تصميم وتطوير نموذج لدراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم مجرى الهواء التليف الكيسي
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير نظام نموذجي لتأثير فرط الأكسجين على المجتمعات الميكروبية التليف الكيسي مجرى الهواء. المتوسط البلغم الاصطناعي يحاكي تكوين البلغم، وظروف زراعة فرط الأكسجين نموذج آثار الأكسجين التكميلي على المجتمعات الميكروبية الرئة.
Abstract
ويعتقد أن المجتمعات الميكروبية مجرى الهواء تلعب دورا هاما في تطور التليف الكيسي (CF) وغيرها من الأمراض الرئوية المزمنة. وقد تم تصنيف الميكروبات تقليديا على أساس قدرتها على استخدام الأكسجين أو تحمله. الأكسجين التكميلي هو العلاج الطبي المشترك تدار للأشخاص الذين يعانون من التليف الكيسي (pwCF); ومع ذلك ، ركزت الدراسات القائمة على الأكسجين والميكروبيوم مجرى الهواء على كيفية نقص الأكسيجة (انخفاض الأكسجين) بدلا من فرط الأكسجين (الأكسجين العالي) يؤثر على المجتمعات الميكروبية الرئة الهوائية والكلية في الغالب. ولمعالجة هذه الفجوة المعرفية الحرجة، تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام وسيط البلغم الاصطناعي الذي يحاكي تكوين البلغم من pwCF. استخدام تعقيم المرشحات، الذي ينتج وسيلة شفافة، يسمح للطرق البصرية لمتابعة نمو الميكروبات وحيدة الخلية في ثقافات التعليق. لخلق ظروف فرط الأكسجين، يستفيد هذا النظام النموذجي من تقنيات الاستزراع اللاهوائي الراسخة لدراسة الظروف المفرطة الأكسجين. بدلا من إزالة الأكسجين، يضاف الأكسجين إلى الثقافات عن طريق التجنيب اليومي من زجاجات المصل مع خليط من الأكسجين المضغوط والهواء. خضع البلغم من 50 pwCF التجنيب اليومي لفترة 72 ساعة للتحقق من قدرة هذا النموذج للحفاظ على ظروف الأكسجين التفاضلية. تم إجراء تسلسل بندقية metagenomic على عينات البلغم المستزرعة وغير المستزرعة من 11 pwCF للتحقق من قدرة هذه الوسيلة على دعم نمو الميكروبات كومينسال ومسببات الأمراض الموجودة عادة في البلغم التليف الكيسي. تم الحصول على منحنيات النمو من 112 عزلة تم الحصول عليها من pwCF للتحقق من قدرة هذا المتوسط البلغم الاصطناعي لدعم نمو مسببات الأمراض التليف الكيسي المشتركة. نجد أن هذا النموذج يمكن أن ثقافة مجموعة واسعة من مسببات الأمراض وcommensals في البلغم CF، يستعيد مجتمع مشابهة إلى حد كبير إلى البلغم غير المستزرعة في ظل ظروف normoxic، ويخلق الأنماط الظاهرية ثقافة مختلفة في ظل ظروف الأكسجين متفاوتة. وقد يؤدي هذا النهج الجديد إلى فهم أفضل للآثار غير المتوقعة الناجمة عن استخدام الأكسجين في البيو سي إف على المجتمعات الميكروبية في مجرى الهواء ومسببات الأمراض التنفسية الشائعة.
Introduction
التليف الكيسي (CF) هو مرض وراثي يتميز بعدم القدرة على إزالة المخاط السميك من الرئتين ، مما يؤدي إلى التهابات متكررة وانخفاض وظائف الرئة التدريجي الذي يؤدي في كثير من الأحيان إلى الحاجة إلى زرع الرئة أو الوفاة. الميكروبيوم مجرى الهواء من الناس مع التليف الكيسي (pwCF) ويبدو أن تتبع نشاط المرض1, مع انخفاض في التنوع الميكروبي المرتبطة النتائج السلبية على المدى الطويل2,3. في الدراسات السريرية من pwCF, وقد ارتبط العلاج بالأوكسجين التكميلي مع مرض أكثر تقدما 4,5, علىالرغممن تقليديا, وقد ينظر إلى استخدام العلاج بالأوكسجين باعتباره مجرد علامة لشدة المرض6. وقد أظهرت الدراسات الحديثة من التجارب السريرية للمرضى الذين يعانون من فشل في الجهاز التنفسي أن ارتفاع مستويات الأكسجين المريض ترتبط بشكل متناقض مع زيادة في الالتهابات البكتيرية الخطيرة وارتفاع معدل الوفيات7, مما يشير إلى أن الأكسجين التكميلي قد تسهم في مرض الإمراض. لم يتم دراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم الرئة التليف الكيسي والمجتمعات الميكروبية الرئة والمجرى الهوائي المرتبطة بها بشكل جيد.
