtrahiert und eine Farbschmauswahltabelle auf das Bild angewendet.
    1. Nachdem das Verhältnisbild in ImageJ in Schritt 6.1.7. erstellt wurde, erstellen Sie ein 32-Bit-Schwarzbild, indem Sie auf Datei | Neue | Bild.
    2. Wenden Sie den ROI, für den Sie H2O2-Stufen anzeigen möchten, auf das neue Bild an, indem Sie zuerst auf das neue Bild und dann auf den ROI-Manager klicken.
    3. Erstellen Sie eine Maske, indem Sie auf bearbeiten | Auswahl | Maske erstellen.
    4. Teilen Sie das Maskenbild durch 255, um den ROI-Wert auf "1" anzupassen, und die Hintergrundwerte sind "0". Klicken Sie auf | Mathematik | Teilen und 255 eingeben.
    5. Multiplizieren Sie die Maske mit dem Verhältnisbild, indem Sie auf | Bildrechner | Multiplikationsfunktion. Dies führt zu einem Graustufenverhältnisbild, das nur den ROI anzeigt.
    6. Ändern Sie die Nachschlagetabelle in "Feuer", indem Sie auf Image | Nachschlagetabellen | Feuer.
      HINWEIS: Ein Multiplikationsfaktor kann auf alle Bilder angewendet werden, um das Verhältnis besser zu visualisieren, indem Sie auf Prozess | Bild | Multiplizieren.
    7. Konvertieren Sie das Verhältnisbild in 8-Bit, indem Sie auf Bild | Typ | 8-Bit .
    8. Fügen Sie eine Kalibrierungsleiste hinzu, indem Sie auf | analysieren klicken Werkzeuge | Kalibrierleiste.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kultivierte Zebrafisch-RGCs verlängern Axone innerhalb von 1d. Ein repräsentatives 405/480-Verhältnisbild des H2O2-Biosensors ist in Abbildung 4A dargestellt. Zellkörper, Axon und Wachstumskegel sind in einzelnen Neuronen deutlich sichtbar. Diese Neuronen können im Laufe der Zeit verschiedenen Behandlungen unterzogen werden, umH2O2-Veränderungenzu überwachen. Wir haben bereits festgestellt, dass die Zugabe von 100 μMH2O2 zu Nährmedien die Verhältniswerte erhöht, was zeigt, dass mit diesem System Änderungen in Echtzeit erkannt werden können (Abbildung 4)24.

Figure 4
Abbildung 4:H2 O2-Bildgebungin kultivierten Zebrafisch-RGCs mit roGFP2-Orp1. (A) Repräsentative 405/480 nm-Verhältnisbilder von kultivierten RGC-Neuronen aus 34 HPF alten Zebrafischembryonen. Neuron auf der linken Seite wurde mit serumfreiem Kontrollmedium und Neuron auf der rechten Seite mit 100 μMH2O2 für 30 min behandelt. Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Balkendiagramme, die diedurchschnittlichen H2O2-Spiegelin den Wildtyp-Zebrafisch-RGC-Wachstumskegeln vor und nach der Behandlung mit entweder Kontrolle oder 100 μMH2O2zeigen. Die Daten wurden normalisiert, um die Behandlung zu kontrollieren. Die Daten werden mittelwert ± REM angezeigt. Die Anzahl der Wachstumskegel wird in Klammern für jede Gruppe angezeigt. Zweischwänziger Wilcoxon Matched-Pairs signiert Rangtest; **p = 0,0009. Die Zahl wurde gegenüber unserer vorherigenVeröffentlichung 24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

H2O2-Spiegel können auch in ganzen Zebrafischembryonen bestimmt werden (Abbildung 5). Da die mRNA während der Einzellphase injiziert wird, exprimieren alle Gewebe den biosensor roGFP2-Orp1. In Abbildung 5Azeigen wir die Kopfregion von Zebrafischlarven zu zwei verschiedenen Zeitpunkten, wobei wir uns beispielsweise auf dieH2O2-Spiegel in der Netzhaut konzentrieren. Wir haben bereits gezeigt, dass die Zugabe vonH2O2 die Verhältniswerte in Echtzeit erhöht, während die Zugabe des Reduktionsmittels DTT diesen Effekt in vivo24umkehrt. Hier haben wir die Basalwerte vonH2O2in den gleichen Zebrafischembryonen bei 2 dpf und 5 dpf gemessen. Bei 2 dpf lagen die Verhältniswerte deutlich unter 5 dpf (p<0,0001; Abbildung 5B). Darüber hinaus zeigte jedes Tier einen unterschiedlichen Anstieg seines netztinalenH2O2-Gehalts(Abbildung 5C).

Figure 5
Abbildung 5: In vivo H2O2 Bildgebung bei Zebrafischlarven mit roGFP2-Orp1. (A) DIC- und 405/480 nm-Verhältnisbilder von Zebrafischlarven mit 2 und 5 dpf. Roi ist definiert als Retina (gelbe Linien), um Verhältniswerte zu messen. Die gleichen Larven wurden bei 2 und 5 dpf analysiert. Schuppenbalken = 50 μm. (B) Messung des durchschnittlichen H2O2-Gehalts in Netzhäuten von 2 und 5 dpf Zebrafischen. Bei 5 dpf sind dieH2O2-Spiegelin der Netzhaut im Vergleich zu 2 dpf signifikant erhöht. (C) Liniendiagramm der Messungen einzelner Fische. Jedes Tier weist einen Anstieg derH2O2-Spiegelin seiner Netzhaut von 2 auf 5 dpf auf. Die Daten werden als Mittelwert ± REM angezeigt. Die Anzahl der analysierten Larven wird in Klammern für jede Gruppe angezeigt. Zweischwänzige Wilcoxon Matched-Pairs signiert Rangtest, ****p<0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Es gibt mehrere kritische Schritte, die in diesem Protokoll beachtet werden müssen. Wir glauben, dass die Berücksichtigung dieser Punkte den experimentellen Fluss verbessern wird. Für die primäre RGC-Kultur ist die Sterilität des ZFCM(-) sehr wichtig, da dieses Nährmedium keine Antibiotika enthält und vor oder während der Bildgebung eine Kontamination auftreten kann. Um dies zu vermeiden, empfehlen wir, ZFCM(-) nur in einer Biosicherheitswerkbank vorzubereiten und zu verwenden und regelmäßig frische ZFCM(-)-Medien herzustellen (Schritt 1.5). Darüber hinaus sollten Lamininbestände bei -80 °C gehalten werden. Aufgetautes Laminin sollte jederzeit bei 4 °C gelagert werden. Halten Sie Lamininlösungen nicht bei Raumtemperatur oder gefrieren Sie sie nicht wieder ein, da dies das Auswachsen des Neuriten verringert und die Aktivität des Proteins fördert.

Das Sezieren der Netzhaut von Zebrafischen zum richtigen Zeitpunkt ist wichtig, um genügend RGCs zu erhalten, die Axone verlängern. Zebrafisch-RGCs werden mit 28 HPF geboren und verlängern Axone aus der Netzhaut ab 32-36 HPF. Daher ist es wichtig, RGCs nach 28 HPF, vorzugsweise zwischen 32-36 HPF, zu platten, um eine vollständige Differenzierung der RGCs zu ermöglichen. Kulturen, die zu früheren Zeitpunkten hergestellt wurden, liefern möglicherweise nicht genügend RGCs oder ergeben RGCs, die Axone nicht innerhalb von 24 Stunden nach der Beschichtung verlängern können. Es wird dringend empfohlen, das ZFCM(-)-Medium bei der Bildgebung für mehr als 30 Minuten zu wechseln. Da diesem Medium Phenolrot fehlt, sind pH-Änderungen nicht sichtbar und müssen möglicherweise berücksichtigt werden. Tauschen Sie Medien sehr sorgfältig aus, um zu vermeiden, dass sich Neuronen während des Prozesses entfernen (Schritt 4.7).

Schließlich ist der Wechsel des Mediums auf E3 mit PTU, aber ohne Methylenblau um 24 PSF notwendig. PTU verhindert Pigmentierung für eine verbesserte Larventransparenz, die für die In-vivo-Fluoreszenzbildgebung erforderlich ist; eine frühere Behandlung mit PTU kann jedoch zu Entwicklungsstörungen führen26. Methylenblau wird aus E3-Medien entfernt, um die Autofluoreszenz zu reduzieren, die hauptsächlich aus dem Eigelb stammt (Schritt 5.1).

