Частичная гепатэктомия у взрослых рыбок данио
Summary
Этот протокол описывает процедуру удаления вентральной доли печени у взрослых рыбок данио, чтобы обеспечить возможность изучения регенерации печени.
Abstract
Печеночная недостаточность является одной из ведущих причин смерти во всем мире, а смертность от хронических заболеваний печени резко возрастает в Соединенных Штатах. Здоровая печень способна регенерировать от токсического повреждения, но при запущенном заболевании печени естественная способность печени к регенерации нарушается. Рыбки данио стали мощной экспериментальной системой для изучения регенерации. Они являются идеальной моделью для изучения регенерации печени после частичной гепатэктомии, процедуры, имеющей прямое клиническое значение, при которой часть печени удаляется хирургическим путем, оставляя остальную часть нетронутой. Не существует стандартного протокола для частичной гепатэктомии; Предыдущие исследования с использованием этой модели использовали несколько разные протоколы и сообщали о несопоставимых результатах. Здесь описан эффективный, воспроизводимый протокол для выполнения частичной гепатэктомии у взрослых рыбок данио. Мы используем эту технику, чтобы продемонстрировать, что рыбки данио способны к эпиморфной регенерации резекционированной доли. Этот протокол может быть использован для дальнейшего опроса механизмов, необходимых для регенерации печени у рыбок данио.
Introduction
Среди твердых органов у человека печень является единственным органом, способным к регенерации1. Это имеет решающее значение, так как печень является важным органом, ответственным за ключевые метаболические функции, хранение энергии, детоксикацию крови, секрецию белков плазмы и выработку желчи2. Гепатоциты, потерянные из-за токсического или воспалительного повреждения, заменяются в основном путем деления оставшихся гепатоцитов1. Одной из классических экспериментальных моделей для изучения регенерации печени является частичная гепатэктомия, при которой удаляются отдельные доли печени, оставляя оставшиеся доли нетронутыми3. Эта процедура была первоначально разработана на крысах, у которых удаляется примерно две трети печеночной массы. После частичной гепатэктомии у млекопитающих компенсаторная регенерация происходит в оставшихся долях до тех пор, пока печень не восстановит свою первоначальную массу. Примечательно, что печень млекопитающих не заменяет отсутствующие доли.
Рыбки данио (Danio rerio) представляют собой пригодную модель для изучения регенерации органов взрослыхособей 4. Печень рыбок данио, хотя и структурно отличается от печени млекопитающих, состоит из тех же типов клеток и выполняет ту же функцию, что и у млекопитающих2. Он состоит из трех долей, с двумя дорсальными долями и одной вентральной долей, которые уплощены вдоль кишечника. Частичная гепатэктомия ранее проводилась у рыбок данио, с противоречивыми отчетами о точном способе регенерации. Как правило, одна треть частичной гепатэктомии выполняется путем удаления всей вентральной доли. Первоначальные сообщения указывали, что после удаления вентральной доли она была полностью регенерирована в течениенедели 5,6,7,предполагая, что в отличие от печени млекопитающих, печень рыбок данио способна к эпиморфной регенерации. Последующие исследования показали, что удаление вентральной доли приводило к компенсаторной регенерации в дорсальных долях, а не к регенерации отсутствующей вентральной доли, и в конечном итоге к восстановлению печеночной массы в течение8,9недель. Транскриптомное профилирование дорсальных долей после резекции вентральной доли выявило значительные изменения, связанные с компенсаторной регенерацией10. Учитывая, что режим регенерации печени может варьироваться в зависимости от степени повреждения8,мы предположили, что расхождения в результатах могут быть связаны с техническими вариациями в протоколе частичной гепатэктомии между исследовательскими группами.
Этот протокол описывает процедуру выполнения одной трети частичной гепатэктомии на взрослых рыбках данио путем удаления вентральной доли. Эта методика будет ценна для оценки механизмов регенерации печени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анатомические различия между моделями регенеративной печени рыбок данио и млекопитающих представляют собой уникальные проблемы для резекции печени. Печень у рыбок данио находится в непосредственной близости от сердца и кишечника; непреднамеренное повреждение любого органа приводи?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.M.O. поддерживается NIAAA (F32AA027135). W.G. поддерживается R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 и Программой Клаудии Адамс Барр по передовому опыту в исследованиях рака. W.G. является ученым Pew в области биомедицинских наук.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
Referências
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Biologia do Desenvolvimento. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
- Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).