غالبا ما لا يمكن إجراء الدراسات الميكانيكية مباشرة على البشر بسبب الصعوبات اللوجستية والقضايا الأخلاقية المحتملة المرتبطة بالتدخلات ذات الفائدة الطبية غير المعروفة أو الضرر. ويمكن للنهج التحويلية التي تدمج البكبيمنات البيولوجية البشرية في النظم النموذجية أن تقدم رؤى بيولوجية هامة في هذه الحالات. في حين أن القدرة على استخدام الأكسجين أو تحمله كانت تقليديا مكونا مهما في التصنيف الميكروبي ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن كيفية إدخال الأكسجين التكميلي العلاجي إلى البيئة قد يؤدي إلى اضطراب المجتمعات الميكروبية في مجرى الهواء. لإلقاء الضوء على الآثار غير المعروفة للأوكسجين التكميلي على ميكروبيومات مجرى الهواء من pwCF، كنا بحاجة إلى معالجة اثنين من التحديات الرئيسية؛ أولا ، إنشاء وسيط الثقافة التي تقارب من الناحية الفسيولوجية تكوين البلغم CF ؛ ثانيا، إنشاء نظام نموذجي يسمح بالحفاظ على تركيزات الأكسجين المرتفعة في الثقافة على مدى فترات طويلة من الزمن.
وتستخدم وسائل الإعلام البلغم الاصطناعي (ASM) على نطاق واسع لمحاكاة الرئة البلغم ex vivo8,9,10, ولكن ليس هناك توافق واضح في الآراء على وصفة محددة. يصف هذا البروتوكول وصفة متوسطة البلغم الاصطناعي واستراتيجية إعداد مصممة بعناية لتقريب البلغم من الناحية الفسيولوجية من pwCF. يحدد الجدول 1 قيم الوصفة المختارة استنادا إلى الأدبيات المنشورة. تمت مطابقة المكونات الكيميائية الأساسية وhh للقيم التي حددتها دراسات البلغم CF البشري11،12،13. أضيفت العناصر الغذائية الفسيولوجية منخفضة التركيز باستخدام صفار البيض، والتي تم تضمينها على أنها 0.25٪ من المجلد النهائي10، وكذلك فيتامين وتتبع يمزج المعدن14،15. تم تضمين موسين ، المكون الرئيسي للسبغم16، في 1 ٪ ث / الخامس14. على الرغم من أن أكثر كثافة العمالة، تم اختيار تعقيم مرشح على الممارسة التقليدية أكثر من التعقيم الحراري للحد من المشاكل المحتملة من التشبع الناجم عن الحرارة من مكونات وسائل الإعلام الأساسية10. فائدة إضافية من تعقيم التصفية هو أنه يولد وسائل الإعلام التي هي شفافة (التعقيم الحراري يمكن أن تخلق وسائل الإعلام العكر بسبب هطول الأمطار وتخثر الأملاح والبروتينات)، مما يسمح لهذا الوسائط البلغم الاصطناعي لاستخدامها لمتابعة النمو الميكروبي على أساس الزيادات في العكر.
ويستند هذا النظام النموذجي لثقافة hyperoxic على تقنيات زراعة اللاهوائية حيث يتم إضافة الأكسجين بدلا من إزالتها، وخلق نموذج لتأثير استخدام الأكسجين التكميلي لpwCF. ويبين الشكل 1 وبروتوكول تجنيب الأكسجين المرتبط به مكونات نظام تجنيب الأكسجين، الذي يمكن الحصول عليه بتكلفة منخفضة من موردي المختبرات العامة والمستشفيات. هذا النظام يتيح خلط الأكسجين المضغوط والهواء لتركيزات ثابتة تتراوح بين 21٪ -100٪ الأكسجين. يسمح دمج مستشعر الأكسجين بالتحقق من تركيز خليط غاز الإنتاج ، بالإضافة إلى التحقق من تكوين غاز التدفق الخارجي زجاجات المصل التي تم تجنيبها سابقا للتحقق من الحفاظ على ظروف الأكسجين ضمن النطاق المطلوب.
يحدد هذا البروتوكول الإجراءات لإنشاء وسيط البلغم الاصطناعي ، وبناء واستخدام نظام تجنيب الأكسجين ، وتطبيق كليهما على زراعة البلغم CF في ظل ظروف الأكسجين التفاضلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، تم تطوير نموذج في المختبر لدراسة تأثير فرط الأكسجين على المجتمعات الميكروبية الرئة. هذا النموذج، استنادا إلى البلغم الاصطناعي المتوسطة ويومية تجنيب زجاجات المصل، ويحافظ على تركيزات الأكسجين مرتفعة ويدعم نمو الميكروبات المحددة في البلغم من pwCF.
وهناك ع…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تنفيذ جزء من هذا العمل في المختبر البيولوجي البحري بدعم من المختبر البيولوجي البحري، وزارة البيئة (DE-SC0016127)، NSF (MCB1822263)، HHMI (رقم المنحة 5600373)، وهدية من مؤسسة سيمونز.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
Referências
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model – An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , (2010).
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicina. 96 (47), 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta’omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
