Prozessentwicklung zur Herstellung und Reinigung von Adeno-assoziiertem Virus (AAV)2 Vektor mit Baculovirus-Insekten-Zellkultursystem
Summary
In diesem Protokoll wird der AAV2-Vektor durch Co-Kultivierung von Spodoptera frugiperda (Sf9) Insektenzellen mit Baculovirus (BV)-AAV2-grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder therapeutischem Gen und BV-AAV2-rep-cap infizierten Sf9-Zellen in Suspensionskultur hergestellt. AAV-Partikel werden mittels Reinigungsmittel aus den Zellen freigesetzt, geklärt, durch Affinitätssäulenchromatographie gereinigt und durch tangentiale Strömungsfiltration konzentriert.
Abstract
Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind vielversprechende Vektoren für gentherapeutische Anwendungen. Hier wird der AAV2-Vektor durch Kokultur von Spodoptera frugiperda (Sf9)-Zellen mit Sf9-Zellen hergestellt, die mit Baculovirus (BV)-AAV2-GFP (oder therapeutischem Gen) und BV-AAV2-rep-cap in serumfreier Suspensionskultur infiziert sind. Zellen werden in einem Kolben in einem Orbitalschüttler oder Wave-Bioreaktor kultiviert. Um die AAV-Partikel freizusetzen, werden die Produzentenzellen in einen reinigungsmittelhaltigen Puffer lysiert, der anschließend durch Zentrifugation und Filtration mit niedriger Geschwindigkeit geklärt wird. AAV-Partikel werden aus dem Zelllysat mit hilfe der AVB Sepharose-Säulenchromatographie gereinigt, die AAV-Partikel bindet. Gebundene Partikel werden mit PBS gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und mit Natriumcitratpuffer bei pH 3,0 aus dem Harz eluiert. Das saure Eluat wird mit alkalischem Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) neutralisiert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und mit tangentialer Strömungsfiltration (TFF) weiter konzentriert. Das Protokoll beschreibt die kleinmaßstäbliche präklinische Vektorproduktion, die mit der Scale-up- bis zur groß angelegten AAV-Herstellung in klinischer Qualität für humane Gentherapieanwendungen kompatibel ist.
Introduction
Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind unbehüllte humane Parvoviren, die eine einzelsträngige DNA von 4,6 kb enthalten. AAV-Vektoren haben mehrere Vorteile gegenüber anderen viralen Vektoren für Gentherapieanwendungen1,2,3,4. AAVs sind von Natur aus replikationsinkompetent und benötigen daher einen Hilfsvirus und eine Host-Maschinerie für die Replikation. AAVs verursachen keine Krankheit und haben eine geringe Immunogenität im infizierten Wirt3,5. AAV kann sowohl ruhende als auch sich aktiv teilende Zellen infizieren und kann als Episom bestehen bleiben, ohne sich in das Genom der Wirtszellen zu integrieren (AAV integriert sich selten in das Wirtsgenom)1,3. Diese Eigenschaften haben AAV zu einem wünschenswerten Werkzeug für Gentherapieanwendungen gemacht.
Um einen AAV-Gentransfervektor zu erzeugen, wird die Transgenkassette einschließlich des therapeutischen Gens zwischen zwei internen terminalen Wiederholungen (ITRs) kloniert, die typischerweise vom AAV-Serotyp 2 abgeleitet sind. Die maximale Größe von 5′ ITR bis 3′ ITR, einschließlich der Transgensequenz, beträgt 4,6 kb6. Verschiedene Kapside können einen unterschiedlichen Zell- oder Gewebetropismus haben. Daher sollten Kapside basierend auf dem Gewebe oder Zelltyp ausgewählt werden, der mit demAAV-Vektor 7anvisiert werden soll.
Rekombinante AAV-Vektoren werden üblicherweise in Säugetierzelllinien wie humanen embryonalen Nierenzellen, HEK293 durch vorübergehende Transfektion des AAV-Gentransfervektors, AAV-Rep-Cap und Helfervirusplasmiden2,3produziert. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen für die großflächige AAV-Produktion durch transiente Transfektion von adhärenten HEK293-Zellen. Zunächst wird eine große Anzahl von Zellstapeln oder Rollflaschen benötigt. Zweitens werden hochwertige Plasmid-DNA und Transfektionsreagenzien benötigt, was die Herstellungskosten erhöht. Schließlich wird bei der Verwendung von adhärenten HEK293-Zellen das Serum häufig für eine optimale Produktion benötigt, was die nachgelagerte Verarbeitungerschwert 1,2,3. Eine alternative Methode der AAV-Herstellung beinhaltet die Verwendung der Insektenzelllinie, Spodoptera frugiperda (Sf9) -Zellen und eines Insektenvirus namens rekombinantes Autographa californica Multicapsid-Kernpolyedrosevirus (AcMNPV oder Baculovirus)8,9,10. Sf9-Zellen werden in serumfreier Suspensionskultur gezüchtet, die leicht zu skalieren ist und mit der aktuellen cGMP-Produktion (Good Manufacturing Practice) in großem Maßstab kompatibel ist, die keine Plasmid- oder Transfektionsreagenzien erfordert. Darüber hinaus sind die Kosten für die AAV-Produktion unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Systems niedriger als die Kosten für die vorübergehende Transfektion von Plasmiden in HEK293-Zellen11.
