Summary
우리는 PKH 염료로 대식세포 유래 작은 세포외 소포를 라벨과 시험관 내 및 척수에서 그들의 upup을 관찰하는 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
작은 세포 외 소포 (sEV)는 모든 세포에 의해 분비되고 체액에 존재하는 50-150 nm 소포입니다. sEV는 RNA, 단백질 및 지질과 같은 생체 분자를 기증자에서 수용세포로 이송하여 세포 간의 주요 신호 중재자를 만듭니다. 중추 신경계 (CNS)에서 sEV는 신경 면역 상호 작용을 포함하여 세포 간 신호를 중재 할 수 있습니다. sEV 기능은 생체외 및 생체 내 모두 받는 사람 세포에서 표지된 sEV의 섭취량을 추적하여 연구할 수 있다. 이 논문은 PKH 멤브레인 염료를 사용하여 RAW 264.7 대식세포의 조건부 매체로부터 sEV의 라벨링을 설명합니다. 그것은 신경-2a 세포와 시험관내1 차 성상세포에 의해 여러 시간 지점에서 표지된 sEV의 다른 농도의 uptakes를 보여줍니다. 또한 마우스 척수 뉴런, 성상세포 및 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화된 미세glia에서 내trathecally를 전달한 sEV의 섭취도 표시됩니다. 대표적인 결과는 척수로 성공적인 sEV 납품을 확인하는 것을 도울 수 있는 다른 세포에 의하여 sEV의 uptake에 있는 시간 의존적인 변이를 보여줍니다.
Introduction
작은 세포 외 소포 (sEV)는 나노 크기, 50-150 nm의 크기 범위와 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 다중 vesicular 바디 (MVBs)에서 유래하고 플라즈마 막과 MVB의 융합에 세포에서 풀어 놓입니다. sEV는 miRNAs, mRNA, 단백질 및 생리활성 지질을 포함하고, 이 분자는 세포 간 세포 통신의 형태로 세포 사이 옮겨질 것입니다. sEV는 다양한 내막 경로에 의해 수신자 세포에 의해 내부화될 수 있으며, 수신자 세포에 의한 sEV의 이러한 포획은 EV와 표적 세포1모두에 대한 표면 분자의 인식에 의해 중재된다.
sEV는 수용체 세포의 분자 및 현상 변화를 유발할 수 있는 능력, 치료제로서의 유용성, 화물 분자 또는 약리학제의 운반선으로서의 잠재력으로 인해 관심을 얻고 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, sEV의 화상 진찰 및 추적은 특히 생체 내 연구 및 임상 설정에 도전적일 수 있습니다. 따라서 생체 내 및 생체 내 및 생체 내 추적을 지원하기 위해 라벨 및 이미지 sEV를 표시하고 이미지 sEV를개발하는 많은 방법이 개발되었다.
sEV 생체 분포및 표적 세포 상호 작용을 연구하는 가장 일반적인 기술은 형광염염료 분자3,4,5,6,7로라벨을 붙이는 것을 포함한다. 전기 는 처음에 일반적으로 이미지 세포에 사용 된 세포막 염료로 표시 되었다. 이 형광 염료는 일반적으로 sEV에 관심있는 지질 이중 층 또는 단백질을 얼룩. 몇몇 지방성 염료는 디르 (1,1′-디옥타데딜-3,3,3′,3′-테트라메틸린도트리카르보시아노니 오오드), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시아닌 과염소산염), 및 DiD (1, 1′-디옥타데킬-3, 3, 3′, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시야닌 4-클로로벤젠술포네이트 소금)8,9,101.
PKH67 및 PKH26과 같은 다른 지방성 염료는, 고형성 극지 헤드 그룹과 어떤 지질 구조로 쉽게 상호 작용하고 장기 염료 보존 및 안정적인 형광12로이어지는 긴 알리파성 탄화수소 꼬리를 갖는다. PKH 염료는 또한 EV 라벨을 지정할 수 있으며, 이는 생체 내에서EV 속성의 연구를 할 수 있습니다13. 다른 많은 염료는 형광 현미경 검사법과 유동 세포종을 사용하여 외종을 관찰하는 데 사용되어 왔으며, 여기에는 지질 라벨염료14 및 카박스시플루오레세인 디아세테이트 succinimidyl ester(CFDA-SE)15,16 및 칼세옥 아세틸(AM)
CNS에 있는 다른 세포 사이 sEV 매개 한 교차토크의 연구 결과는 신경 염증성 및 신경 퇴행성 질환의 병인에 중요한 통찰력을 제공했다18. 예를 들어, 뉴런으로부터의 sEV는 베타 아밀로이드 펩타이드와 인광타우 단백질을 퍼뜨리고알츠하이머병(19)의발병에 도움을 주어 질 수 있다. 추가적으로, 적혈구에서 파생된 전기는 많은 양의 알파-시뉴클레인을 함유하고 있으며 혈액-뇌 장벽을 넘어파킨슨병증(20)에기여할 수 있다. sEV의 능력은 생리적 장벽을교차하고 표적 세포에 자신의 생체 분자를 전송하는 그들에게 CNS22에치료 약물을 전달하는 편리한 도구를 만든다.
척수에 있는 무수한 CNS 세포에 의하여 sEV upup를 시각화하는 것은 기계학 연구 및 각종 세포 근원에서 외인성 관리한 sEV의 치료 이득의 평가를 둘 다 가능하게 할 것입니다. 이 논문은 대식세포에서 파생된 sEV를 라벨로 지정하고 생체외에서 의 기생을 이미지하고 뉴런, 마이크로글리아 및 성상세포에 의해 요추 척수에서 생체내로 분류하여 시각화에 의한 sEV 전달을 질적으로 확인하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
참고: 모든 절차는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수하여 수행되었으며 드렉셀 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 시간 임신 한 CD-1 마우스는 성상체 배양에 사용되었고, 모든 댐은 함침 후 15 일 수신되었다. 12주 된 C57BL/6 마우스는 생체 내 섭취 실험에 사용되었다.
1. RAW 264.7 대식세포로부터 의 대체 분리
- 배양 RAW 264.7 세포는 DMEM 엑소좀 고갈된 배지에서 75cm2 플라스크로 24-48h에 대해 10% 엑소좀 고갈된 태아소 혈청(FBS)과 1%의 페니실린-연쇄절제술(pen-strep)을 함유하고 있다.
- 4°C에서 10분 동안 300ml의 조건부 배지 및 원심분리기를 300× g에서 수집합니다.
- 4°C에서 20분 동안 2,000g× g에서 상피 및 원심분리기를 수집합니다.
- 상체를 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 12,000g에서 35분 동안 ×.
- 상체를 수집하고 0.22 μm 주사기 필터를 통해 필터링합니다.
- 4°C에서 110,× 000 g에서 80분 동안 초원심분리기 튜브 및 원심분리기로 이송합니다.
- 상체(exosome-고갈된 매체)를 저장하고, 1x 인산염 완충식식염(PBS)의 2mL로 펠릿을 재중단하고, 원심분리기는 4°C에서 110,000× g에서 1시간 동안 재차한다.
- 나노입자 추적 분석(NTA) 및 투과 전자 현미경검사(TEM) 또는 서부 블로팅을 위한 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 버퍼를 사용하여 추가 특성화를 위해 PBS의 100 μL에서 펠릿을 재중단한다.
2. sEV의 특성화
- 나노입자 추적 분석(NTA)
참고: RAW 264.7 셀로부터의 정제된 세프의 크기 분포 및 입자 개수/농도는 NTA에 의해 측정되었다.- 최적의 추적을 위해 시야별 20-60 개의 소포를 얻기 위해 필터링 된 PBS의 sEV를 희석합니다.
- 일정한 유량의 주사기 펌프를 사용하여 희석된 샘플을 유량 셀에 도입합니다.
- 30 s의 3-5 동영상을 촬영합니다. 셔터 속도와 게인을 설정하고 카메라 설정을 수동으로 집중하여 최대 소포 수를 표시하고 추적 및 분석할 수 있습니다.
- 복제 측정을 수행하기 위해 각 기록 간에 샘플을 사전합니다. NTA 인수 후 설정을 최적화하고 샘플 간에 설정을 일정하게 유지합니다.
- NTA 소프트웨어를 사용하여 각 비디오를 분석하여 소포의 평균 크기와 농도를 얻습니다.
- 일관성을 위해 동일한 시스템 설정으로 모든 NTA 측정을 수행합니다.
- 웨스턴 블롯
- 제조 업체의 지시에 따라 단백질 분석 키트를 사용 하 여 sEV, 세포 용액 및 엑소좀 고갈 된 매체에서 총 단백질 양을 정량화.
- 세포 용해 제제의 경우, 80-90%까지 75cm2 플라스크로 RAW 264.7 세포를 배양한다. 10-15분 동안 0.25%의 트립신으로 세포를 분리하고, 배양 배지로 트립신을 중화시키고, 5분 × 동안 400 g에서 회전하여 세포를 펠릿한다. 신선한 성장 배지에서 세포를 다시 중단.
- 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 1 × 106 세포를 다른 튜브로 옮길 수 있습니다. 위와 동일한 원심분리 조건을 사용하여 PBS로 세포를 두 번 세척하고 최종 스핀에서 셀 펠릿에 50 μL의 용해 완충제(protease 억제제 칵테일을 첨가한 RIPA 버퍼)를 추가합니다.
- 세포를 소용돌이치며 20분 동안 얼음 위에 보관하십시오. 4°C에서 30분 동안 10,000 ×g의 원심분리로 혼합물을 주체하고, 신선한 미세원심분리기 튜브에서 상체(즉, lysate)를 수집하고, 사용할 때까지 -80°C에서 보관한다.
- 단백질의 양을 정량화하기 전에 3 kDa-컷오프 원심 필터를 사용하여 100 μL에 엑소솜 고갈 된 매체의 2 mL을 농축한다. sEV를 1:1 비율로 혼합하고, 30초동안 소용돌이를 만들고, 15분 동안 얼음에 배양하여 단백질의 양을 정량화합니다.
- sEV의 동일한 양의 단백질(2 μg), RAW 264.7 셀 리세이트 및 외성 고갈 된 매체를 샘플 버퍼를 감소시키는 혼합합니다.
- 샘플을 95°C에서 5분 동안 분해하고 5분 동안 얼음 위에 보관하고 10,000 ×g에서 2분 동안 회전합니다. 샘플을 12% 트리글리신 단백질 젤에 적재하고 젤을 125 V에서 45분 동안 실행합니다.
- 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 25 V에서 2시간 동안 전달한다.
- 이송 후, 실온에서 1h에 대한 차단 버퍼 (재료의 테이블참조)와 PVDF 멤브레인을 차단합니다.
- 4°C에서 하룻밤 사이에 셰이커에 1차 항체로 블롯을 배양한다.
참고: 사용된 1차 항체는 항 CD81(1:1,000), 항알파-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-상호작용 단백질 X(Alix) (Alix) (Alix) (1:1,000), 칼넥신 방지(1:1,000), 및 안티 글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH) (1:1,000). - 1x 트라이버퍼식 식염수, 0.1% 트웬 20(TBST)으로 블로트 3 x 15분 세척, 염소 안티마우스 IgG-고추냉이 과로시다제(HRP) 또는 당나귀 안티래빗 IgG-HRP-컨쥬게이드 이차 항체(1:10,000 h)로 실온에서 배양한다.
- 1x TBST로 3 x 15분 동안 블롯을 세척하고 HRP 기판을 사용하여 단백질을 감지합니다.
- 웨스턴 블롯 이미저를 사용하여 향상된 화학 발광을 사용하여 얼룩을 분석합니다.
- 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)
- 0.1 M 인산염 버퍼(PB)에서 2% 파라포름알데히드(PFA)로 재보설하여 sEV를 수정합니다. 2 x 15 s용 소용돌이.
- 깨끗한 파라필름에 10 μL의 sEV 서스펜션을 놓습니다. 카본 코팅 폼바 그리드를 서스펜션을 향한 코팅된 면을 플로팅합니다. 마른 환경에서 멤브레인을 20 분 동안 흡수하십시오.
- 그리드(멤브레인 사이드 다운)를 PB 한 방울에 놓고 3 x 2 분 동안 세척하십시오.
- 그리드를 5분 동안 1% 글루타랄데히드의 50 μL로 전송합니다.
- 8 x 2 분 동안 증류수 100 μL로 그리드를 세척하십시오.
- 2 분 동안 1 % uranyl 아세테이트의 드롭에 그리드를 배치하여 샘플을 대조.
- 시료를 0.2%의 50 μL에 2% 메틸셀룰로오스 용액으로 파라필름으로 덮인 얼음 접시에 10분 동안 포함시합니다.
- 스테인레스 스틸 루프를 사용하여 그리드를 유지하고 필터 용지로 과도한 유체를 제거합니다.
- 루프에 있는 동안 그리드를 10분 동안 공기 건조시합니다.
- 80 kV에서 전송 전자 현미경으로 관찰하십시오.
3. sEV 라벨링
- 염료 제어를 위한 희석완충액 1mL 또는 동일한 PBS 부피1mL에 20 μg의 sEV를 희석시 희석한다.
- 희석 완충제의 1mL에 PKH67 또는 PKH26 염료3μL을 희석하고 파이펫팅하여 혼합한다.
- 희석된 PKH 염료를 희석된 SEV에 넣고 파이펫팅하여 섞습니다. 실온에서 어둠 속에서 5 분 동안 배양하십시오. 염료 제어를 위해, 3.1 단계에서 희석 된 PBS와 희석 된 염료를 혼합합니다.
- PBS에 1% 소 세럼 알부민(BSA)의 2mL을 첨가하여 염료와 sEV 믹스를 튜브에 넣고 염료를 흡수한다.
- 4°C에서 110,000 × g에서 1h의 원심분리기. 상체를 버리고, PBS의 2mL에서 펠릿을 재차, 원심분리기는 4°C에서 110,000 × g에서 1h로 재차한다. PBS로 세척을 반복하고 표지된 SEV 또는 염료 제어를 동일한 볼륨으로 복리용합니다.
- 브래드포드 방법에 의한 총 단백질의 양을 정량화한다.
4. 신경-2a 세포에 의한 sEV 섭취
- 12웰 플레이트에 18mm 커버립을 놓고 10개의 × 104 Neuro-2a 세포를 10% FBS 및 1% 펜 스트렙을 함유한 완전한 DMEM 배지 1mL의 총 1mL에 배치합니다.
- 세포 수렴성이 80-90%인 경우 배지를 DMEM 엑소좀 고갈된 매체로 변경한다. 1, 5 또는 10 μg의 라벨이 붙은 sEV를 각 웰에 1, 4 및 24h에 추가하여 용량 및 시간 의존적 섭취를 하거나 동일한 양의 염료 제어를 추가합니다.
5. 초등회 성상세포 문화
- 저체온증을 유도하여 출생 4 일 후에 출생 후 새끼 4개 마취.
- 10mM 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산(HEPES)으로 보충된 얼음-차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 함유한 60mm 페트리 접시에서 뇌를 수집합니다.
- 피질 엽을 모두 해부하고 수막을 제거합니다. 멸균 된 블레이드로 조직을 다진다.
- 조직을 파충/데옥시리보누벨리스 I 해리 버퍼를 포함하는 15mL 원추형 튜브로 이송하고 37°C에서 20분 동안 배양한다. 5분마다 소용돌이치기.
참고: 4개의 마우스 코르티제의 경우, HBSS의 7.5 U/mL 파파인 9mL이 37°C에서 30분 이상 활성화되고, 0.22 μm 주사기 필터를 통해 여과하고, 데시리보누벨리스 I와 혼합하여 0.1 mg/mL의 최종 농도로 혼합한다. - 수퍼내티츠를 흡인시키고 완전한 DMEM 5mL를 추가하여 효소 활성을 비활성화합니다. 5mL 유리 세로지컬 파이펫과 화염 광택 파스퇴 파이펫으로 조직을 분리하는 것을 조심스럽게 세심하게 세심하게 합니다.
- 40 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과하고 4 °C에서 5 분 동안 250 × g에서 세포를 원심 분리합니다. 75cm2 플라스크에서 전체 DMEM의 10mL에서 배지를 흡인하고 세포를 시드한다. 도금 후 4h의 신선한 DMEM 배지 15mL로 상체 매체를 교체하십시오.
- 시험관에서14 일 후, 6 시간 동안 320 rpm에서 마이크로글리아와 올리고덴드로키트를 분리하기 위해 플라스크를 궤도 셰이커로 옮다.
- 37°C에서 10분 동안 세포 해리효소(재료 표)의5mL를 사용하여 나머지 성상세포를 트립시션한다. 완전한 DMEM 5mL을 추가하여 효소 작용을 비활성화하고 4 °C에서 5 분 동안 250 × g에서 세포를 펠릿하십시오.
- 전체 DMEM에서 셀을 다시 일시 중지합니다. 씨앗 5 × 104 셀에 12 mm #1.5 커버립 24 웰 플레이트에.
6. 성상세포에 의한 sEV 섭취
- 성상 세포가 80-90 %의 합류에 도달하면 매체를 DMEM 엑소솜 고갈 매체로 변경합니다.
- 레이블이 지정되지 않은 레이블이 없는 sEV 1μg, 동일한 양의 염료 제어 또는 PBS를 셀에 추가합니다. sEV 치료 후 1h 및 24 h염색세포를 사용하십시오.
7. 면역형광
- PBS 3x로 세포를 헹구고 실온에서 10 분 동안 PB에서 4 % PFA로 고정하십시오.
- 고정셀을 PB로 3 x 5분 세척하고 PB에서 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 10-15분 동안 세척하고 PB 3 x 5분으로 세척합니다.
- 실온에서 1시간 동안 PB에서 5% 정상 염소 혈청(NGS)으로 세포를 차단합니다.
- 1 차적인 항체로 세포를 배양: microtubule 관련 단백질 2 (MAP2A, 1:500) 신경-2a 세포 또는 신경교낭 산성 단백질 (GFAP, 1:500) 신선한 5% NGS/PB 에 대한 신선한 5% NGS/PB 는 부드러운 흔들림으로 4°C에서 하룻밤 사이에.
- PB로 3 x 10 분 세척하고 플루오로포레 접합 보조 항체 (염소 안티 마우스 IgG1, 알렉사 플루어 594; 또는 염소 안티 마우스 IgG H&L, 알렉사 플루어 488)를 5 % NGS에 추가하고 로커의 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- PB로 3 x 10분 세척하고 핵 얼룩 4',6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI)의 1μg/mL로 실온에서 10분 동안 배양하십시오. PB로 셀을 다시 3배 다시 세척합니다.
- 페이드 장착 방지 매체를 사용하여 #1 슬라이드에 커버립을 장착합니다. 어둠 속에서 밤새 건조하고, 공초점 현미경에 이미징 될 때까지 4 °C에서 준비 된 유리 슬라이드를 저장합니다.
8. sEV의 생체 내 섭취
- 표지되지 않은 또는 표지된 sEV 5μg의 인트라테칼 주입을 PBS의 10 μL로 재장매하거나, 동일한 부피(10 μL)의 염료 제어(섹션 3에서 제조됨)를 C57BL/6 마우스로 주입한다.
- 후 6 및 18 sEV의 후 주입, 깊이 케타민의 100 mg/kg 체중의 내 역류 주사와 자일라진의 10 mg/kg 체중에 의해 마우스를 마취.
- 0.9% 식염수로 생쥐의 심내 복혈을 수행하여 혈액을 씻어내고, 갓 만든 얼음 차가운 4% PFA/PB가 그 뒤를 이습니다.
- 척수를 해부하고 24 시간 동안 4 ° C에서 4 % PFA / PB로 수정하십시오. Cryo는 24 시간 동안 또는 조직이 가라 앉을 때까지 PB에서 30 % 자당에서 조직을 보호합니다. 면역 조직 화학까지 4 °C에서 조직을 저장합니다.
9. 면역 작용화학
- O.C.T 화합물에 L4-L5 척수를 포함. 완전히 고화 될 때까지 드라이 아이스에 동결.
- 저온을 사용하여 30 μm(척수의 단면)에서 조직을 섹션화하고 PB를 포함하는 24웰 플레이트에서 단면을 수집합니다. PB에서 0.3 % 트리톤으로 섹션 3 x 5 분 세척하십시오.
- 실온에서 2시간 동안 0.3% Triton/PB에서 5% NGS로 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
- 희석 1차 항체: 항 MAP2A(1:500), GFAP(1:1,000), 마이크로글리아용 이바1(1:2,000), 0.3% 트리톤/PB에서 5% NGS를, 셰이커에 4°C로 하룻밤 동안 배양한다.
- 섹션 3 x 5 분 0.3% 트리톤/PB로 세척하고, 실온에서 2시간 동안 5% NGS/PB에 이차 항체(당나귀 안티래빗 IgG 알렉사 플루어 488, 1:500 또는 염소 안티 마우스 IgG 알렉사 플루어 488, 1:500)를 추가합니다.
- PB로 3 x 5분 세척하고 실온에서 10분 동안 DAPI의 1 μg/mL로 섹션을 배양합니다. PB로 섹션 3 x 5 분 세척합니다.
- 깨끗한 접착제 슬라이드(재료 테이블)에섹션을 마운트하고 가벼운 현미경 아래에 미세 한 페인트 브러시를 장착합니다.
- 장착 매체로 커버슬립을 적시다. 실온에서 어둠 속에서 하룻밤 을 치료하십시오.
- 각각의 레이저를 가진 공초점 현미경의 밑에 심상.
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Representative Results
원심분리를 통해 RAW 264.7 컨디셔닝 된 매체로부터 sEV를 분리한 후, NTA는 정제된 세프의 농도 및 크기 분포를 결정하는 데 사용되었다. RAW 264.7 유래 sEV의 평균 평균 크기는 140nm이고 피크 입자 크기는 121.8nm였으며, 빛 산란 측정에서 대부분의 검출 가능한 입자가 50-150 nm(그림1A)에서엑소좀 또는 sEV의 크기 범위 내에 떨어졌는 것을 확인하였다. 세포 외 소포 2018 (MISEV2018)23의연구를위한 최소한의 정보에서 제안 된 바와 같이, 우리는 뚜렷한 EV 인구에서 존재하거나 제외되어야하는 단백질 세트를 분석했습니다. sEV, 세포 용해 및 엑소 고갈 된 매체의 서양 블로팅은 sEV 유래 단백질 샘플에 sEV 마커 단백질 Alix, CD81 및 GAPDH가 포함되어 있음을 입증했습니다. 세포 리자테 분획은 sEV에 없는 내과성 망상 상주 단백질, calnexin으로 풍부하게 되었다. 따라서, 칼넥신은 세포 오염에 대한 음의 마커로 작용하였다(도1B).
우리는 다음 시험관 내에서sEV uptake에 대한 용량 반응 및 시간 과정 실험을 수행. 신경-2a 세포는 1, 4 및 24h에 대한 PKH67 표지 된 sEV의 단일 1 μg 용량으로 배양되었으며, 그 다음 sEV (1, 5 및 10 μg)의 상이한 농도의 섭취를 1 h에서 검사하였다. NTA의 결과는 평균 단백질의 1 μg가 ~1 x 109 입자와 동일하다는 것을 표시했습니다. 동시에 PBS, 레이블이 지정되지 않은 SEV 및 염료 단독 컨트롤도 테스트되었습니다. 우리는 sEV의 섭취량이 1h(도 2A)와1, 5 및 10 μg sEV(도 2B)에서발생하는 것을 관찰했습니다. 형광은 sEV의 5 및 10 μg(도 2C)포스트 배큐어에 대해 4 h에서 검출 될 수 있었다. 다음으로, 1차 성상세포에 의한 PKH26 라벨sEV의 섭취를 검사하였다(도3). 1차 피질 성상세포에서 sEV 섭취량으로부터의 최대형광은 24시간에서 발생했다. 라벨이 부착되지 않은 SEV는 형광을 나타내지 않았으며, sEV 자동 불발성이 거짓긍정(보충 도서 S1A)에 크게 기여하지 않는다는 것을 입증했습니다.
다음으로, 표지된 sEV는 면역 조직화학 및 공초점 현미경 검사를 사용하여 척수내의 다른 세포에 의한 sEV의 전달 및 섭취를 평가하기 위해 마우스로 주입되었다. 우리는 MAP2를 신경 마커로 염색, 성상체 마커로 GFAP, 마이크로 글리아마커로 IBA1. 뉴런(도4),성상세포(도5),및 마이크로글리아세포(그림6)는모두 PKH26 라벨이 부착된 sEV를 차지했으며, 최대sEV 형광은 6h 사후 주사에서 관찰되었다. sEV는 항상 세포 마커와 공동화하지 는 않았지만, 우리는 CNS 세포에 의한 차동 적 섭취를 관찰하지 않았습니다. 라벨이 부착되지 않은 RAW 264.7 sEV 또는 염료 제어의 5μg을 가진 인트라테칼 주사는 상당한 형광(보충도 S1B)을나타내지 않았다. 형광 신호는 수막에서 관찰되었다, 모두 6 h와 18 sEV의 주입 후(보충 도도 S1C).
도 1: 정제 된 RAW 264.7 sEV의 특성화. (A)크기 및 sEV의 농도는 나노 시력 NS300을 사용하여 결정되었다. 입자는 브라우니아 운동과 확산 계수를 기반으로 추적 및 크기가 조정되었습니다. sEV의 크기 분포는 nm에 표시됩니다. sEV의 농도는 입자/mL로 표현되었다. (B)sEV 마커 ALIX, GAPDH 및 CD81을 사용하여 정제된 sEV, 세포 용액 및 엑소좀 고갈된 매체에서 유래한 단백질의 서양 블롯. 내구성 망상 단백질 마커인 칼넥신은 sEV 제제에서 세포 오염을 모니터링하는 대조군 역할을 합니다. (C)전송 전자 현미경 검사는 sEV의 크기와 형태를 입증했다. 스케일 바 = 100 nm. 약어 : sEV = 작은 세포 외 소포; ALIX = 알파-1,3/1,6-만노실 트랜스포마이카제 (ALG-2)-상호 작용하는 단백질 X; GAPDH = 글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소; CD81 = 분화 81의 클러스터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Neuro-2a 세포에 의해 표시 된 RAW 264.7 sEV의 섭취. (A)PKH67-표지된 sEV(1 μg)는 1, 4, 또는 24h. sEV 섭취량을 공초점 현미경 검사용으로 항상 관찰된 배양 신경-2a 세포에 첨가하였다. (B)PKH67-표지된 sEV(1, 5, 또는 10 μg)를 신경-2a 세포에 첨가하여 1시간(C) PKH67-표지된 sEV(5 또는 10 μg)를 신경-2a 세포에 첨가하였다. PKH 염료로만 처리된 음성 대조군은 sEV염색(보충 도서 S1)을나타내지 않았다. 신경-2a 세포는 MAP2A(알렉사 플루어 594로 조사, 빨간색으로 표시됨)로 면역염색되었고, 세포 핵은 DAPI(파란색으로 표시됨) 및 PKH67(녹색으로 도시됨)을 가진 sEV로 염색하였다. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : sEV = 작은 세포 외 소포; MAP2A = 마이크로튜브 관련 단백질 2A; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기본 마우스 피질 성상세포에 의해 PKH26 라벨 RAW 264.7 sEV의 섭취. sEV의 1μg은 PKH26 염료로 표시되고 1차 성상세포 배양 배지에 추가되었습니다. sEV의 섭취는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 1 및 24 시간 후 부속에서 관찰되었다. 성상세포는 GFAP(Alexa Fluor 488로 프로브, 빨간색으로 표시됨)로 염색되었으며, 세포 핵은 DAPI(파란색으로 표시됨)로 반염색되었고, sEV는 이전에 PKH26(녹색으로 표시됨)으로 염색되었다. 스케일 바 = 20 μm. PKH26 염료만으로도 sEV 염색에 대한 음의 제어역할을 했습니다. 약어 : sEV = 작은 세포 외 소포; GFAP = 신경교 세동 산 성 단백질; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: RAW 264.7 sEvin 뉴런의 섭취. PKH26 라벨ss는 마우스에서 내트라더칼리를 주입하였다. 6 및 18h 이후, 마우스는 PFA 4%로 침투되었고 척수는 30 μm에서 분리되고 단면하였다. 척수 섹션은 세포 마커(Alexa Fluor 488로 프로브, 빨간색으로 표시됨) 및 DAPI 핵 카운터스테인(파란색으로 표시됨)으로 면역염색되었으며, sEV는 이전에 PKH26(녹색으로 표시됨)으로 표시되었다. 척수 구간은 MAP2A가 뉴런(red)을 시각화하기 위해 면역염색되었다. 공초점 현미경 검사는 다른 시점에서 MAP2A 양성 뉴런에서 sEV를 보여줍니다. 음의 대조군 PKH26 염료 단독 그룹은 sEV 염색을 나타내지 않았다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : sEV = 작은 세포 외 소포; PFA = 파라포름알데히드; MAP2A = 마이크로튜브 관련 단백질 2A; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 성상세포에서 RAW 264.7 sEV의 섭취. PKH26 라벨ss는 마우스에서 내트라더칼리를 주입하였다. 6 및 18h 이후, 마우스는 PFA 4%로 침투되었고 척수는 30 μm에서 분리되고 단면하였다. 척수 섹션은 세포 마커(Alexa Fluor 488로 프로브, 빨간색으로 표시됨) 및 DAPI 핵 카운터스테인(파란색으로 표시됨)으로 면역염색되었으며, sEV는 이전에 PKH26(녹색으로 표시됨)으로 표시되었다. 척수 구간은 성상세포(적)를 시각화하기 위해 GFAP를 위해 면역염색되었다. 공초점 현미경 검사는 다른 시점에서 GFAP 양성 성상세포에서 sEV를 보여줍니다. 음의 대조군 PKH26 염료 단독 그룹은 sEV 염색을 나타내지 않았다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : sEV = 작은 세포 외 소포; PFA = 파라포름알데히드; GFAP = 신경교 세동 산 성 단백질; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 마이크로글리아에서 RAW 264.7 sEV의 섭취. PKH26 라벨ss는 마우스에서 내트라더칼리를 주입하였다. 6 및 18h 이후, 마우스는 PFA 4%로 침투되었고 척수는 30 μm에서 분리되고 단면하였다. 척수 섹션은 세포 마커(Alexa Fluor 488로 프로브, 빨간색으로 표시됨) 및 DAPI 핵 카운터스테인(파란색으로 표시됨)으로 면역염색되었으며, sEV는 이전에 PKH26(녹색으로 표시됨)으로 표시되었다. 척수 구간은 마이크로글리아(적)를 시각화하기 위해 IBA1을 위해 면역염색되었다. 공초점 현미경 검사는 다른 시점에서 IBA1 양성 마이크로글리아에서 sEV를 보여줍니다. 음의 대조군 PKH26 염료 단독 그룹은 sEV 염색을 나타내지 않았다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : sEV = 작은 세포 외 소포; PFA = 파라포름알데히드; IBA1 = 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도서 S1: 기본 마우스 피질 성상 세포및 척수에 의해 표시 된 RAW 264.7 sEV의 섭취. (A)1차 마우스 피질 성상세포에 의한 PKH26 라벨RAW 264.7 sEV의 섭취를 위한 컨트롤. PBS에서 재중단된 라벨이 없는 sEV의 한 μg 또는 동일한 양의 PBS가 성상세포의 배양 배지와 병상 세포에 병행하여 추가되었습니다. PBS및 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 표지되지 않은 제어에 대해 1h에서 형광이 관찰되지 않았다. 성상세포는 GFAP(알렉사 플루어 488로 프로브, 빨간색으로 표시됨), 핵은 DAPI(파란색)로 반염색된 반면, 표지되지 않은 sEV는 PKH26 라벨이 부착된 sEV와 동일한 알렉사 플루오르 546 채널에서 시각화되었다. 스케일 바 = 50 μm.(B)PKH26 라벨 RAW 264.7 sEV의 섭취를 위한 제어는 생체 내에서마우스 척수에 의한. 표지되지 않은 sEV 또는 염료 대조군의 5μg이 마우스에 내트라더칼리를 주입하였다. 다시 말하지만, 형광 신호는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 표지되지 않은 sEV 또는 염료 단독 제어에 대해 관찰되지 않았다. 성상 세포는 GFAP (알렉사 플루어 488로 프로브, 빨간색으로 표시), 핵은 DAPI (파란색)로 반염색된 동안, 그리고 표시되지 않은 sEV는 PKH26 라벨 sEV와 같은 알렉사 플루오르 546 채널에서 시각화되었다. 스케일 바 = 50 μm. (C) 대표적인 이미지는 마우스 척추 수막에서 RAW 264.7 sEV의 존재를 드러냅니다 6 h 및 18 h 인트라테칼 전달 후. 5μg의 sEV는 PKH26 염료(녹색으로 표시됨)로 표시되었고, 핵은 DAPI로 반소되었다(파란색으로 표시됨). 별표는 전방 척추 동맥을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : sEV = 작은 세포 외 소포; PBS = 인산염 완충식식염; GFAP = 신경교 세동 산 성 단백질; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 PKH 염료와 sEV의 라벨링과 척수에 그들의 섭취량의 시각화를 보여주었습니다. PKH 리포필릭 형광염은 세포측정 및형광 현미경검사3,5,6,12,24,25를유동하여 세포 라벨링에 널리 사용된다. 상대적으로 긴 반감기 와 낮은 세포 독성으로 인해, PKH 염료는 생체 내 및 체외 세포 추적 연구26,27의넓은 범위에 사용될 수 있다. 우수한 막 보존 및 생화학적 안정성이 유리하지만, sEV로 정제된 지단백질 오염물질을 가진 형광 프로브의 상호 작용은 sEV 내재화 및 기능 연구의 해석을 손상시킬 수 있습니다. 따라서, sEV의 정제 및 라벨링은 오염물질을 가진 염료의 지속성이 생체 내분포(28)의오해로 이어질 수 있기 때문에 프로토콜에서 중요한 단계이다. 컨트롤의 포함은 입자의 비특이적 라벨링과 이러한 염료의 긴 반수로 인한 거짓 양성 형광 신호를 피하기 위해 중요합니다.
응집 및 혈성 염료의 미셀 형성은 또한 거짓 신호를 산출할 수 있습니다. 우리는 염료 단독 제어를 포함하고 이전 시점에서 EV 섭취량을 시각화하여 무료 또는 무한염료의 문제를 해결했습니다. PKH 라벨링에 대해 보고된 중요한 제한은 수많은 PKH26 나노입자가 SEV의 PKH26 염료 라벨링 중에 형성된다는 것입니다. 이 프로토콜에 포함되지는 않지만, PKH26 나노입자는 자당그라데이션(29)에의해 제거될 수 있다고 보고된다. 또 다른 연구는 NtA에 의한 sEV 크기에 대한 PKH 라벨링의 효과를 평가하고 PKH 라벨링30에따른 크기 증가를 보고했다. 그럼에도 불구하고 PKH 염료는 SEV가 어디로 횡단한지 보여주는 실용적이고 가치있는 추적자 역할을합니다. 이 연구의 또 다른 제한은 이 프로토콜이 내트라테칼 전달 후 세포 섭취 확인에 초점을 맞추고 있기 때문에 sEV를 정량화하지 않았다는 것입니다. 새로운 시아닌 계 멤브레인 프로브는 PKH 나노 입자(31)의형성과 같은 크기를 변경하거나 생성 하는 유물을 생성 하지 않고 sEV의 고감형 형광 이미징을 위해 최근에 개발 되었습니다., 그리고 의심 할 여 지 없이 미래 라벨 연구를 향상 시킬 것 이다.
대식세포는 신경염증에 중요한 역할을 하지만,엑소좀(32)을통해 화물을 전달하여 신경보호 기능을 발휘한다. 우리의 연구는 표지된 대식세포 유래 sEV가 Neuro-2a 세포, 1차 성상세포및 자궁 내 투여 후에 요추 척수에서 채택된다는 것을 보여줍니다. 결과는 더 긴 잠복 시간이배양33,34에서Neuro-2a 세포에 의한 sEV 또는 세포 분열의 저하에 기인할 수 있는 더 낮은 sEV 신호 강도로 이끌어 낼 수 있다는 것을표시합니다. 비록 낮은 처리량, 척수에 표시 된 sEV를 시각화 하기 위한이 프로토콜 sEV uptake를 확인 하는 초기 유효성 검사 연구에 사용할 수 있습니다.sEV 의 기능적 영향을 조사 하기 전에 전달 하는 seev. 우리는 몇몇 CNS 세포 모형에서 일반적으로 유사한 sEV upup를 관찰했기 때문에, uptake 프로세스는 비 선택적인 것으로 보입니다. 자동 형광이 이미징에서 문제가되는 경우, 라벨이 없는 sEV는 조직 및 문화의 이미징 중에 sEV 자동 형광을 부정하는 추가 제어로 사용될 수 있습니다. sEV의 투여량 및 투여 경로는바이오분배(11)의패턴에 영향을 미칠 수 있지만, 이 프로토콜은 sEV 섭취량의 정량적 분석에 최적화되지 않는다. sEV를 조사하기 위해 여러 가지 접근 방식과 다양한 이미징 전략이 채택되고 있으며, 이들은 sEV2의 생체 내 추적에 지속적으로 정교하고 최적화되고 있다.
이 프로토콜은 sEV uptake를 확인하는 하나의 접근 방식일 뿐입니다. 모든 프로토콜과 마찬가지로 멀티모달 접근 방식을 사용한 교차 유효성 검사가 도움이 될 수 있습니다. 구체적으로, sEV의 섭취는 수신자 세포 및 조직에 대한 생체 분자화물 전송을 조사함으로써 확인할 수 있다. 조사자가 전달된 sEV의 miRNA 조성물을 알고 있는 경우, sEV 전송을 확인하는 대체 접근법은 받는 사람 세포의 miRNA 변화를 확인하거나 전달된 miRNAs에 대한 표적 유전자의 발현 수준에 변화를 결정하는 것입니다. PBS 처리된 견본은 이 접근에 대한 대조군으로 사용될 수 있습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 대식세포 유래 sEV가 시험관내 및 생체 내 CNS 세포에 의해 채택된다는 개념을 뒷받침한다. 이 프로토콜은 척추 질환, 통증 및 염증에서 sEV의 역할을 조사하고 치료 작은 분자, RNA 및 단백질의 전달을위한 세포 차량으로 sEV를 개발할 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH NINDS R01NS102836및 펜실베니아 보건부 유니버설 연구 강화(CURE)의 보조금에 의해 지원되었으며, 시나 K. 아지트에게 수여되었습니다. 우리는 원고의 비판적 독서에 대한 박사 브래들리 내쉬 에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | cell dissociation enzyme |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
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