Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte
Summary
Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.
Abstract
Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs prometteurs pour les applications de thérapie génique. Ici, le vecteur AAV2 est produit par co-culture de cellules Spodoptera frugiperda (Sf9) avec des cellules Sf9 infectées par le baculovirus (BV)-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension sans sérum. Les cellules sont cultivées dans une fiole dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave. Pour libérer les particules d’AAV, les cellules productrices sont lysées dans un tampon contenant du détergent, qui est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat cellulaire à l’aide de la chromatographie sur colonne AVB Sepharose, qui lie les particules d’AAV. Les particules liées sont lavées avec du PBS pour éliminer les contaminants et éluées de la résine à l’aide d’un tampon de citrate de sodium à pH 3,0. L’éluat acide est neutralisé avec un tampon alcalin Tris-HCl (pH 8,0), dilué avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et concentré par filtration à flux tangentiel (TFF). Le protocole décrit la production de vecteurs précliniques à petite échelle compatible avec la fabrication d’AAV de qualité clinique à grande échelle pour les applications de thérapie génique humaine.
Introduction
Les virus adéno-associés (AAV) sont des parvovirus humains non enveloppés contenant un ADN simple brin de 4,6 kb. Les vecteurs AAV présentent plusieurs avantages par rapport aux autres vecteurs viraux pour les applications de thérapiegénique 1,2,3,4. Les AAV sont naturellement incompétents en matière de réplication, ce qui nécessite un virus auxiliaire et des machines hôtes pour la réplication. Les AAV ne causent aucune maladie et ont une faible immunogénicité chez l’hôte infecté3,5. L’AAV peut infecter à la fois les cellules quiescentes et les cellules en division active et peut persister sous forme d’épisome sans s’intégrer dans le génome des cellules hôtes (l’AAV s’intègre rarement dans le génome de l’hôte)1,3. Ces caractéristiques ont fait de l’AAV un outil souhaitable pour les applications de thérapie génique.
Pour générer un vecteur de transfert de gène AAV, la cassette transgénique, y compris le gène thérapeutique, est clonée entre deux répétitions terminales internes (ITR), qui sont généralement dérivées du sérotype 2 de l’AAV. La taille maximale de 5′ ITR à 3′ ITR, y compris la séquence transgénique, est de 4,6 kb6. Différentes capsides peuvent avoir un tropisme cellulaire ou tissulaire différent. Par conséquent, les capsides doivent être choisies en fonction du type de tissu ou de cellule destiné à être ciblé avec le vecteur AAV7.
Les vecteurs AAV recombinants sont couramment produits dans des lignées cellulaires de mammifères telles que les cellules rénales embryonnaires humaines, HEK293 par transfection transitoire du vecteur de transfert de gène AAV, AAV rep-cap, et les plasmides du virus auxiliaire2,3. Cependant, il existe plusieurs limitations pour la production d’AAV à grande échelle par transfection transitoire de cellules HEK293 adhérentes. Tout d’abord, un grand nombre de piles de cellules ou de bouteilles à rouleaux sont nécessaires. Deuxièmement, de l’ADN plasmidique de haute qualité et des réactifs de transfection sont nécessaires, ce qui augmente le coût de fabrication. Enfin, lors de l’utilisation de cellules HEK293 adhérentes, le sérum est fréquemment nécessaire pour une production optimale, ce qui complique le traitement en aval1,2,3. Une méthode alternative de fabrication de l’AAV consiste à utiliser la lignée cellulaire d’insectes, les cellules de Spodoptera frugiperda (Sf9) et un virus d’insecte appelé virus de la polyédrose nucléaire multicapside autographa californica recombinant (AcMNPV ou baculovirus)8,9,10. Les cellules Sf9 sont cultivées dans une culture en suspension sans sérum, facile à mettre à l’échelle et compatible avec la production actuelle de bonnes pratiques de fabrication (GMPc) à grande échelle, qui ne nécessite pas de réactifs plasmidiques ou de transfection. De plus, le coût de production de l’AAV à l’aide du système Sf9-baculovirus est inférieur au coût de l’utilisation de la transfection transitoire des plasmides dans les cellules HEK29311.