Diese Methode ermöglicht den zytoplasmatischenNachweis vonH2O2. Die subzelluläre Kompartimentierung vonH2O2trägt jedoch zur lokalen Signalisierung bei, und zytoplasmatischeH2O2-Spiegelliefern möglicherweise keine ausreichenden Informationen über spezifische Signalfunktionen vonH2O2. Da roGFP2-Orp1 ein genetisch kodierter Biosensor ist, kann er gezielt gewebespezifische Expression (z. B. Neuronen, Astrozyten, Gliazellen usw.) oder bestimmte subzelluläre Orte (z. B. Plasmamembran, Mitochondrien, Kern usw.) verwendet werden. Da roGFP2-Orp1 ein GFP-basierter Biosensor ist, ist die Kombination mit anderen fluoreszierenden Sonden auf Emissionswellenlängen außerhalb des grünen Spektrums beschränkt. Da GFP als Transgenesemarker weit verbreitet ist, kann der Einsatz von GFP-basierten Biosensoren eingeschränkt sein. Um dieser Herausforderung zu begegnen,wurden kürzlich rotfluoreszierende Proteine für denH2O2-Nachweisentwickelt27. Weiterhin wird roGFP2-Orp1 in der hier vorgestellten Methode vorübergehend exprimiert. Daher wird die mRNA- und Proteinexpression im Laufe der Zeit zerfallen. Wir konnten das Signal noch bei 5 dpf-Larven nachweisen; Transgene Fischlinien müssen jedoch für eine stabile Expression des Biosensors während der gesamten Entwicklung und bis ins Erwachsenenalter etabliert werden.

Für den Nachweis von intrazellulärem ROS (z. B. H2DCF-DA) oder speziellH2O2(PF6-AM)28 ,29stehen mehrere farbstoffbasierte Assays zur Verfügung. Die Verwendung eines genetisch kodierten Biosensors wie roGFP2-Orp1 hat mehrere Vorteile gegenüber farbstoffbasierten Methoden. Erstens ermöglicht es den Nachweis sowohl vorübergehender Veränderungen des oxidativen Status aufgrund der Reversibilität als auch an bestimmten subzellulären Stellen. Somit werden die dynamischen Veränderungen mit hoher räumlicher Auflösung gut überwacht30. Zweitens zeigt es im Allgemeinen eine geringere Toxizität für Zellen oder Gewebe im Vergleich zu Farbstoffmolekülen. Schließlich kann der Biosensor weiter genetisch manipuliert werden, um den Anforderungen spezifischer Experimente gerecht zu werden31. roGFP2-Orp1 ist ein ratiometrischer Biosensor, da er zwei Anregungen und eine Emissionsspitze aufweist. Bei Wechselwirkung mitH2O2nimmt die 405-nm-Anregung zu und die 480-nm-Anregung ab. Die Ablesung ist somit das Verhältnis der Intensitätswerte, die durch 405 bzw. 480 nm Anregung erfasst werden. Da diese Sonde ratiometrisch ist, wird die Anwendung einer zweiten Sonde überflüssig, um mögliche Volumeneffekte zu korrigieren. Da diese Sonde nur die Expression eines Polypeptids beinhaltet, leidet sie nicht unter potenziellen Problemen der differentiellen Expression von mehr als einem Protein, wie im Fall des intermolekularen Fluoreszenzresonanz-Energietransfers (FRET).

Die roGFP2-Orp1 ist eine vielseitigeH2O2 Sonde zur Untersuchung der ROS-Produktion und -Signalisierung. In lebenden Zellen zeigt diese Sonde einen Dynamikbereich von 4,8 (etwa 4 in transgenen Zebrafischembryonen)15,32. Der Redoxzustand von roGFP2-Orp1 unterliegt jedoch Veränderungen durch endogene Thioredoxin- und Glutaredoxinsysteme; Daher wurden empfindlichere Sonden entwickelt, indem Orp1 durch ein anderes Hefeperoxiredoxin, Tsa233,34,ersetzt wurde. Während roGFP2-Orp1 nützlich ist, um Veränderungen inH2O2in Zebrafischembryonen nachzuweisen, beschränkt sich die Empfindlichkeit meist auf höhere Konzentrationen von exogen aufgetragenemH2O224,31oder auf starke Reize. Zum Beispiel erhöhte die Spalt2-Behandlung das roGFP2-Orp1-Signal in Wildtyp-RGCs, aber nicht in nox2-mutierten RGCs35. Auf der anderen Seite gab es keinen Unterschied in den basalenH2O2-Spiegelnzwischen Wildtyp- und Nox2-mutierten RGCs und 2 dpf-Embryonen24,35. Um Basalwerte oder kleine Veränderungen inH2O2zu erkennen, werden daher Sonden mit höhererEmpfindlichkeitbenötigt.

HyPer ist ein weiterer weit verbreiteter genetisch kodierterund ratiometrischerH2O2-spezifischerBiosensor36. Die Empfindlichkeiten beider Sonden sind ähnlich; roGFP2-Orp1 zeigte jedoch eine langsamere Reaktionsfähigkeit aufH2O2-Änderungen 15. Daher kann die präzise Erkennung von Echtzeitänderungen HyPer anstelle von roGFP2-Orp1 erfordern. Während anfängliche HyPer-Versionen von pH-Änderungen betroffen sind, ist roGFP2-Orp1 nicht16,36. Daher ist es wichtig, bei der Verwendung von HyPer37eine pH-Kontrollsonde (SypHer3s) einzubeziehen. Die jüngste HyPer-Sonde, HyPer7, überwand viele der Nachteile bestehender H2 O2-Sonden:HyPer7 hat eine höhere pH-Stabilität, erhöhte Helligkeit, schnellere Kinetik und einen höheren Dynamikbereich38. Darüber hinaus ist HyPer7 sowohl in vitro als auch in vivovalidiert, zeigt die subzelluläre Kompartimentierung und überwachtH2O2-Veränderungenin Zebrafischembryonen während der Wundheilung in Echtzeit38.

Die hier vorgestellte Methodik kann erweitert werden, um die Rolle der ROS-Signalisierung sowohl in vitro als auch in vivo zu untersuchen. roGFP2-Orp1 exprimierende Neuronen können verschiedenen Behandlungen unterzogen werden, um ihre Wirkung auf dieH2O2-Signalgebungzu untersuchen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass RGCs auf Änderungen derH2O2-Spiegelin Echtzeit reagieren (Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass der Biosensor sofortige Veränderungen in H2 O 2erkennen kann. Die Bestimmung absoluter intrazellulärer H2O2-Konzentrationen würde jedoch eine umfangreiche Kalibrierung des Systems erfordern. Auch die Nachweisgrenze des Biosensors ist unklar. Zudem ist die detaillierte räumliche Verteilung des Biosensors in der Zelle nicht vollständig bekannt, was die Interpretation der Ergebnisse stören könnte. Darüber hinaus könnte die Bestimmung des genauen Ortssignals von roGFP2-Orp1 aufdecken, ob es eine ortsspezifischeH2O2-Produktion gibt, die zur lokalisierten intrazellulären Signalgebung beiträgt.

Die Herstellung transgener Fische, die roGFP2-Orp1 exprimieren, hat zahlreiche Vorteile. Der Biosensor kann ubiquitär oder unter einem gewebespezifischen Promotor zur Untersuchung der zellspezifischenH2O2-Signalisierungunter Verwendung der Tol2-Transgenese in Zebrafischen39exprimiert werden. Die Rolle vonH2O2inder Entwicklung kann durch ubiquitäre Expression des Biosensors untersucht werden. Zum Beispiel können transgene Zebrafischembryonen überwacht werden, um Veränderungen derH2O2-Spiegelzu beurteilen und wie diese Veränderungen zu verschiedenen Entwicklungsstadien beitragen. Auf der anderen Seite konzentriert sich die gewebespezifische Expression des roGFP2-Orp1 auf die Auswirkungen derH2O2-Produktionin Zellen oder Geweben von Interesse. Gewebe- oder zellspezifische Promotoren können verwendet werden, um die Expression von roGFP2-Orp1 in bestimmten Zellen zu steuern. Darüber hinaus kann das Gal4/UAS-System zur spärlichen Markierung einzelner Neuronen eingesetzt werden. Daher ermöglicht dieser Ansatz den Nachweis vonH2O2-Spiegelnbei zellulärer Auflösung in vivo. Schließlich können stabile transgene Linien für ein Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening verwendet werden, das ROS-Signalisierung und oxidativen Stress in Zebrafischembryonen beinhaltet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grant R01NS117701), der National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), dem Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), der Purdue Research Foundation (Grant 209911) und dem Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships an der Purdue University (Grant 210362) unterstützt. Wir danken Dr. Cory J. Weaver und Haley Roeder für die Etablierung des Zebrafisch-RGC-Kulturprotokolls. Wir danken Haley Roeder zusätzlich für die Bereitstellung der Daten von Abbildung 4. Wir danken Leah Biasi und Kenny Nguyen für die Hilfe bei der RGC-Kultur. Wir danken Gentry Lee für die Bearbeitung des Textes. Wir danken Dr. Tobias Dick für die Bereitstellung von roGFP2-Orp1 und Dr. Qing Deng für pCS2+ Vektoren, die roGFP2-Orp1 enthalten. Abbildung 2 wird mit Biorender.com erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Tags

Neuroscience ROS Wasserstoffperoxid roGFP2-Orp1 Biosensor RGC Zebrafisch neuronale Entwicklung
ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. … More

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development. J. Vis. Exp. (168), e62165, doi:10.3791/62165 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter