낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발
Summary
이 프로토콜의 목표는 낭포성 섬유증 기도 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 위한 모형 시스템을 개발하는 것입니다. 인공 가래 배지는 가래의 조성을 모방하고, 과옥배양 조건은 폐 미생물 공동체에 대한 보충 산소의 효과를 모델링한다.
Abstract
기도 미생물 지역 사회는 낭포성 섬유증 (CF) 및 그밖 만성 폐 질병의 진행에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 생각됩니다. 미생물은 전통적으로 산소를 사용하거나 용인하는 능력에 따라 분류되었습니다. 보충 산소는 낭포성 섬유증을 가진 사람들에게 투여되는 일반적인 의학 치료입니다 (pwCF); 그러나, 산소와 기도 미생물군유전체에 대한 기존 연구는 아옥시아(high oxygen)가 아닌 저산소증(저산소)이 주로 호기성 및 촉진성 혐기성 폐 미생물 공동체에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞추고 있다. 이러한 중요한 지식 격차를 해결하기 위해 이 프로토콜은 pwCF의 가래 구성을 모방한 인공 가래 매체를 사용하여 개발되었습니다. 투명 배지를 산출하는 필터 살균을 사용하면 광학 방법이 서스펜션 배양에서 단세포 미생물의 성장을 따를 수 있습니다. 과산화 조건을 만들기 위해,이 모델 시스템은 hyperoxic 조건을 연구하기 위해 설립 혐기성 배양 기술을 활용; 산소를 제거하는 대신, 산소는 압축 산소와 공기의 혼합물과 혈청 병의 매일 스파깅에 의해 배양에 추가됩니다. 50 pwCF에서 가래는 차동 산소 조건을 유지하기 위해이 모델의 능력을 확인하기 위해 72-h 기간 동안 매일 스파깅을 겪었다. 산탄총 메타게놈 시퀀싱은 11 pwCF로부터 배양 및 비배양식 가래 샘플에서 수행되어 낭포성 섬유증 가래에서 흔히 발견되는 발생성 및 병원성 미생물의 성장을 지원하는 이 매체의 능력을 검증하였다. 성장 곡선은 일반적인 낭포성 섬유증 병원균의 성장을 지원하기 위해 이러한 인공 가래 배지의 능력을 확인하기 위해 pwCF로부터 얻은 112개의 분리물로부터 수득되었다. 우리는 이 모형이 CF 가래에 있는 병원균 및 교근의 다양한 문화가, normoxic 조건하에서 비배양되지 않은 가래와 매우 유사한 지역 사회를 복구하고, 다양한 산소 조건하에서 다른 문화 표현형을 창조할 수 있다는 것을 것을을 발견합니다. 이 새로운 접근은 기도 미생물 지역 사회와 일반적인 호흡 병원체에 pwCF에 있는 산소의 사용에 의해 유도된 예기치 않은 효력의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.
Introduction
낭포성 섬유증 (CF)은 폐에서 두꺼운 점액을 지우지 못하는 것을 특징으로하는 유전 질환으로, 반복되는 감염과 종종 폐 이식 또는 사망의 필요성을 초래하는 진보적 인 폐 기능 감소로 이어진다. 낭포성 섬유증(pwCF)을 가진 사람들의 기도 미생물군유전체는 질병 활동1을추적하는 것으로 나타났으며, 불리한 장기 결과2,3과관련된 미생물 다양성의 감소와 함께. pwCF의 임상 연구에서, 보충 산소 요법은 보다 진보된 질병4,5와연관되어 있다, 그러나 전통적으로, 산소 치료의 사용은 단순히 질병 심각도6에대한 마커로 간주되었습니다. 호흡기 부전 환자의 임상 시험에서 최근 연구는 높은 환자 산소 수준이 역설적으로 심각한 세균 감염의 증가와 관련된 것으로 나타났습니다7,보충 산소가 질병 병인에 기여할 수 있음을 시사. 낭포성 섬유증 폐 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과와 관련 폐 및 기도 미생물 공동체는 잘 연구되지 않았습니다.
기계학 연구는 종종 물류 어려움과 알 수없는 의료 혜택 이나 해의 개입과 관련된 잠재적 인 윤리적 문제로 인해 인간의 주제에 직접 수행 할 수 없습니다. 인간 바이오시편을 모델 시스템에 통합하는 번역 적 접근 법은 이러한 경우에 중요한 생물학적 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 산소를 사용하거나 용인하는 능력은 전통적으로 미생물 분류의 중요한 구성 요소였지만, 환경에 보충 산소의 치료 도입이 어떻게 기도 미생물 공동체를 방해할 수 있는지에 대해서는 거의 알려져 하지 않습니다. pwCF의 기도 미생물군유전체에 보충 산소의 알 수없는 효과에 빛을 비추기 위해, 우리는 두 가지 주요 과제를 해결해야했습니다. 첫째, CF 가래의 조성을 생리적으로 근사화하는 배양 배지의 생성; 둘째, 장기간 배양시 높은 산소 농도의 유지를 허용하는 모델 시스템의 생성.
인공 가래 매체(ASM)는 폐 가래 를모방하는 데 널리사용되며,9,10,특정 레시피에 대한 명확한 합의는 없다. 이 프로토콜은 pwCF에서 생리학적으로 대략적인 가래를 위해 신중하게 설계된 인공 가래 매체 레시피 및 준비 전략을 설명합니다. 표 1은 게시된 문헌을 기반으로 선택한 레시피 값을 간략하게 설명합니다. 기본 화학 성분 및 pH는 인간 CF 가래11,12,13의연구에 의해 확인된값과일치시켰다. 저농도 생리영양분은최종부10의0.25%로 포함된 달걀 노른자를 사용하였으며, 비타민및미량금속믹스(14,15)를첨가하였다. 가래16의핵심 성분인 Mucin은 1%w/v14로포함되었다. 더 많은 노동 집약적이지만, 필터 살균은 필수 미디어 성분의 열 유도 데마튜레이션으로부터 잠재적인 문제를 줄이기 위해 열 살균의 전통적인 관행을 통해선택되었다(10). 필터 살균의 또 다른 이점은 투명한 매체를 생성한다는 것입니다 (열 살균은 소금과 단백질의 강수량 및 응고로 인해 탁구 미디어를 만들 수 있습니다), 이 인공 가래 매체는 탁도의 증가에 따라 미생물 성장을 따르는 데 사용할 수 있도록.
과옥배양을 위한 이 모델 시스템은 산소가 제거되지 않고 첨가되는 혐기성 배양 기술을 기반으로 pwCF에 대한 산소 보충 사용의 효과를 위한 모델을 생성한다. 도 1 및 관련 산소 스파깅 프로토콜은 일반 실험실 및 병원 공급 업체로부터 저렴한 비용으로 얻을 수있는 산소 스파징 시스템의 구성 요소를 간략하게 설명합니다. 이 시스템은 압축 산소와 공기를 21%-100% 산소에 이르는 고정 농도로 혼합할 수 있게 합니다. 산소 센서의 통합을 통해 출력 가스 혼합물의 농도를 검증할 수 있을 뿐만 아니라 이전에 분리된 혈청 병의 유출 가스 조성을 확인하여 산소 조건이 원하는 범위 내에서 유지되었는지 확인할 수 있습니다.
이 프로토콜은 인공 가래 매체를 만드는 절차를 간략하게 설명하고, 산소 스파깅 시스템의 구성 및 사용, 및 차동 산소 조건하에서 배양 CF 가래에 둘 다의 적용을 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는, 체외 모형은 폐 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 연구하기 위하여 개발되었습니다. 이 모델은 인공 가래 매체와 혈청 병의 일일 스파깅을 기반으로 산소 농도가 상승하여 pwCF에서 가래로 확인된 미생물의 성장을 지원합니다.
이 방법의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 인공 가래 매체의 열 살균보다는 필터 살균을 사용하는 선택입니다. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업의 일부는 해양 생물 연구소, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (보조금 번호 5600373), 사이먼스 재단의 선물의 지원을 받아 해양 생물 연구소에서 수행되었습니다.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
Referências
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model – An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , (2010).
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicina. 96 (47), 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta’omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
