Summary
אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.
Abstract
מחלות לב גנטיות ולא גנטיות יכולות לגרום לתהליכי שיפוץ חמורים בלב. שיפוץ מבני, כגון תצהיר קולגן (פיברוזיס) ואי-התאמה תאית, יכול להשפיע על ההולכה החשמלית, לגרום להפרעות אלקטרומכניות, ובסופו של דבר להוביל להפרעות קצב. מודלי החיזוי הנוכחיים של שינויים פונקציונליים אלה מבוססים על מידע מבני לא משולב וברזולוציה נמוכה. הצבת מסגרת זו בסדר גודל שונה היא מאתגרת בשל חוסר היעילות של שיטות הדמיה סטנדרטיות בביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה ברקמה מסיבית. בעבודה זו אנו מתארים מסגרת מתודולוגית המאפשרת הדמיה של לבבות עכברים שלמים ברזולוציה מיקרומטרית. השגת מטרה זו דרשה מאמץ טכנולוגי שבו שולבו התקדמות בטרנספורמציה של רקמות ובשיטות הדמיה. ראשית, אנו מתארים פרוטוקול CLARITY אופטימלי המסוגל להפוך לב שלם לצורה ננו-נקבובית, היברידית הידרוג'ל, נטולת שומנים, המאפשרת שקיפות גבוהה וכתמים עמוקים. לאחר מכן, מתואר מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי המסוגל להשיג במהירות תמונות של שדה ראייה מזוסקופי (בקנה מידה מ"מ) ברזולוציה של קנה מידה מיקרוני. בעקבות פרויקט mesoSPIM, המיקרוסקופ שהגה מאפשר שחזור של כל לב העכבר ברזולוציה מיקרומטרית בסריקה טומוגרפית אחת. אנו מאמינים כי מסגרת מתודולוגית זו תאפשר להבהיר את מעורבותם של אי-סדר הציטו-ארכיטקטורה בתפקוד החשמלי ותסלול את הדרך למודל מקיף המתחשב הן בנתונים הפונקציונליים והן בנתונים המבניים, ובכך יאפשר חקירה מאוחדת של הגורמים המבניים המובילים לשינויים חשמליים ומכניים לאחר שיפוץ הרקמה.
Introduction
שיפוץ מבני הקשור למחלות לב יכול להשפיע על ההולכה החשמלית ולהכניס תפקוד אלקטרומכני של האיבר 1,2. הגישות הנוכחיות המשמשות לחיזוי שינויים תפקודיים משתמשות בדרך כלל ב-MRI וב-DT-MRI כדי לקבל שחזור כולל של תצהיר פיברוזיס, עץ כלי דם וחלוקת סיבים של הלב, והן משמשות למודלים של נתיבי התפשטות פוטנציאלית של פעולה מועדפת (APP) על פני האיבר 3,4. אסטרטגיות אלה יכולות לספק סקירה יפה של ארגון הלב. עם זאת, הרזולוציה המרחבית שלהם אינה מספיקה כדי לחקור את ההשפעה של שיפוץ מבני על תפקוד הלב ברמה התאית.
הצבת מסגרת זו בסדר גודל שונה, שבו תאים בודדים יכולים למלא תפקידים בודדים על התפשטות פוטנציאל פעולה, היא מאתגרת. המגבלה העיקרית היא חוסר היעילות של שיטות הדמיה סטנדרטיות לביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה (רזולוציה מיקרומטרית) ברקמות מסיביות (בגודל סנטימטר). למעשה, הדמיית רקמות ביולוגיות בתלת-ממד ברזולוציה גבוהה מסובכת מאוד בשל אטימות הרקמות. הגישה הנפוצה ביותר לביצוע שחזורים תלת-ממדיים באיברים שלמים היא להכין חתכים דקים. עם זאת, חיתוך, הרכבה והדמיה מדויקים דורשים מאמץ וזמן משמעותיים. גישה חלופית שאינה דורשת חיתוך הדגימה היא יצירת רקמה שקופה. במהלך השנים האחרונות, מספר מתודולוגיות להבהרת רקמות הוצעו 5,6,7,8. האתגר לייצר רקמות מסיביות, שקופות ומסומנות פלואורסצנטיות הושג לאחרונה על ידי פיתוח גישות טרנספורמציה אמיתיות של רקמות (CLARITY9, SHIELD10). בפרט, שיטת CLARITY מבוססת על הפיכת רקמה שלמה לצורה ננו-נקבובית, הידרו-היברידית, נטולת שומנים, המאפשרת להעניק שקיפות גבוהה על ידי הסרה סלקטיבית של דו-שכבתיות של שומנים בממברנה. יש לציין כי שיטה זו נמצאה מוצלחת גם בהכנה לבבית11,12,13,14. עם זאת, מכיוון שהלב שברירי מכדי להיות מתאים לניקוי אקטיבי, יש לנקות אותו באמצעות הגישה הפסיבית, הדורשת זמן רב כדי להעניק שקיפות מלאה.
