Desenvolvimento de processos para a produção e purificação do vírus associado ao Adeno (AAV)2 Vetor usando o sistema de cultura de células de baculovírus-inseto
Summary
Neste protocolo, o vetor AAV2 é produzido por células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) com baculovírus (BV)-AAV2-green fluorescente protein (GFP) ou gene terapêutico e células Sf9 infectadas por BV-AAV2-rep-cap na cultura de suspensão. As partículas de AAV são liberadas das células usando detergente, clarificadas, purificadas pela cromatografia da coluna de afinidade, e concentradas pela filtragem de fluxo tangencial.
Abstract
Os vírus associados à Adeno (AAV) são vetores promissores para aplicações de terapia genética. Aqui, o vetor AAV2 é produzido pela co-cultura de células Spodoptera frugiperda (Sf9) com células Sf9 infectadas com baculovírus (BV)-AAV2-GFP (ou gene terapêutico) e BV-AAV2-rep-cap na cultura de suspensão livre de soro. As células são cultivadas em um frasco em um agitador orbital ou bioreator de ondas. Para liberar as partículas AAV, as células produtoras são diluídas em tampão contendo detergente, que é posteriormente esclarecido por centrifugação e filtração de baixa velocidade. As partículas de AAV são purificadas do liseto celular usando cromatografia da coluna AVB Sepharose, que liga partículas AAV. As partículas ligadas são lavadas com PBS para remover contaminantes e elucidadas da resina usando tampão de citrato de sódio no pH 3.0. O eluato ácido é neutralizado com tampão alcalino Tris-HCl (pH 8.0), diluído com soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS), e ainda concentrado com filtragem de fluxo tangencial (TFF). O protocolo descreve a produção de vetores pré-clínicos em pequena escala compatíveis com a escala até a fabricação de AAV de grau clínico em larga escala para aplicações de terapia genética humana.
Introduction
Os vírus associados ao Adeno (AAV) são parvovírus humanos não envoltos contendo um DNA de 4,6 kb. Os vetores AAV têm várias vantagens sobre outros vetores virais para aplicações de terapia genética1,2,3,4. Os AAVs são naturalmente incompetentes de replicação, portanto, requerem um vírus auxiliar e máquinas host para replicação. Os AAVs não causam nenhuma doença e têm baixa imunogenicidade no hospedeiro infectado3,5. O AAV pode infectar células quiescentes e ativamente divididas e pode persistir como episome sem se integrar ao genoma das células hospedeiras (AAV raramente se integram ao genoma hospedeiro)1,3. Esses recursos tornaram o AAV uma ferramenta desejável para aplicações de terapia genética.
Para gerar um vetor de transferência genética AAV, o transgene, incluindo o gene terapêutico, é clonado entre duas repetições de terminais internos (ITRs), que são tipicamente derivadas do sorotipo AAV 2. O tamanho máximo de ITR de 5′ a 3”, incluindo a sequência transgene, é de 4,6 kb6. Capsídeos diferentes podem ter uma célula ou tropismo de tecido diferente. Portanto, os capsídeos devem ser escolhidos com base no tipo de tecido ou célula destinado a ser direcionado com o vetor AAV7.
Vetores AAV recombinantes são comumente produzidos em linhas celulares de mamíferos, como células renais embrionárias humanas, HEK293 por transfecção transitória do vetor de transferência de genes AAV, rep-cap AAV e plasmídeos do vírus auxiliar2,3. No entanto, existem várias limitações para a produção de AAV em larga escala por transfecção transitória de células HEK293 aderentes. Primeiro, um grande número de pilhas de células ou garrafas de rolo são necessárias. Em segundo lugar, são necessários reagentes de DNA plasmídeo de alta qualidade e transfecção, o que aumenta o custo de fabricação. Finalmente, ao utilizar células HEK293 aderentes, o soro é frequentemente necessário para uma produção ideal, complicando o processamento a jusante1,2,3. Um método alternativo de fabricação de AAV envolve o uso da linha celular inseto, células Spodoptera frugiperda (Sf9) e um vírus inseto chamado recombinante Vírus de poliedrose nuclear multicapsid (AcMNPV ou baculovírus)8,9,10. As células Sf9 são cultivadas em cultura de suspensão livre de soro que é fácil de escalar e é compatível com a produção atual de boas práticas de fabricação (cGMP) em larga escala, o que não requer reagentes plasmídeos ou transfeccionados. Além disso, o custo da produção de AAV utilizando o sistema Sf9-baculovirus é menor do que o custo de uso de transfecção transitória de plasmídeos em células HEK29311.
O sistema de produção original rAAV usando células baculovírus-Sf9 utilizou três baculovírus: um baculovírus contendo de transferência genética, o segundo baculovírus contendo gene rep, e o terceiro baculovírus contendo gene capsídeo específico do sorotipo12,13. No entanto, o baculovírus contendo a construção de representantes era geneticamente instável em várias rodadas de passagens, o que impediu a amplificação do baculovírus para a produção de AAV em larga escala. Para resolver esse problema, foi desenvolvido um novo sistema vetorial rAAV, que continha dois baculovírus (TwoBac): um baculovírus contendo o de transferência de genes AAV e outro baculovírus contendo os genes de recape do AAV juntos que são geneticamente mais estáveis do que o sistema original e mais convenientes para produzir rAAV por causa do uso do TwoBac em vez de três14, 15. O sistema OneBac usa o de transferência de genes AAV e os genes de recapina em um único baculovírus que é mais conveniente para produzir o rAAV por causa do uso de um baculovírus em vez de usar TwoBac ou ThreeBac2,16,17. Em nosso estudo, o sistema TwoBac foi utilizado para otimização.
O sistema de baculovírus para produção de AAV também tem limitações: partículas de baculovírus são instáveis para armazenamento a longo prazo no meio11sem soro , e se o título de baculovírus for baixo, um grande volume de supernanato de baculovírus é necessário, o que pode se tornar tóxico para o crescimento de células Sf9 durante a produção de AAV (observação pessoal). O uso de células infectadas sem titulação e escala (TIPS), ou células de insetos infectadas por baculovírus (BIIC), fornece uma boa opção para a produção de AAV na qual as células Sf9 infectadas pelo baculovírus são preparadas, criopreservadas e posteriormente usadas para infecção de células Sf9 frescas. Outra vantagem é o aumento da estabilidade do baculovírus (BV) em células Sf9 após criopreservação10,11.
Dois tipos de células TIPS são geradas para permitir a produção de AAV: a primeira por infecção de células Sf9 com o gene BV-AAV2-GFP ou terapêutico, e a segunda por infecção de célulaS Sf9 com BV-AAV2-rep-cap. As células TIPS são criopreservadas em alíquotas pequenas e prontas para uso. Os vetores AAV são produzidos na cultura de suspensão sem soro em um frasco colocado em um shaker orbital ou bioreator de ondas por células TIPS co-culminando que produzem baculovírus e células Sf9 frescas. As células Sf9 são infectadas por baculovírus que carregam o vetor AAV2-GFP e as sequências de recapina para gerar AAV. Quatro a cinco dias depois, quando os rendimentos do AAV são os mais altos, as células produtoras são lísculas com detergente para liberar as partículas AAV. O liseto celular é posteriormente esclarecido por centrifugação e filtração de baixa velocidade. As partículas de AAV são purificadas do lysate pela cromatografia da coluna AVB Sepharose. Finalmente, os vetores AAV estão concentrados usando TFF. O protocolo descreve a produção de AAV em pequena escala, útil para pesquisas e estudos pré-clínicos. No entanto, os métodos são escaláveis e compatíveis com a fabricação de vetores AAV de grau clínico para aplicações de terapia genética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os parâmetros utilizados neste protocolo para o desenvolvimento de processos de produção, purificação e concentração de vetores AAV podem ser aplicados tanto na fabricação de pequenos e em larga escala de vetores AAV para aplicações de terapia genética. Todo o processo upstream e downstream pode ser realizado em um sistema fechado compatível com as práticas atuais de boa fabricação (cGMP). As principais vantagens do sistema Sf9-baculovirus são a escalabilidade para a produção de AAV de série GMP em la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) por nos fornecer generosamente os plasmídeos AAV e Danielle Steele e Rebecca Ernst (Hospital Infantil de Cincinnati) por sua assistência técnica. Este trabalho é apoiado pelo fundo Start-Up da Cincinnati Children’s Research Foundation para o M.N.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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