Baculovirus-Insect Hücre Kültürü Sistemi Kullanılarak Adeno-İlişkili Virüsün (AAV)2 Vektörün Üretimi ve Saflaştırılması için Süreç Geliştirme
Summary
Bu protokolde AAV2 vektörü, süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-yeşil floresan protein (GFP) veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap enfekte Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla üretilmektedir. AAV parçacıkları deterjan kullanılarak hücrelerden salınır, netleştirilir, benzeşim kolonu kromatografisi ile saflaştırılır ve teğetsel akış filtrasyonu ile konsantre edilir.
Abstract
Adeno ilişkili virüsler (AAV) gen tedavisi uygulamaları için umut verici vektörlerdir. Burada, AAV2 vektörü, serumsuz süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-GFP (veya terapötik gen) ve BV-AAV2-rep-cap ile enfekte olmuş Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) hücrelerinin ortak kültürü tarafından üretilir. Hücreler bir yörünge çalkalayıcı veya Dalga biyoreaktöründe bir şişede kültürlenir. AAV parçacıklarını serbest bırakmak için, üretici hücreler deterjan içeren tamponda lislenir ve daha sonra düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon ile netleştirilir. AAV parçacıkları, AAV parçacıklarını bağlayan AVB Sepharose sütun kromatografisi kullanılarak hücre lisattan arındırılır. Bağlı parçacıklar, kirleticileri gidermek için PBS ile yıkanır ve pH 3.0’da sodyum sitrat tamponu kullanılarak reçineden elde edilir. Asidik elüat alkali Tris-HCl tamponu (pH 8.0) ile nötralize edilir, fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir ve teğetsel akış filtrasyonu (TFF) ile daha da yoğunlaşır. Protokol, insan gen terapisi uygulamaları için büyük ölçekli klinik sınıf AAV üretimine kadar ölçekleme ile uyumlu küçük ölçekli klinik öncesi vektör üretimini tanımlamaktadır.
Introduction
Adeno ilişkili virüsler (AAV), 4,6 kb’lık tek iplikli DNA içeren zarfsız insan parvovirüsleridir. AAV vektörleri gen tedavisi uygulamaları için diğer viral vektörlere göre çeşitli avantajlara sahiptir1,2,3,4. AAV’ler doğal olarak çoğaltma yetersizdir, böylece çoğaltma için yardımcı bir virüs ve ana bilgisayar makineleri gerektirir. AAV’ler herhangi bir hastalığa neden olmaz ve enfekte konakta düşük immünojenikliğe sahiptir3,5. AAV hem sessiz hem de aktif olarak bölünen hücreleri enfekte edebilir ve konak hücrelerin genomuna entegre olmadan epizom olarak devam edebilir (AAV nadiren konak genomuna entegre olur)1,3. Bu özellikler AAV’ı gen tedavisi uygulamaları için arzu edilen bir araç haline getirmiştir.
Bir AAV gen transfer vektörü oluşturmak için, terapötik gen de dahil olmak üzere transgene kaseti, tipik olarak AAV serotip 2’den türetilen iki iç terminal tekrarı (ITR) arasında klonlanır. Transgene dizisi de dahil olmak üzere 5′ ITR’den 3′ ITR’ye kadar olan maksimum boyut 4,6 kb6 ‘dır. Farklı kapsidler farklı bir hücre veya doku tromizmine sahip olabilir. Bu nedenle, AAV vektörü ile hedef alınması amaçlanan doku veya hücre tipine göre kapsidler seçilmelidir7.
Rekombinant AAV vektörleri genellikle insan embriyonik böbrek hücreleri, HEK293 gibi memeli hücre hatlarında AAV gen transfer vektörü, AAV rep-cap ve yardımcı virüs plazmidleri2,3transeksiyon ile üretilir. Bununla birlikte, yapışan HEK293 hücrelerinin geçici transfeksiyon yoluyla büyük ölçekli AAV üretimi için çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, çok sayıda hücre yığınına veya makaralı şişeye ihtiyaç vardır. İkinci olarak, yüksek kaliteli plazmid DNA ve transfeksiyon reaktiflerine ihtiyaç vardır ve bu da üretim maliyetini arttırır. Son olarak, yapışık HEK293 hücreleri kullanılırken, serum sıklıkla en uygun üretim için gereklidir, aşağı akışişlemeyizorlaştırır 1,2,3. AAV üretiminin alternatif bir yöntemi, böcek hücre hattının, Spodoptera frugiperda (Sf9) hücrelerinin ve rekombinant Autographa californica multicapsid nükleer polihedroz virüsü (AcMNPV veya baculovirus) 8,9,10adı verilen bir böcek virüsünün kullanılmasını içerir. Sf9 hücreleri, ölçeğini büyütmesi kolay ve plazmid veya transfeksiyon reaktifleri gerektirmeyen büyük ölçekte mevcut iyi üretim uygulaması (cGMP) üretimiyle uyumlu serumsuz süspansiyon kültüründe yetiştirilir. Ayrıca, Sf9-baculovirüs sistemini kullanan AAV üretiminin maliyeti, plazmidlerin HEK293 hücrelerine geçici transfeksiyonunun kullanılması maliyetinden daha düşüktür11.
Baculovirus-Sf9 hücrelerinin kullanıldığı orijinal rAAV üretim sistemi üç baculovirüs kullandı: gen transfer kaseti içeren bir baculovirüs, rep geni içeren ikinci baculovirüs ve serotipe özgü kapsid geni içeren üçüncü baculovirüs12,13. Bununla birlikte, rep yapısı içeren baculovirüs, büyük ölçekli AAV üretimi için baculovirüsun amplifikasyonuna engel olan birden fazla geçiş turunda genetik olarak kararsızdı. Bu sorunu çözmek için, iki baculovirüs (TwoBac) içeren yeni bir rAAV vektör sistemi geliştirildi: AAV gen transfer kasetini içeren bir baculovirüs ve AAV rep-cap genlerini içeren başka bir baculovirüs, genetik olarak orijinal sistemden daha kararlı ve üç14yerine TwoBac kullandığı için rAAV üretmek için daha uygunolan , 15. OneBac sistemi, TwoBac veya ThreeBac 2,16,17kullanmak yerine bir baculovirüs kullanmak nedeniyle rAAV’ı üretmekiçin daha uygun olan tek bir baculovirüste AAV gen transfer kasetini ve rep-cap genlerini kullanır. Çalışmamızda, TwoBac sistemi optimizasyon için kullanılmıştır.
AAV üretimi için baculovirüs sisteminin de sınırlamaları vardır: baculovirüs parçacıkları serumsuz orta11’deuzun süreli depolama için kararsızdır ve baculovirüs titresi düşükse, AAV üretimi sırasında Sf9 hücrelerinin büyümesi için toksik hale gelebilecek büyük miktarda baculovirüs supernatant’a ihtiyaç vardır (kişisel gözlem). Titersiz enfekte hücre koruma ve ölçek büyütme (TIPS) hücrelerinin veya baculovirüs bulaşmış böcek hücrelerinin (BIIC) kullanılması, baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin hazırlandığı, kriyoprezervasyona edildiği ve daha sonra taze Sf9 hücrelerinin enfeksiyonu için kullanıldığı AAV üretimi için iyi bir seçenek sağlar. Bir diğer avantaj, kriyoprezervasyon10 , 11’densonra Sf9 hücrelerinde baculovirüs (BV)stabilitesininartmasıdır.
AAV üretimini sağlamak için iki tip TIPS hücresi üretilir: birincisi Sf9 hücrelerinin BV-AAV2-GFP veya terapötik gen ile enfeksiyonu ve ikincisi BV-AAV2-rep-cap ile Sf9 hücresinin enfeksiyonu ile. TIPS hücreleri küçük ve kullanıma hazır aliquotlarda kriyoprezot olarak saklanır. AAV vektörleri, baculovirüsler ve taze Sf9 hücreleri üreten TIPS hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla yörüngesel çalkalayıcıya veya Dalga biyoreaktörüne yerleştirilen bir şişede serumsuz süspansiyon kültüründe üretilir. Sf9 hücreleri, AAV2-GFP vektörünü taşıyan baculovirüsler ve AAV oluşturmak için rep-cap dizileri ile enfekte olur. Dört ila beş gün sonra, AAV verimi en yüksek olduğunda, üretici hücreler AAV parçacıklarını serbest bırakmak için deterjanla yutlanır. Hücre lysate daha sonra düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon ile netleştirilir. AAV parçacıkları AVB Sepharose kolon kromatografisi ile lysattan arındırılır. Son olarak, AAV vektörleri TFF kullanılarak yoğunlaşmıştır. Protokol, AAV’nin araştırma ve klinik öncesi çalışmalar için yararlı olan küçük ölçekte üretimini tanımlamaktadır. Bununla birlikte, yöntemler ölçeklenebilir ve gen tedavisi uygulamaları için klinik sınıf AAV vektörleri üretimi ile uyumludur.
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV vektörlerinin üretim, saflaştırma ve konsantrasyonunun proses geliştirilmesi için bu protokolde kullanılan parametreler, gen tedavisi uygulamaları için AAV vektörlerinin hem küçük hem de büyük ölçekli üretimine uygulanabilir. Tüm yukarı ve aşağı akış işlemi, mevcut İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) ile uyumlu kapalı bir sistemde gerçekleştirilebilir. Sf9-baculovirüs sisteminin en büyük avantajları, uygun maliyetle büyük ölçekli GMP sınıfı AAV üretimi için ölçeklenebilirlikt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Robert M. Kotin’e (Ulusal Kalp, Kan ve Akciğer Enstitüsü, NIH) bize cömertçe AAV plazmidlerini ve Danielle Steele ve Rebecca Ernst’e (Cincinnati Çocuk Hastanesi) teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı’ndan M.N.’ye start-up fonu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
Referências
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
