Conception et développement d’un modèle pour étudier l’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome des voies respiratoires de la fibrose kystique
Summary
L’objectif de ce protocole est de développer un système modèle pour l’effet de l’hyperoxie sur les communautés microbiennes des voies respiratoires de la fibrose kystique. Le milieu d’expectorations artificielles émule la composition des expectorations, et les conditions de culture hyperoxique modélisent les effets de l’oxygène supplémentaire sur les communautés microbiennes pulmonaires.
Abstract
On pense que les communautés microbiennes des voies respiratoires jouent un rôle important dans la progression de la fibrose kystique (FK) et d’autres maladies pulmonaires chroniques. Les microbes ont traditionnellement été classés en fonction de leur capacité à utiliser ou à tolérer l’oxygène. L’oxygène supplémentaire est un traitement médical courant administré aux personnes atteintes de fibrose kystique (PWF); cependant, les études existantes sur l’oxygène et le microbiome des voies respiratoires se sont concentrées sur la façon dont l’hypoxie (faible teneur en oxygène) plutôt que l’hyperoxie (oxygène élevé) affecte les communautés microbiennes pulmonaires anaérobies principalement aérobies et facultatives. Pour combler cette lacune critique en matière de connaissances, ce protocole a été élaboré à l’aide d’un milieu d’expectorations artificielles qui imite la composition des expectorations du PWCF. L’utilisation de la stérilisation par filtre, qui donne un milieu transparent, permet des méthodes optiques pour suivre la croissance de microbes unicellulaires dans des cultures en suspension. Pour créer des conditions hyperoxiques, ce système modèle tire parti des techniques de culture anaérobie établies pour étudier les conditions hyperoxiques; au lieu d’éliminer l’oxygène, l’oxygène est ajouté aux cultures par barbotage quotidien de bouteilles de sérum avec un mélange d’oxygène comprimé et d’air. Les expectorations de 50 pwCF ont subi un éparpillement quotidien pendant une période de 72 heures pour vérifier la capacité de ce modèle à maintenir des conditions d’oxygène différentielles. Le séquençage métagénomique shotgun a été effectué sur des échantillons d’expectorations cultivées et non cultivées de 11 pwCF afin de vérifier la capacité de ce milieu à soutenir la croissance des microbes commensaux et pathogènes couramment présents dans les expectorations de la fibrose kystique. Des courbes de croissance ont été obtenues à partir de 112 isolats obtenus à partir de pwCF pour vérifier la capacité de ce milieu d’expectorations artificielles à soutenir la croissance d’agents pathogènes courants de la fibrose kystique. Nous constatons que ce modèle peut cultiver une grande variété d’agents pathogènes et de commensaux dans les expectorations de FK, récupère une communauté très similaire aux expectorations non cultivées dans des conditions normoxiques et crée différents phénotypes de culture dans des conditions d’oxygène variables. Cette nouvelle approche pourrait permettre de mieux comprendre les effets imprévus induits par l’utilisation de l’oxygène dans le PWCF sur les communautés microbiennes des voies respiratoires et les agents pathogènes respiratoires courants.
Introduction
La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique caractérisée par une incapacité à éliminer le mucus épais des poumons, entraînant des infections répétées et un déclin progressif de la fonction pulmonaire qui entraîne souvent la nécessité d’une transplantation pulmonaire ou de la mort. Le microbiome des voies respiratoires des personnes atteintes de mucoviscidose (FCP) semble suivre l’activité de la maladie1, avec une réduction de la diversité microbienne associée à des résultats indésirables à long terme2,3. Dans les études cliniques de la PWF, l’oxygénothérapie supplémentaire a été associée à une maladie plus avancée4,5, bien que traditionnellement, l’utilisation de l’oxygénothérapie ait été considérée comme un simple marqueur de la gravité de la maladie6. Des études récentes issues d’un essai clinique sur des patients atteints d’insuffisance respiratoire ont montré que des niveaux d’oxygène plus élevés sont paradoxalement associés à une augmentation des infections bactériennes graves et à une mortalité plus élevée7,ce qui suggère que l’oxygène supplémentaire peut contribuer à la pathogenèse de la maladie. L’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome pulmonaire de la fibrose kystique et les communautés microbiennes pulmonaires et des voies respiratoires associées n’a pas été bien étudié.
Les études mécanistes ne peuvent souvent pas être effectuées directement sur des sujets humains en raison de difficultés logistiques et de problèmes éthiques potentiels associés à des interventions d’avantages ou de préjudices médicaux inconnus. Les approches translationnelles qui intègrent des échantillons biologiques humains dans des systèmes modèles peuvent offrir des informations biologiques importantes dans ces cas. Bien que la capacité d’utiliser ou de tolérer l’oxygène ait traditionnellement été un élément important de la classification microbienne, on sait peu de choses sur la façon dont l’introduction thérapeutique d’oxygène supplémentaire dans l’environnement pourrait perturber les communautés microbiennes des voies respiratoires. Pour faire la lumière sur les effets inconnus de l’oxygène supplémentaire sur les microbiomes des voies respiratoires du PWCF, nous devions relever deux défis majeurs; premièrement, la création d’un milieu de culture qui se rapproche physiologiquement de la composition des expectorations de la FK; deuxièmement, la création d’un système modèle qui permet le maintien de concentrations élevées d’oxygène en culture sur de longues périodes de temps.
Les milieux d’expectorations artificielles (ASM) sont largement utilisés pour émuler les expectorations pulmonaires ex vivo8,9,10, mais il n’y a pas de consensus clair sur une recette spécifique. Ce protocole décrit une recette et une stratégie de préparation de milieu d’expectorations artificielles soigneusement conçues pour se rapprocher physiologiquement des expectorations de pwCF. Le tableau 1 présente les valeurs de recette choisies en fonction de la littérature publiée. Les composants chimiques de base et le pH ont été appariés aux valeurs identifiées par les études sur les expectorations humaines de FK11,12,13. Des nutriments physiologiques à faible concentration ont été ajoutés à l’aide de jaune d’œuf, qui a été inclus comme 0,25% du volume final10, ainsi que des mélanges de vitamines et de métaux traces14,15. La mucine, le composant clé des expectorations16,a été incluse à 1% p/v14. Bien que nécessitant plus de main-d’œuvre, la stérilisation par filtre a été choisie par rapport à la pratique plus conventionnelle de la stérilisation thermique pour réduire les problèmes potentiels liés à la dénaturation induite par la chaleur des composants essentiels des milieux10. Un avantage supplémentaire de la stérilisation par filtre est qu’elle génère des milieux transparents (la stérilisation thermique peut créer des milieux troubles en raison de la précipitation et de la coagulation des sels et des protéines), ce qui permet d’utiliser ces milieux d’expectorations artificiels pour suivre la croissance microbienne en fonction de l’augmentation de la turbidité.
Ce système modèle pour la culture hyperoxique est basé sur des techniques de culture anaérobie où l’oxygène est ajouté plutôt que retiré, créant un modèle pour l’effet de l’utilisation supplémentaire d’oxygène pour pwCF. La figure 1 et le protocole d’épargnance en oxygène qui y est associé décrivent les composants d’un système de lutte contre l’oxygène, qui peut être obtenu à faible coût auprès des fournisseurs généraux de laboratoires et d’hôpitaux. Ce système permet de mélanger de l’oxygène comprimé et de l’air à des concentrations fixes allant de 21% à 100% d’oxygène. L’intégration d’un capteur d’oxygène permet de vérifier la concentration du mélange de gaz de sortie, ainsi que de vérifier la composition du gaz sortant des bouteilles de sérum préalablement épargnées pour vérifier que les conditions d’oxygène ont été maintenues dans la plage souhaitée.
Ce protocole décrit les procédures pour créer un milieu d’expectorations artificielles, la construction et l’utilisation d’un système de stockage d’oxygène et l’application des deux pour cultiver des expectorations de FIBRO dans des conditions d’oxygène différentiel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, un modèle in vitro a été développé pour étudier l’effet de l’hyperoxie sur les communautés microbiennes pulmonaires. Ce modèle, basé sur des expectorations artificielles et le stockage quotidien de flacons de sérum, maintient des concentrations élevées d’oxygène et favorise la croissance des microbes identifiés dans les expectorations du PWCF.
Cette approche comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est le choix d’utiliser la stérilisat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Une partie de ce travail a été réalisée au Laboratoire de biologie marine avec le soutien du Laboratoire de biologie marine, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (numéro de subvention 5600373), et un don de la Fondation Simons.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
Referências
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