Le système original de production de rAAV utilisant des cellules baculovirus-Sf9 utilisait trois baculovirus: un baculovirus contenant une cassette de transfert de gènes, le deuxième baculovirus contenant le gène rep et le troisième baculovirus contenant le gène de capside spécifique au sérotype12,13. Cependant, la construction de rep contenant le baculovirus était génétiquement instable sur plusieurs cycles de passages, ce qui a empêché l’amplification du baculovirus pour la production à grande échelle d’AAV. Pour résoudre ce problème, un nouveau système de vecteurs rAAV a été développé, qui contenait deux baculovirus (TwoBac): un baculovirus contenant la cassette de transfert de gène AAV et un autre baculovirus contenant les gènes AAV rep-cap ensemble qui sont génétiquement plus stables que le système original et plus pratiques pour produire rAAV en raison de l’utilisation de TwoBac au lieu de trois14, 15. Le système OneBac utilise la cassette de transfert de gènes AAV et les gènes rep-cap dans un seul baculovirus, ce qui est plus pratique pour produire le rAAV en raison de l’utilisation d’un baculovirus au lieu d’utiliser TwoBac ou ThreeBac2,16,17. Dans notre étude, le système TwoBac a été utilisé pour l’optimisation.
Le système de baculovirus pour la production d’AAV a également des limites: les particules de baculovirus sont instables pour un stockage à long terme dans un milieu sans sérum11, et si le titre de baculovirus est faible, un grand volume de surnageant de baculovirus est nécessaire, ce qui peut devenir toxique pour la croissance des cellules Sf9 pendant la production d’AAV (observation personnelle). L’utilisation de cellules de préservation et de mise à l’échelle des cellules infectées sans titre (TIPS), ou de cellules d’insectes infectées par un baculovirus (BIIC), constitue une bonne option pour la production d’AAV dans laquelle les cellules Sf9 infectées par le baculovirus sont préparées, cryoconservées et ensuite utilisées pour l’infection de cellules Sf9 fraîches. Un autre avantage est la stabilité accrue du baculovirus (BV) dans les cellules Sf9 après cryoconservation10,11.
Deux types de cellules TIPS sont générés pour permettre la production d’AAV: le premier par infection des cellules Sf9 par le gène BV-AAV2-GFP ou thérapeutique, et le second par infection de la cellule Sf9 par BV-AAV2-rep-cap. Les cellules TIPS sont cryoconservées dans de petites aliquotes prêtes à l’emploi. Les vecteurs AAV sont produits en culture en suspension sans sérum dans une fiole placée dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave en co-cultivant des cellules TIPS qui produisent des baculovirus et des cellules Sf9 fraîches. Les cellules Sf9 sont infectées par des baculovirus porteurs du vecteur AAV2-GFP et des séquences rep-cap pour générer l’AAV. Quatre à cinq jours plus tard, lorsque les rendements en AAV sont les plus élevés, les cellules productrices sont lysées avec du détergent pour libérer les particules d’AAV. Le lysat cellulaire est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat par chromatographie sur colonne AVB Sepharose. Enfin, les vecteurs AAV sont concentrés à l’aide de TFF. Le protocole décrit la production d’AAV à petite échelle, utile pour la recherche et les études précliniques. Cependant, les méthodes sont évolutives et compatibles avec la fabrication de vecteurs AAV de qualité clinique pour les applications de thérapie génique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les paramètres utilisés dans ce protocole pour le développement de processus de production, de purification et de concentration de vecteurs AAV peuvent être appliqués à la fabrication à petite et à grande échelle de vecteurs AAV pour des applications de thérapie génique. L’ensemble du processus en amont et en aval peut être effectué dans un système fermé compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) en vigueur. Les principaux avantages du système Sf9-baculovirus sont l’évolutivité pour l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) de nous avoir généreusement fourni les plasmides AAV et Danielle Steele et Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) pour leur assistance technique. Ce travail est soutenu par le fonds Start-Up de la Cincinnati Children’s Research Foundation à M.N.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
Referências
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