В этом протоколе вектор AAV2 продуцируется путем совместного культивирования клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf9) с бакуловирусом (BV)-AAV2-зеленым флуоресцентным белком (GFP) или терапевтическим геном и инфицированными BV-AAV2-rep-cap клетками Sf9 в культуре суспензии. Частицы AAV высвобождаются из клеток с помощью моющего средства, осветляются, очищаются с помощью аффинной колоночной хроматографии и концентрируются методом тангенциальной фильтрации потока.
Аденоассоциированные вирусы (AAV) являются перспективными векторами для применения генной терапии. Здесь вектор AAV2 продуцируется совместной культурой клеток Spodoptera frugiperda (Sf9) с клетками Sf9, инфицированными бакуловирусом (BV)-AAV2-GFP (или терапевтическим геном) и BV-AAV2-rep-cap в культуре суспензии без сыворотки. Клетки культивируются в колбе в орбитальном шейкере или волновом биореакторе. Для высвобождения частиц AAV клетки-продуценты лизируют в буфере, содержащем моющее средство, которое впоследствии осветляется низкоскоростным центрифугированием и фильтрацией. Частицы AAV очищают из лизата клеток с помощью колоночной хроматографии AVB Sepharose, которая связывает частицы AAV. Связанные частицы промывают PBS для удаления загрязняющих веществ и элюируют из смолы с использованием буфера цитрата натрия при рН 3,0. Кислый элюат нейтрализуют щелочным буфером Tris-HCl (pH 8,0), разбавляют фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) и дополнительно концентрируют тангенциальной фильтрацией потока (TFF). Протокол описывает мелкомасштабное доклиническое производство векторов, совместимое с масштабированием до крупномасштабного клинического производства AAV для применения генной терапии человека.
Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой парвовирусы человека без оболочки, содержащие одноцепочечную ДНК размером 4,6 кб. Векторы AAV имеют ряд преимуществ перед другими вирусными векторами для применения генной терапии1,2,3,4. AAV, естественно, некомпетентны к репликации, поэтому требуются вирус-помощник и хост-механизм для репликации. ААВС не вызывают никаких заболеваний и обладают низкой иммуногенностью у инфицированного хозяина3,5. AAV может инфицировать как покоящиеся, так и активно делящиеся клетки и может сохраняться в виде эписомы без интеграции в геном клеток-хозяев (AAV редко интегрируются в геном хозяина)1,3. Эти особенности сделали AAV желательным инструментом для применения в генной терапии.
Для генерации вектора переноса генов AAV трансгенная кассета, включая терапевтический ген, клонируется между двумя внутренними концевыми повторами (ITR), которые обычно получены из серотипа AAV 2. Максимальный размер от 5′ ITR до 3′ ITR, включая трансгенную последовательность, составляет 4,6 кб6. Разные капсиды могут иметь разный клеточный или тканевый тропизм. Поэтому капсиды следует выбирать на основе типа ткани или клетки, предназначенной для нацеливания с помощью вектора AAV7.
Рекомбинантные векторы AAV обычно продуцируются в клеточных линиях млекопитающих, таких как эмбриональные клетки почек человека, HEK293 путем транзиторной трансфекции вектора переноса генов AAV, AAV rep-cap и плазмид вируса-хелпера2,3. Тем не менее, существует несколько ограничений для крупномасштабного производства AAV путем переходной трансфекции адгезивных клеток HEK293. Во-первых, необходимо большое количество ячеек или роликовых бутылок. Во-вторых, необходимы высококачественные плазмидные ДНК и трансфекционные реагенты, что увеличивает стоимость изготовления. Наконец, при использовании адгезивных клеток HEK293 сыворотка часто необходима для оптимального производства, что усложняет последующую обработку1,2,3. Альтернативный метод производства AAV включает в себя использование клеточной линии насекомых, клеток Spodoptera frugiperda (Sf9) и вируса насекомых, называемого рекомбинантным Autographa californica multicapsid ядерным полигедрозом (AcMNPV или бакуловирус)8,9,10. Клетки Sf9 выращиваются в культуре суспензии без сыворотки, которая легко масштабируется и совместима с текущей надлежащей производственной практикой (cGMP) производства в больших масштабах, которая не требует плазмидных или трансфекционных реагентов. Более того, стоимость производства AAV с использованием системы Sf9-бакуловируса ниже, чем стоимость использования транзиторной трансфекции плазмид в клетки HEK29311.