בשילוב עם טכניקות הדמיה מתקדמות כמו מיקרוסקופיה של יריעות אור, ל-CLARITY יש פוטנציאל לצלם רקמות לב מסיביות בתלת-ממד ברזולוציה מיקרומטרית. במיקרוסקופיה של יריעות אור, הארת הדגימה מתבצעת עם יריעה דקה של אור המוגבלת במישור המוקד של מטרת האיתור. הפליטה הפלואורסצנטית נאספת לאורך ציר בניצב למישור התאורה15. ארכיטקטורת הגילוי דומה למיקרוסקופיית שדה רחב, מה שהופך את הרכישה למהירה הרבה יותר ממיקרוסקופים לסריקת לייזר. העברת הדגימה דרך יריעת האור מאפשרת קבלת טומוגרפיה מלאה של דגימות גדולות, עד דגימות בגודל סנטימטר. עם זאת, בשל התכונות הפנימיות של קרן גאוס, ניתן לקבל יריעת אור דקה מאוד (בסדר גודל של כמה מיקרונים) רק עבור הרחבה מרחבית מוגבלת, ובכך להגביל באופן דרסטי את שדה הראייה (FoV). לאחרונה הוצגה ערכת עירור חדשנית כדי להתגבר על מגבלה זו ולהחיל הדמיה מוחית, המאפשרת שחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה איזוטרופית16.
במאמר זה מוצגת גישת סליקה פסיבית, המאפשרת הפחתה משמעותית של תזמון הסליקה הנדרש על ידי פרוטוקול CLARITY. המסגרת המתודולוגית המתוארת כאן מאפשרת לשחזר לב עכבר שלם ברזולוציה מיקרומטרית בסריקה טומוגרפית אחת עם זמן רכישה בסדר גודל של דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות דירקטיבה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות והתאימו לעקרונות ולתקנות של משרד הבריאות האיטלקי. פרוטוקול הניסוי אושר על ידי משרד הבריאות האיטלקי (פרוטוקול מספר 647/2015-PR). כל בעלי החיים סופקו על ידי ENVIGO, איטליה. בניסויים אלה נעשה שימוש ב-5 עכברי C57BL/6J זכרים בני 6 חודשים.
1. הכנת פתרון
- יש להכין 4% פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח ספוגת פוספט (PBS) (pH 7.6) במכסה המנוע הכימי. אחסן את 4% PFA aliquots ב -20 °C במשך מספר חודשים.
- הכן תמיסת הידרוג'ל: יש לערבב 4% אקרילאמיד, 0.05% ביס-אקרילאמיד, 0.25% ייזום AV-044 ב-0.01 M PBS במכסה מנוע כימי. שמור את הריאגנטים ואת הפתרון על הקרח במהלך כל ההכנה. אחסנו את ההידרוג'ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
- הכן פתרון ניקוי: לערבב 200 mM חומצה בורית, 4% נתרן דודציל-סולפט (SDS) במים deionized; pH 8.6 במכסה מנוע כימי. אחסן את התמיסה בין 21-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע משקעי SDS.
- הכן תמיסת טירודה טרייה ביום הניסוי: הוסף 10 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1.2 mM MgCl2, ו 4.7 mM KCl; טיטרט ל-pH 7.4 באמצעות 1 M NaOH.
2. בידוד לב
- להזריק 0.1 מ"ל של 500 I.U. הפרין תת עורית 30 דקות לפני הליך בידוד הלב.
- מלאו מזרק של 30 מ"ל ושלוש צלחות פטרי בקוטר 6 ס"מ בתמיסת טיירוד טרייה. יוצרים בקע קטן (3-4 מ"מ עומק) על גבול אחת מצלחות הפטרי ומניחים אותו מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקופי.
- מקבעים צינורית בקוטר 1 מ"מ למזרק ומכניסים אותה לבקע של צלחת פטרי. ודא שאין בועות אוויר במזרק.
- מלאו מזרק של 20 מ"ל ב-4% PFA ושמרו אותו במכסה המנוע הכימי. הכינו צלחת פטרי ריקה מתחת למכסה המנוע.
- מרדימים את העכבר ב-3% איזופלורן/חמצן בקצב זרימה של 1.0 ליטר/דקה ומקריבים אותו על ידי נקע צוואר הרחם בהתאם לכללי רווחת בעלי החיים שבתוקף.
- לאחר ההקרבה, הסר את הפרווה מעל החזה ופתח את החזה כדי לקבל גישה מלאה ללב.
- לבודד את הלב, לטבול אותו בצלחת פטרי מלא בעבר עם 50 מ"ל של תמיסת טירוד. השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את אבי העורקים מיד ליד קשת אבי העורקים כדי לחשוף את הלב.
- להעביר את הלב תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בזהירות לבצע את cannulation. אין להכניס את הצינורית עמוק מדי לאבי העורקים (לא יותר מ-2 מ"מ) כדי למנוע נזק לרקמות.
- השתמשו במעט מהדק ותפר (גודל 5/0) כדי לקבע את הלב לצינורית.
- למזג את הלב עם 30 מ"ל של תמיסת Tyrode עם לחץ קבוע של 10 מ"ל / דקה כדי להסיר דם מן כלי הדם.
- מנתקים את הצינורית מהמזרק ומניחים את הלב בצלחת הפטרי המלאה בתמיסת טירוד. היזהר לא יש בועות אוויר בצינורית; אחרת, הסר את בועות האוויר כראוי.
- חברו את מזרק ה-20 מ"ל המלא ב-4% PFA קר לצינורית והכניסו את הלב לאותו לחץ קבוע.
- לדגום את הלב ב 10 מ"ל של 4% PFA ב 4 מעלות צלזיוס בלילה (O / N). כדי למנוע השפלה של רקמות, בצע את שלבים 2.6-2.13 בזמן הקצר ביותר האפשרי.
3. ניקוי לב
- למחרת, לשטוף את הלב ב 0.01 M PBS 3 פעמים ב 4 °C (64 °F) במשך 15 דקות.
הערה: לאחר שלב זה, הלב יכול להיות מאוחסן PBS + 0.01% נתרן אזיד (NaN3) ב 4 °C במשך מספר חודשים. - לדגום את הלב ב 30 מ"ל של תמיסת הידרוג'ל ברעידות (15 סל"ד) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.
- דגה את הדגימה בטמפרטורת החדר באמצעות מייבש, משאבת ואקום ומערכת צינורות המחברת את המייבש הן למשאבה והן לצינור חנקן.
- מניחים את הדגימה במייבש ופותחים את הבקבוקון, תוך שמירה על הפקק עליו.
- סגרו את המייבש והוציאו את החמצן מהצינור על ידי פתיחת צינור החנקן.
- הפעילו את משאבת הוואקום כדי להוציא את החמצן מהמייבש למשך 10 דקות.
- כבו את המשאבה והשתמשו בידית המייבש כדי לפתוח את צינור החנקן. ברגע שהלחץ שווה ללחץ האטמוספרי, פתחו בזהירות את המייבש וסגרו במהירות את הבקבוקון.
- שמור את הלב בתמיסת הידרוג'ל degassed ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות במנוחה.
- כאשר ההידרוג'ל עובר פולימריזציה נכונה ונראה ג'לטיני לחלוטין, הסר בזהירות את הלב ממנו והנח אותו במחזיק הדגימה.
- הכנס את מחזיק הדגימה עם הלב באחד מתאי הניקוי וסגור אותו כראוי כדי למנוע דליפות של פתרון הסליקה.
- הפעל את אמבט המים שבו ממוקם מיכל תמיסת הניקוי ואת המשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל את סירקולציה של פתרון הסליקה.
- שנה את תמיסת הסליקה במיכל פעם בשבוע כדי לזרז את הליך ההבהרה.
4. מכתים את קרום התא
- ברגע שהלב נראה מובהר לחלוטין, הסר אותו ממחזיק הדגימה ושטוף אותו ב -50 מ"ל של PBS מחומם במשך 24 שעות. יש לשטוף שוב ב-50 מ"ל של PBS + 1% של Triton-X (PBS-T 1x) למשך 24 שעות.
- דגירה של הדגימה ב-0.01 מ"ג/מ"ל נבט חיטה אגלוטינין (WGA) - Alexa Fluor 633 ב-3 מ"ל של PBS-T 1x ברעידות (50 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 7 ימים.
- לאחר הדגירה בת 7 הימים, יש לשטוף את הדגימה ב-50 מ"ל של PBS-T 1x בטמפרטורת החדר בטלטול במשך 24 שעות.
- לדגום את הדגימה ב 4% PFA במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף אותו 3 פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
הערה: לאחר שלב זה, הלב יכול להיות מאוחסן PBS + 0.01% NaN3 ב 4 °C במשך מספר חודשים. - לדגום את הלב בריכוזים הולכים וגדלים של 2,2′-תיומיאתנול (TDE) ב-0.01 M PBS (20% ו-47% TDE/PBS) למשך 8 שעות כל אחד, עד לריכוז הסופי של 68% TDE ב-0.01 M PBS כדי לספק את מקדם השבירה הנדרש (RI = 1.46). זהו המדיום התואם RI (RI-medium) לרכישת תמונות16.
5. הרכבה ורכישה של הלב
הערה: כל רכיבי המערכת האופטית מפורטים בפירוט בטבלת החומרים.
- מלאו בעדינות כ-80% מהקובט החיצוני (קוורץ, 45 מ"מ × 45 מ"מ × 42.5 מ"מ) במדיום RI.
הערה: כאן, ניתן להשתמש בפתרונות לא נדיפים שונים המבטיחים RI של 1.46. - מלאו בעדינות את הקובט הפנימי (קוורץ, 45 מ"מ × 12.5 מ"מ × 12.5 מ"מ) באותו מדיום RI.
- לטבול את הדגימה בתוך הקובט הפנימי. הדגירה של הדגימה שתוארה לעיל מאפשרת לדגימה להישאר יציבה בתוך מדיום ה-RI מבלי להיות מוחזקת.
- הזיזו בעדינות את הדגימה לתחתית הקובטה באמצעות פינצטה דקה וסדרו את הלב עם ציר האורך שלו במקביל לציר הראשי של הקובט כדי למזער את נתיב אור העירור על פני הרקמה במהלך הסריקה.
- תקן בעדינות את התקע המותאם מעל הקובט הפנימי באמצעות שני ברגים.
- הרכיבו את הדגימה לשלב המיקרוסקופ באמצעות המגנטים.
- תרגם את שלב הדגימה האנכי באופן ידני כדי לטבול את הקובטה הפנימית לתוך החיצונית.
- הפעל את מקור האור העירור (אורך גל של 638 ננומטר), הגדרת הספק נמוך (בסדר גודל של 3 mW).
- הזז את הדגימה באמצעות המתרגם הממונע כדי להאיר מישור פנימי של הרקמה.
- הפעל את תוכנת ההדמיה (HCImageLive) והגדר את ההדק של המצלמה למצב חיצוני (גיליון אור) כדי להניע את הדק הרכישה של המצלמה על-ידי התוכנה המותאמת אישית השולטת בהגדרה כולה.
- הפעל שמירה אוטומטית בחלונית Scan Settings והגדר את תיקיית הפלט שבה יש לשמור את התמונות.
- כוונן ידנית את מיקום הדגימה במישור XY עם המתרגמים הלינאריים כדי להזיז את הדגימה למרכז ה- FoV של חיישן המצלמה.
- הזז את הדגימה לאורך ציר Z באמצעות המתרגם הממונע הליניארי כדי לזהות גבולות לב לצורך שחזור טומוגרפי.
- הגדל את עוצמת הלייזר ל~20 mW, מוכן לסשן ההדמיה.
- התחל את הרכישה הטומוגרפית, לחץ על לחצן התחל בלוח הרצף של תוכנת ההדמיה, ובמקביל הזז את הדגימה לאורך ציר Z במהירות קבועה של 6 מיקרומטר לשנייה באמצעות המתרגם הממונע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערך הסליקה הפסיבית שפותח מאפשר לקבל לב עכבר בוגר מנוקה (עם ממד של הסדר 10 מ"מ x 6 מ"מ x 6 מ"מ) תוך כ -3 חודשים. כל רכיבי ההתקנה מותקנים כפי שמוצג באיור 1. שיפוע הטמפרטורה הזניח בין כל תא ניקוי (בסדר גודל של 3 מעלות צלזיוס) מאפשר שמירה על הטמפרטורה בטווח תקין בכל התאים.
איור 1: סכימה של מערך הסליקה הפסיבית. תמיסת הניקוי (לאחר סינון) מסתובבת ברצף דרך תאי הדגימה בעזרת המשאבה הפריסטלטית. תחזוקת מיכל התמיסה באמבט מים שנקבע בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס מאפשרת לטמפרטורת התמיסה להיות בין 37-45 מעלות צלזיוס בתוך התאים. תמונה שנוצרה באמצעות Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2 מראה את התוצאה של תהליך הניקוי של לב שלם. כפי שכבר דווח על ידי Costantini et al.16, השילוב של מתודולוגיית CLARITY עם TDE כ- RI-medium אינו משנה באופן משמעותי את הנפח הסופי של המדגם ואינו מוביל לעיוות אניזוטרופי של הדגימה.
איור 2: תמונה מייצגת של לב לפני (משמאל) ואחרי (מימין) פרוטוקול CLARITY. הלבבות הופכים שקופים לחלוטין ומעט גדולים מדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
לאחר ניקוי הלב, קרומי התאים הוכתמו ב-WGA מצומד אלקסה פלואור 633 כדי לבצע שחזור ציטו-ארכיטקטורה של האיבר כולו. מיקרוסקופ יריעות האור הפלואורסצנטי המותאם אישית (איור 3) הצליח להבטיח רזולוציה בקנה מידה תלת-ממדי של מיקרון על פני ה-FoV כולו.
איור 3: MesoSPIM. עיבוד CAD של מיקרוסקופ גיליון אור פלואורסצנטי בהתאמה אישית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
בהתחשב בצמצם המספרי (NA = 0.1) של אופטיקת הגילוי, ניתן להעריך את פונקציית התפשטות הנקודות הרדיאלית (XY) של המערכת בסדר גודל של 4-5 מיקרומטר. מצד שני, אופטיקת העירור מייצרת יריעה קלה עם מותניים מינימליים של כ-6 מיקרומטר (רוחב מלא חצי מקסימום, FWHM) שמתפצלת עד 175 מיקרומטר בקצה ה-FoV (איור 4A-C). הסנכרון של התריס המתגלגל של המצלמה עם הסריקה הצירית של קרן הלייזר הבטיח לאסוף את אות הפליטה רק בחלק הדגימה הנרגש עם מותני יריעת האור, וכתוצאה מכך FWHM ממוצע של כ-6.7 מיקרומטר לאורך כל ה-FoV (איור 4B-D).
איור 4: יצירת יריעות אור ואפיון . (A) יריעת אור עירור שנוצרה עם מקור לייזר של 638 ננומטר ממוקדת במרכז שדה הראייה (FoV) ונרכשת בגודל פיקסל של 3.25 מיקרומטר וזמן חשיפה של 10 אלפיות השנייה. עוצמת האור מנורמלת ומדווחת באמצעות מפת צבע. חצי הרוחב המרבי (FWHM) של פרופיל עוצמת האור מוערך ב-15 מיקומים שונים לאורך ה-FoV. התוצאות מוצגות ב-C. (B) תמונה של יריעת אור העירור הנוצרת על ידי הסנכרון בין התריס המתגלגל של המצלמה הפועל ב-1.92 הרץ לבין מיקום קרן האור המונע על-ידי העדשה הניתנת לכוונון. ה-FWHM של פרופיל עוצמת האור מוערך לאורך ה-FoV והתוצאות מוצגות ב-D. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ה-Z-PSF של המיקרוסקופ הוערך גם על-ידי שחזור טומוגרפי של הננוספרה הפלואורסצנטית (איור 5). FWHM של 6.4 מיקרומטר ניתן להעריך על ידי ההתאמה, בהסכמה טובה עם ההערכה הקודמת.