Das ursprüngliche rAAV-Produktionssystem unter Verwendung von Baculovirus-Sf9-Zellen verwendete drei Baculoviren: eine Baculovirus-haltige Gentransferkassette, das zweite Baculovirus-haltiges Rep-Gen und das dritte Baculovirus, das Serotyp-spezifisches Kapsid-Gen12,13. Das Baculovirus-haltige Rep-Konstrukt war jedoch bei mehreren Passagengängen genetisch instabil, was eine Amplifikation des Baculovirus für die großflächige AAV-Produktion verhinderte. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein neuartiges rAAV-Vektorsystem entwickelt, das zwei Baculoviren (TwoBac) enthielt: ein Baculovirus, das die AAV-Gentransferkassette enthielt, und ein anderes Baculovirus, das die AAV-Rep-Cap-Gene zusammen enthält, die genetisch stabiler sind als das ursprüngliche System und bequemer zu produzieren rAAV, da TwoBac anstelle von drei14verwendet wird. 15. Das OneBac-System verwendet die AAV-Gentransferkassette und die Rep-Cap-Gene in einem einzigen Baculovirus, das aufgrund der Verwendung eines Baculovirus anstelle von TwoBac oder ThreeBac 2,16 ,17bequemerist,um das rAAV herzustellen. In unserer Studie wurde das TwoBac-System zur Optimierung eingesetzt.
Das Baculovirus-System für die AAV-Produktion hat auch Einschränkungen: Baculovirus-Partikel sind instabil für die Langzeitlagerung in serumfreiem Medium11, und wenn der Baculovirus-Titer niedrig ist, wird eine große Menge an Baculovirus-Überstand benötigt, der für das Wachstum von Sf9-Zellen während der AAV-Produktion toxisch werden kann (persönliche Beobachtung). Die Verwendung von TITERLOSEN INFIZIERTEN ZELLKONSERVIERUNGS- UND SCALE-UP-ZELLEN (TIPS) oder Baculovirus-infizierten Insektenzellen (BIIC) bietet eine gute Option für die AAV-Produktion, bei der Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen vorbereitet, kryokonserviert und anschließend für die Infektion von frischen Sf9-Zellen verwendet werden. Ein weiterer Vorteil ist die erhöhte Stabilität des Baculovirus (BV) in Sf9-Zellen nach Kryokonservierung10,11.
Zwei Arten von TIPS-Zellen werden erzeugt, um die AAV-Produktion zu ermöglichen: die erste durch Infektion von Sf9-Zellen mit dem BV-AAV2-GFP oder therapeutischen Gen und die zweite durch Infektion von Sf9-Zellen mit BV-AAV2-rep-cap. TIPS-Zellen werden in kleinen und gebrauchsfertigen Aliquots kryokonserviert. AAV-Vektoren werden in serumfreier Suspensionskultur in einem Kolben hergestellt, der in einem Orbitalschüttler oder Wave-Bioreaktor platziert wird, indem TIPS-Zellen, die Baculoviren und frische Sf9-Zellen produzieren, mitkulturiert werden. Sf9-Zellen sind mit Baculoviren infiziert, die den AAV2-GFP-Vektor und die Rep-Cap-Sequenzen tragen, um AAV zu erzeugen. Vier bis fünf Tage später, wenn die AAV-Ausbeute am höchsten ist, werden die Produzentenzellen mit Reinigungsmittel lysiert, um die AAV-Partikel freizusetzen. Das Zelllysat wird anschließend durch Zentrifugation und Filtration mit niedriger Geschwindigkeit geklärt. AAV-Partikel werden durch AVB-Sepharose-Säulenchromatographie aus dem Lysat gereinigt. Schließlich werden AAV-Vektoren mit TFF konzentriert. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von AAV in kleinem Maßstab, nützlich für Forschung und präklinische Studien. Die Methoden sind jedoch skalierbar und kompatibel mit der Herstellung klinischer AAV-Vektoren für Gentherapieanwendungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Parameter, die in diesem Protokoll für die Prozessentwicklung der Produktion, Reinigung und Konzentration von AAV-Vektoren verwendet werden, können sowohl auf die Herstellung von AAV-Vektoren im kleinen als auch auf den großen Maßstab für Gentherapieanwendungen angewendet werden. Der gesamte vor- und nachgelagerte Prozess kann in einem geschlossenen System durchgeführt werden, das mit den aktuellen Good Manufacturing Practices (cGMP) kompatibel ist. Die Hauptvorteile des Sf9-Baculovirus-Systems sind die Skalier…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) für die großzügige Bereitstellung der AAV-Plasmide und Danielle Steele und Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch den Start-Up-Fonds der Cincinnati Children’s Research Foundation an M.N.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
Referências
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