Оригинальная система производства rAAV с использованием клеток бакуловируса-Sf9 использовала три бакуловируса: один бакуловирус, содержащий кассету переноса генов, второй бакуловирус, содержащий ген реп, и третий бакуловирус, содержащий серотип-специфический капсидный ген12,13. Тем не менее, структура бакуловируса, содержащая реп, была генетически нестабильной при множественных раундах проходов, что предотвращало усиление бакуловируса для крупномасштабного производства AAV. Чтобы решить эту проблему, была разработана новая векторная система rAAV, которая содержала два бакуловируса (TwoBac): один бакуловирус, содержащий кассету переноса генов AAV, и другой бакуловирус, содержащий гены AAV rep-cap вместе, которые генетически более стабильны, чем исходная система, и более удобны для производства rAAV из-за использования TwoBac вместо трех14, 15г. Система OneBac использует кассету переноса генов AAV и гены rep-cap в одном бакуловирусе, который более удобен для производства rAAV из-за использования одного бакуловируса вместо использования TwoBac или ThreeBac2,16,17. В нашем исследовании для оптимизации использовалась система TwoBac.
Система бакуловируса для производства AAV также имеет ограничения: частицы бакуловируса нестабильны для длительного хранения в безсыворочной среде11,а если титр бакуловируса низкий, необходим большой объем супернатанта бакуловируса, который может стать токсичным для роста клеток Sf9 во время производства AAV (личное наблюдение). Использование клеток сохранения и масштабирования инфицированных клеток без титров (TIPS) или инфицированных бакуловирусом насекомых (BIIC) обеспечивает хороший вариант для производства AAV, в котором клетки Sf9, инфицированные бакуловирусом, подготавливаются, криоконсервируются и впоследствии используются для заражения свежих клеток Sf9. Еще одним преимуществом является повышенная стабильность бакуловируса (БВ) в клетках Sf9 после криоконсервации10,11.
Для обеспечения производства AAV генерируются два типа клеток TIPS: первый путем заражения клеток Sf9 BV-AAV2-GFP или терапевтическим геном, а второй – путем заражения клетки Sf9 BV-AAV2-rep-cap. Клетки TIPS криоконсервируются в небольших и готовых к использованию аликвотах. Векторы AAV получают в культуре суспензии без сыворотки в колбе, помещенной в орбитальный шейкер или волновой биореактор путем совместного культивирования клеток TIPS, которые продуцируют бакуловирусы и свежие клетки Sf9. Клетки Sf9 инфицированы бакуловирусами, которые несут вектор AAV2-GFP и последовательности rep-cap для генерации AAV. Четыре-пять дней спустя, когда выход AAV самый высокий, клетки-продуценты лизируются моющим средством для высвобождения частиц AAV. Клеточный лизат впоследствии осветляют низкоскоростным центрифугированием и фильтрацией. Частицы AAV очищаются из лизата с помощью колоночной хроматографии AVB Sepharose. Наконец, векторы AAV концентрируются с использованием TFF. Протокол описывает производство AAV в небольших масштабах, полезных для исследований и доклинических исследований. Тем не менее, методы являются масштабируемыми и совместимыми с производством клинических векторов AAV для применения генной терапии.
Параметры, используемые в этом протоколе для разработки процесса производства, очистки и концентрации векторов AAV, могут быть применены как к мелкому, так и к крупномасштабному производству векторов AAV для применения в генной терапии. Весь процесс добычи и переработки может быть выполн…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить доктора Роберта М. Котина (Национальный институт сердца, крови и легких, NIH) за щедрое предоставление нам плазмид AAV и Даниэль Стил и Ребекки Эрнст (Детская больница Цинциннати) за их техническую помощь. Эта работа поддерживается фондом Start-Up от Cincinnati Children’s Research Foundation до M.N.
1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |