Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto
Summary
En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.
Abstract
Los virus adenoasociados (AAV) son vectores prometedores para aplicaciones de terapia génica. Aquí, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de Spodoptera frugiperda (Sf9) con células Sf9 infectadas con baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y BV-AAV2-rep-cap en cultivo de suspensión sin suero. Las células se cultivan en un matraz en un agitador orbital o biorreactor de onda. Para liberar las partículas AAV, las células productoras se lisan en tampón que contiene detergente, que posteriormente se clarifica mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas AAV se purifican a partir del lisado celular mediante cromatografía de columna AVB Sepharose, que se une a las partículas AAV. Las partículas unidas se lavan con PBS para eliminar los contaminantes y se eluyen de la resina utilizando tampón de citrato de sodio a pH 3.0. El eluido ácido se neutraliza con tampón alcalino Tris-HCl (pH 8.0), se diluye con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se concentra aún más con filtración de flujo tangencial (TFF). El protocolo describe la producción de vectores preclínicos a pequeña escala compatible con la ampliación a la fabricación de AAV de grado clínico a gran escala para aplicaciones de terapia génica humana.
Introduction
Los virus adenoasociados (AAV) son parvovirus humanos no envueltos que contienen un ADN monocatenario de 4,6 kb. Los vectores AAV tienen varias ventajas sobre otros vectores virales para aplicaciones de terapiagénica 1,2,3,4. Los AAV son naturalmente incompetentes para la replicación, por lo tanto, requieren un virus ayudante y una maquinaria huésped para la replicación. Los AAV no causan ninguna enfermedad y tienen baja inmunogenicidad en el huésped infectado3,5. El AAV puede infectar tanto a las células inactivas como a las que se dividen activamente y puede persistir como episoma sin integrarse en el genoma de las células huésped (los AAV rara vez se integran en el genoma del huésped)1,3. Estas características han hecho de AAV una herramienta deseable para aplicaciones de terapia génica.
Para generar un vector de transferencia de genes AAV, el casete transgénico, incluido el gen terapéutico, se clona entre dos repeticiones terminales internas (ITR), que generalmente se derivan del serotipo AAV 2. El tamaño máximo de 5′ ITR a 3′ ITR, incluyendo la secuencia transgénica, es de 4,6 kb6. Diferentes cápsides pueden tener un tropismo celular o tisular diferente. Por lo tanto, las cápsides deben elegirse en función del tipo de tejido o célula que se pretende atacar con el vector AAV7.
Los vectores AAV recombinantes se producen comúnmente en líneas celulares de mamíferos como las células renales embrionarias humanas, HEK293 por transfección transitoria del vector de transferencia del gen AAV, AAV rep-cap y plásmidos de virus auxiliares2,3. Sin embargo, existen varias limitaciones para la producción de AAV a gran escala mediante la transfección transitoria de células HEK293 adherentes. Primero, se necesita una gran cantidad de pilas de celdas o botellas de rodillos. En segundo lugar, se necesitan ADN plásmido de alta calidad y reactivos de transfección, lo que aumenta el costo de fabricación. Finalmente, cuando se utilizan células ADHERENTES HEK293, el suero se necesita con frecuencia para una producción óptima, lo que complica el procesamiento posterior1,2,3. Un método alternativo de fabricación de AAV implica el uso de la línea celular de insectos, células de Spodoptera frugiperda (Sf9) y un virus de insecto llamado autografia californica multicápside recombinante virus de poliedrosis nuclear (AcMNPV o baculovirus)8,9,10. Las células Sf9 se cultivan en un cultivo de suspensión sin suero que es fácil de escalar y es compatible con la producción actual de buenas prácticas de fabricación (cGMP) a gran escala, que no requiere plásmidos ni reactivos de transfección. Además, el costo de la producción de AAV utilizando el sistema Sf9-baculovirus es menor que el costo de usar la transfección transitoria de plásmidos en células HEK29311.
El sistema original de producción de rAAV utilizando células baculovirus-Sf9 utilizó tres baculovirus: un baculovirus que contiene casete de transferencia de genes, el segundo baculovirus que contiene el gen rep y el tercer baculovirus que contiene el gen de la cápside específico del serotipo12,13. Sin embargo, el baculovirus que contenía la construcción de rep era genéticamente inestable en múltiples rondas de pasajes, lo que impedía la amplificación del baculovirus para la producción de AAV a gran escala. Para resolver este problema, se desarrolló un nuevo sistema vectorial rAAV, que contenía dos baculovirus (TwoBac): un baculovirus que contiene el cassette de transferencia del gen AAV y otro baculovirus que contiene los genes AAV rep-cap juntos que son genéticamente más estables que el sistema original y más convenientes para producir rAAV debido al uso de TwoBac en lugar de tres14, 15. El sistema OneBac utiliza el casete de transferencia de genes AAV y los genes rep-cap en un solo baculovirus que es más conveniente para producir el rAAV debido al uso de un baculovirus en lugar de usar TwoBac o ThreeBac2,16,17. En nuestro estudio, se utilizó el sistema TwoBac para la optimización.
El sistema de baculovirus para la producción de AAV también tiene limitaciones: las partículas de baculovirus son inestables para el almacenamiento a largo plazo en medio libre de suero11, y si el título de baculovirus es bajo, se necesita un gran volumen de sobrenadante de baculovirus, que puede volverse tóxico para el crecimiento de las células Sf9 durante la producción de AAV (observación personal). El uso de células de preservación y ampliación de células infectadas sin título (TIPS), o células de insectos infectadas por baculovirus (BIIC), proporciona una buena opción para la producción de AAV en la que las células Sf9 infectadas por baculovirus se preparan, criopreservan y posteriormente se utilizan para la infección de células Sf9 frescas. Otra ventaja es el aumento de la estabilidad del baculovirus (VB) en las células Sf9 después de la criopreservación10,11.
Se generan dos tipos de células TIPS para permitir la producción de AAV: la primera por infección de células Sf9 con el gen BV-AAV2-GFP o terapéutico, y la segunda por infección de células Sf9 con BV-AAV2-rep-cap. Las células TIPS se criopreservan en alícuotas pequeñas y listas para usar. Los vectores AAV se producen en cultivo de suspensión sin suero en un matraz colocado en un agitador orbital o biorreactor de onda mediante el cultivo conjunto de células TIPS que producen baculovirus y células Sf9 frescas. Las células Sf9 están infectadas por baculovirus que transportan el vector AAV2-GFP y las secuencias rep-cap para generar AAV. Cuatro o cinco días después, cuando los rendimientos de AAV son los más altos, las células productoras se lisan con detergente para liberar las partículas de AAV. El lisado celular se clarifica posteriormente mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas de AAV se purifican a partir del lisado mediante cromatografía en columna AVB Sepharose. Finalmente, los vectores AAV se concentran utilizando TFF. El protocolo describe la producción de AAV a pequeña escala, útil para la investigación y los estudios preclínicos. Sin embargo, los métodos son escalables y compatibles con la fabricación de vectores AAV de grado clínico para aplicaciones de terapia génica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los parámetros utilizados en este protocolo para el desarrollo del proceso de producción, purificación y concentración de vectores AAV se pueden aplicar tanto a la fabricación a pequeña como a gran escala de vectores AAV para aplicaciones de terapia génica. Todo el proceso ascendente y descendente se puede realizar en un sistema cerrado compatible con las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP) actuales. Las principales ventajas del sistema Sf9-baculovirus son la escalabilidad para la producción de AAV de grado …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Robert M. Kotin (Instituto Nacional del Corazón, la Sangre y los Pulmones, NIH) por proporcionarnos generosamente los plásmidos AAV y a Danielle Steele y Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) por su asistencia técnica. Este trabajo es apoyado por el fondo Start-Up de Cincinnati Children’s Research Foundation a M.N.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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