איור 5: פונקציית התפשטות נקודה בציר Z. פונקציית התפשטות הנקודה (PSF) של המערכת האופטית נאמדת על ידי הדמיית ננו-כדורים תת-מיקרוניים פלואורסצנטיים (נרגשים עם יריעת אור באורך גל של 638 ננומטר) בגודל פיקסל של 3.25 מיקרומטר × 3.25 מיקרומטר × 2.0 מיקרומטר. פרופיל עוצמת PSF לאורך הציר האופטי (Z) מיוצג כנקודות שחורות. פרופיל PSF מצויד בפונקציית גאוס עם μ = 18.6 מיקרומטר ו- σ = 2.7 מיקרומטר. ה-FWHM של ה-PSF המוערך על ידי ההתאמה הוא 6.4 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
בשל השקיפות הגבוהה של הרקמה, ניתן היה להאיר את כל הלב ללא עיוות משמעותי של יריעת האור הסרוקה באופן אקסיאלי באורך גל עירור של 638 ננומטר. אות הפלואורסצנציה נאסף על ידי חיישן sCMOS הפועל בזמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה וקצב פריימים של 1.92 הרץ. בהתבסס על כימות קודם, הרכישה הטומוגרפית בוצעה באמצעות מהירות סריקת Z של 6 מיקרומטר לשנייה, ובהנחה של קצב פריימים של 1.92 הרץ, נרכשה מסגרת אחת לכל 3.12 מיקרומטר, דגימת יתר של המערכת Z-PSF בערך פי שניים. שתי מסגרות מייצגות (במישור הקורונלי ובמישור הרוחבי) של החדר השמאלי מוצגות באיור 6. תוצאה זו מאשרת את הפוטנציאל של המערכת לפתור ממברנות תאיות בודדות בשלושה ממדים עם יחס אות/רעש מספיק בכל האיבר (איור 6).
איור 6: שחזור רקמת לב של עכבר. הלב המובהר היה מוכתם ב-WGA מצומד לאלקסה פלואור 633 ונרגש ממקור לייזר עם אורך גל של 638 ננומטר. (א) מקטעים קורונליים ו-(ב) רוחביים מייצגים. (ג-ד) טרנספורמציה רקמה מייצרת שקיפות רקמה גבוהה, המאפשרת לפתור מבנים קטנים בעומק הקיר. המערכת האופטית מציגה רזולוציה צירית המספיקה לפתרון מבנים מיקרומטריים (פאנל). D). (E) עיבוד לב ברזולוציה נמוכה בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו הוצגה גישה מוצלחת לניקוי, הכתמה ותמונה של לב עכבר שלם ברזולוציה גבוהה. ראשית, פרוטוקול טרנספורמציה של רקמות (CLARITY) עבר אופטימיזציה ובוצע, שונה מעט ליישומו על רקמת הלב. ואכן, כדי להשיג שחזור יעיל בתלת מימד של לב שלם, חיוני למנוע את תופעת פיזור האור. מתודולוגיית CLARITY מאפשרת לנו להשיג לב שלם שקוף מאוד, אך היא דורשת זמני דגירה ארוכים כאשר היא מבוצעת באופן פסיבי (כ -5 חודשים). לגבי המוח, רקמת הלב אינה מתאימה לניקוי פעיל, המנצל שדה חשמלי. גם במתחים נמוכים, השדה החשמלי מוביל לנזקים ולשברים ברקמות. כאן, גישת סליקה פסיבית הותאמה להשגת לב מנוקה לחלוטין תוך כ -3 חודשים. לאחר בידוד ושיכרון הלב באמצעות אבי העורקים הפרוקסימלי, מתודולוגיית CLARITY בוצעה כמתואר בסעיף 3 של הפרוטוקול. כדי לזרז את ההליך, נערך מערך סליקה פסיבית תוצרת בית (איור 1), שבסופו של דבר הפחית את תזמון ניקוי הרקמות בכ-40%. המערך מורכב ממיכל לתמיסת הסליקה, אמבט מים, משאבה פריסטלטית, מספר תאים המכילים מחזיקי דגימה שונים, מסנני קפסולה לכל תא ומערכת צינורות למחזור התמיסה. המשאבה מוציאה ומפיצה את התמיסה מהמיכל ברצף דרך כל אחד מהתאים, שם מוחזקות הדגימות לפינוי. לפני הכניסה לתאים, התמיסה זורמת דרך מסנן קפסולה כדי ללכוד את השומנים שנשטפו מהרקמות במהלך הסליקה. הטמפרטורה האופטימלית לתמיסת הסליקה, בין 37-45 מעלות צלזיוס, נשמרת בתוך התאים במהלך הסירקולציה על ידי שמירה על מיכל התמיסה באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס. מומלץ לשנות את תמיסת הסליקה במיכל פעם בשבוע במהלך ההליך. כל הרכיבים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים. הפתרון האופטימלי המוצג כאן מאפשר לנו להשיג לב עכבר שלם מנוקה באופן פסיבי בזמן קצר משמעותית ביחס לטכניקת הסליקה הפסיבית הסטנדרטית, ובכך לקצר את זמן הניסוי הנדרש מבלי לפגוע באיבר. גישת הצביעה הותאמה גם לתיוג הומוגני של קרומי התאים והאנדותל, באמצעות לקטין פלואורסצנטי (WGA - Alexa Fluor 633).
ציטו-ארכיטקטורה של הלב שוחזרה על ידי פיתוח mesoSPIM ייעודי שמטאטא באופן אקסיאלי את יריעת האור על פני הדגימה (https://mesospim.org). מיקרוסקופ יריעות האור הפלואורסצנטי המותאם אישית (איור 3) הצליח להשיג במהירות תמונות של FoV מזוסקופי (בסדר גודל של מילימטרים) ברזולוציה מיקרומטרית. בדרך זו, cardiomyocytes יחיד ניתן לפתור ולמפות לתוך שחזור 3D של האיבר כולו. המיקרוסקופ מאיר את הדגימה שנוקתה באמצעות יריעת אור, הנוצרת באופן דינמי על ידי סריקת קרן לייזר במהירות 638 ננומטר באמצעות מראה גלוונומטרית. מצלמת sCMOS מאפיינת את זרוע הגילוי בסכמת הגדלה של פי 2 המאפשרת לה לרכוש את כל ה-FoV בסריקה אחת. אות הפלואורסצנציה נבחר על ידי הצבת מסנן מעבר ארוך לאחר המטרה. המצלמה הוגדרה לעבוד במצב תריס מתגלגל: בכל עת, קווי הפיקסלים הפעילים של המצלמה (כלומר, החשופים לתמונה) מסונכרנים עם ההסטה במישור של רצועת המוקד של יריעת האור, המבוצעת על ידי עדשה הניתנת לכוונון חשמלי. גישה זו מקסמה את יכולת החילוק האופטי בכל ה-FoV על ידי רכישת תמונות רק בחלק הדק ביותר של יריעת האור הממוקדת. פתרון זה שונה מתצורות קונבנציונליות, שבהן הרכישה כוללת את כל טווח עומק המוקד של יריעת האור, ומונעת רזולוציית חתך אופטית שיא בחלק גדול של ה- FoV. שלב דגימה משולב תומך ב-cuvettes, ובכך מייעל את המיקום ומאפשר תנועה צירית של הדגימה במהלך תהליך ההדמיה. בדרך זו, שחזורים טומוגרפיים אפשריים על ידי רכישת קטעים פנימיים עוקבים. התמונות המתקבלות הן בעלות FoV מזוסקופי ורזולוציה מיקרומטרית, בעוד שזמן הרכישה הנדרש ללב עכבר שלם הוא ~ 15 דקות. הסנכרון בין התריס המתגלגל של המצלמה לבין אלומת אור העירור שסוחפת את ה-FoV מאפשר לרכוש את כל מישור התמונה ברזולוציה מרחבית גבוהה (איור 4). הדבר מאפשר שחזור ישיר של הדגימה ברכישה טומוגרפית אחת, ללא צורך בתזוזה רדיאלית של דגימה והדמיה מבוססת ערימות סמוכות. יש לציין כי המיקרוסקופ איפשר שחזור של כל האיבר של בערך (10 מ"מ x 6 מ"מ x 6 מ"מ) בסשן הדמיה אחד, עם גודל ווקסל כמעט איזוטרופי ויחס אות לרקע מספיק כדי לפתור תאים בודדים על פני כל האיבר באופן פוטנציאלי.
ראוי לציין כי הפרוטוקול המוצע מציג כמה צעדים קריטיים שיש לבצע בזהירות כדי להשיג תוצאות טובות. בפרט, cannulation של הלב דרך אבי העורקים הפרוקסימלי יכול להיות די קשה, אבל זה צעד חיוני לשטוף ולתקן את האיבר כראוי. Judd et al.17, הראו כיצד לבצע צעד זה ביעילות. יתר על כן, הליך degassing הדרוש על ידי פרוטוקול CLARITY הוא מורכב למדי מדי, אבל זה חיוני לשימור רקמות; אם שלב זה אינו מבוצע כראוי, הרקמה עלולה להיתקל בנזקים וריקבון במהלך הדגירה בתמיסת הסליקה.
יתר על כן, למרות שתהליך העבודה הניסיוני המוצג מתאים לבדיקות פלואורסצנטיות קטנות, השימוש באימונוהיסטוכימיה לא תמיד מספק יעילות טובה בכתמים בשל המשקל המולקולרי הגבוה יותר של הנוגדנים. כל פרוטוקול אימונוסטינינג דורש אופטימיזציה נכונה, וננקטו גישות שונות לשיפור חדירת הנוגדנים, למשל, הרחבת רקמות18 ו/או וריאציות ב-pH ובחוזק היוני19.
מערך mesoSPIM מציג גם שתי מגבלות עיקריות: א) שימור יריעת האור על פני הדגימה תלוי מאוד בשקיפות הרקמה, ו- 2) הממד של חיישן המצלמה מגביל את ה- FoV. הבטחת תואם מושלם של מקדם השבירה בתוך הלב כולו היא מאתגרת מאוד, ושינויים קטנים במקדם השבירה יכולים לגרום לפיזור אור, מה שיוביל לפגיעה באיכות התמונה. מבחינה זו, ניתן להציג ערכת תאורה דו-צדדית. שתי זרועות עירור יכולות ליצור שתי יריעות אור דינמיות נפרדות ומיושרות עם תאורה ממוקדת מקסימלית על ידי החלפת התאורה מצד אחד למשנהו של הדגימה. כמו כן, ניתן לשפר את ה- FoV על ידי שימוש בדור חדש של sCMOS עם תאורה אחורית ברזולוציה גבוהה עם חיישנים גדולים מאוד בשילוב עם עדשות טלצנטריות עם צמצם מספרי גבוה עם עיוות שדה נמוך. יישום זה יאפשר לנו לשחזר איברים גדולים יותר או רקמות מורחבות תוך שמירה על אותה יכולת חתך אופטי ובכך לייצר תמונות תלת-ממדיות בקנה מידה מיקרוני של דגימות מנוקות בגודל סנטימטר.
למרות שהפרוטוקול המוצג עדיין דורש זמן רב להכנת דגימה ורמה גבוהה של שקיפות כדי לקבל שחזור cytoarchitecture אמין של האיבר כולו, המשמעות העיקרית של הגישה טמונה בשיפורים של פרוטוקול הסליקה והיכולת לבצע שחזור מזוסקופי בסריקה אחת ברזולוציה מיקרומטרית. בעתיד, ניתן יהיה לשלב את ההתקדמות הזו עם פרוטוקול רב-צביעה כדי להשיג שחזור איברים שלמים המשלב מבנים ביולוגיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מה לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענקים No 952166 (תיקון), MUR במסגרת תוכנית FISR, פרויקט FISR2019_00320 ו- Regione Toscana, הצדעה לבנדו רייסרקה 2018, פרויקט PERCARE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
