Epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto
Summary
Questo protocollo descrive la procedura per rimuovere il lobo ventrale del fegato nel pesce zebra adulto per consentire lo studio della rigenerazione epatica.
Abstract
L’insufficienza epatica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e la mortalità per malattie croniche del fegato sta aumentando bruscamente negli Stati Uniti. I fegati sani sono in grado di rigenerarsi da danni tossici, ma nelle malattie epatiche avanzate, la naturale capacità del fegato di rigenerarsi è compromessa. Zebrafish è emerso come un potente sistema sperimentale per lo studio della rigenerazione. Sono un modello ideale per studiare la rigenerazione epatica dall’epatomia parziale, una procedura con rilevanza clinica diretta in cui parte del fegato viene rimossa chirurgicamente, lasciando intatto il resto. Non esiste un protocollo standard per l’epatotomia parziale; studi precedenti che utilizzano questo modello hanno utilizzato protocolli leggermente diversi e riportato risultati disparati. Qui descritto è un protocollo efficiente e riproducibile per eseguire un’epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto. Usiamo questa tecnica per dimostrare che i pesci zebra sono in grado di rigenerazione epimorfica del lobo reinsediato. Questo protocollo può essere utilizzato per interrogare ulteriormente i meccanismi necessari per la rigenerazione epatica nel pesce zebra.
Introduction
Tra gli organi solidi nell’uomo, il fegato è l’unico organo in grado di rigenerazione1. Questo è fondamentale, in quanto il fegato è un organo essenziale, responsabile delle principali funzioni metaboliche, conservazione dell’energia, disintossicazione del sangue, secrezione di proteine plasmatiche e produzione di bile2. Gli epatociti persi a causa di danni tossici o infiammatori vengono sostituiti principalmente attraverso la divisione degli epatociti rimanenti1. Un modello sperimentale classico per lo studio della rigenerazione epatica è l’epatomia parziale, in cui vengono rimossi i singoli lobi del fegato, lasciando intatti i lobirimanenti 3. Questa procedura è stata inizialmente sviluppata nei ratti, in cui vengono rimossi circa due terzi della massa epatica. Dopo un’epatomia parziale nei mammiferi, la rigenerazione compensativa si verifica nei lobi rimanenti fino a quando il fegato non recupera la sua massa iniziale. In particolare, il fegato di mammifero non sostituisce i lobi mancanti.
I pesci zebra (Danio rerio) rappresentano un modello trattabile per lo studio della rigenerazione di organi adulti4. Il fegato di zebrafish, sebbene strutturalmente diverso dal fegato di mammifero, è costituito dagli stessi tipi di cellule e svolge la stessa funzione dei mammiferi2. È composto da tre lobi, con due lobi dorsali e un singolo lobo ventrale che sono appiattiti lungo l’intestino. L’epatotomia parziale è stata precedentemente eseguita in zebrafish, con resoconti contrastanti sulla modalità precisa di rigenerazione. Tipicamente, un’epatotectomia parziale di un terzo viene eseguita rimozione dell’intero lobo ventrale. I primi rapporti indicavano che dopo la rimozione del lobo ventrale, è stato completamente rigenerato entrouna settimana 5,6,7, suggerendo che a differenza del fegato di mammifero, il fegato di zebrafish è in grado di rigenerazione epimorfica. Studi successivi hanno dimostrato che la rimozione del lobo ventrale ha portato alla rigenerazione compensativa nei lobi dorsali, piuttosto che alla rigenerazione del lobo ventrale mancante e, in ultima analisi, al recupero della massa epatica entrouna settimana 8,9. La profilazione trascrittamica dei lobi dorsali a seguito della resezione del lobo ventrale ha rivelato cambiamenti significativi associati alla rigenerazionecompensativa 10. Dato che la modalità di rigenerazione epatica può variare con l’entità dellalesione 8, abbiamo ipotizzato che le discrepanze nei risultati possano essere dovute a variazioni tecniche nel protocollo parziale di epatomia tra gruppi di ricerca.
Questo protocollo descrive una procedura per eseguire un’epatotectomia parziale di un terzo sul pesce zebra adulto rimuovendo il lobo ventrale. Questa tecnica sarà preziosa per valutare i meccanismi di rigenerazione epatica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le differenze anatomiche tra zebrafish e modelli di mammiferi per la rigenerazione del fegato presentano sfide uniche per la resezione epatica. Il fegato nei pesci zebra è nelle immediate vicinanze del cuore e dell’intestino; inavvertitamente dannoso per entrambi gli organi si traduce in un aumento della mortalità. Il fegato di zebrafish non è incapsulato, rendendo più difficile separarsi dall’intestino. Il fegato riceve sangue ricco di nutrienti dall’intestino attraverso le vene portale. Nei mammiferi, le vene che l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.M.O. è supportato dal NIAAA (F32AA027135). W.G. è supportato da R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 e dal Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. è uno studioso di scienze biomediche di Pew.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
Referências
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