כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.
Abstract
אי ספיקת כבד היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, והתמותה ממחלת כבד כרונית עולה בחדות בארצות הברית. כבדים בריאים מסוגלים להתחדש מנזק רעיל, אך במחלת כבד מתקדמת, היכולת הטבעית של הכבד להתחדש נפגעת. דגי זברה התגלו כמערכת ניסיונית רבת עוצמה לחקר ההתחדשות. הם מודל אידיאלי לחקר התחדשות הכבד מהפטקטומיה החלקית, הליך עם רלוונטיות קלינית ישירה שבה חלק מהכבד מוסר בניתוח, ומשאיר את השאר ללא פגע. אין פרוטוקול סטנדרטי לכריתת הפטי חלקית; מחקרים קודמים המשתמשים במודל זה השתמשו בפרוטוקולים שונים במקצת ודיווחו על תוצאות שונות. מתואר כאן פרוטוקול יעיל, לשחזור לביצוע כריתת hepatectomy חלקית בדגי זברה בוגרים. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להדגים כי דגי זברה מסוגלים להתחדשות אפימורפית של האונה הנתבת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור עוד יותר את המנגנונים הנדרשים להתחדשות הכבד בדגי זברה.
Introduction
בין האיברים המוצקים בבני אדם, הכבד הוא האיבר היחיד המסוגל התחדשות1. זה קריטי, כמו הכבד הוא איבר חיוני, אחראי על פונקציות מטבוליות מפתח, אחסון אנרגיה, ניקוי רעלים בדם, הפרשת חלבוני פלזמה, וייצור מרה2. Hepatocytes שאבדו עקב נזק רעיל או דלקתי מוחלפים בעיקר באמצעות חלוקה של הפטוציטים הנותרים1. מודל ניסיוני קלאסי אחד לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת כבד חלקית, שבה אונות בודדות של הכבד מוסרות, ומשאירות את האונות הנותרות שלמות3. הליך זה פותח בתחילה בחולדות, שבהן כשני שלישים ממסת הכבד מוסרים. לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית ביונקים, התחדשות מפצה מתרחשת באונות הנותרות עד שהכבד משחזר את המסה הראשונית שלו. ראוי לציין כי כבד היונקים אינו מחליף את האונות החסרות.
דג זברה(דניו ריו)מייצג מודל מתיחה לחקר התחדשות איברים למבוגרים4. כבד דג הזברה, בעודו שונה מבנית מהכבד היונקים, מורכב מאותם סוגי תאים ומשרת את אותה פונקציה כמו ביונקים2. הוא מורכב משלוש אונות, עם שתי אונות הגב ואונה גחונית אחת המשטחות לאורך המעי. כריתת הפטקטומיה חלקית בוצעה בעבר בדגי זברה, עם תיאורים סותרים לגבי מצב ההתחדשות המדויק. בדרך כלל, שליש כריתת hepatectomy חלקית מבוצעת על ידי הסרת האונה הגחוני כולו. דיווחים ראשוניים הצביעו על כך שלאחר הסרת האונה הגחונית, הוא התחדש במלואו בתוך שבוע5,6,7, מה שמצביע על כך שבניגוד לכבד היונקים, כבד דג הזברה מסוגל להתחדשות אפימורפית. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי הסרת האונה הגחונית הביאה להתחדשות מפצה באונות החזיר, ולא להתחדשות האונה הגחונית החסרה, ובסופו של דבר להתאוששות של מסת הכבד בתוך שבוע8,9. פרופיל תמלול של האונות הגעשיות בעקבות כריתה של האונה הגחונית חשף שינויים משמעותיים הקשוריםהתחדשות מפצה 10. בהתחשב בכך שמצב התחדשות הכבד יכול להשתנות עם היקף הפציעה8, שיערנו כי הפערים בתוצאות עשויים להיות עקב שונות טכנית בפרוטוקול כריתת ההפטיקטומיה החלקית בין קבוצות מחקר.
פרוטוקול זה מתאר הליך לביצוע כריתת הפטיקטומיה חלקית שליש על דגי זברה בוגרים על ידי הסרת האונה הגחונית. טכניקה זו תהיה בעלת ערך להערכת מנגנונים של התחדשות הכבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההבדלים האנטומיים בין דגי זברה למודלים של יונקים להתחדשות הכבד מציבים אתגרים ייחודיים לפירוק הכבד. הכבד בדגי זברה נמצא בסמיכות ללב והמעי; פגיעה בשוגג בכל איבר גורמת לתמותה מוגברת. כבד דג הזברה אינו עטוף, מה שמקשה על הנפרדות מהמעי. הכבד מקבל דם עשיר בחומרים מזינים מהמעי דרך ורידים פורטל. בי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.M.O. נתמך על ידי NIAAA (F32AA027135). W.G. נתמך על ידי R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870, ואת תוכנית קלאודיה אדמס בר למצוינות בחקר הסרטן. וו.ג’י הוא חוקר מכון פיו במדעי הביו-רפואה.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
Referências
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Biologia do Desenvolvimento. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
- Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).
