מטרת פרוטוקול זה היא לפתח מערכת מודל להשפעת היפרוקסיה על קהילות המיקרואורגניזמים של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה. מדיום כיח מלאכותי מחקה את הרכב הכיח, ותנאי התרבות ההיפרוקסית מדגימים את ההשפעות של חמצן משלים על קהילות מיקרוביות ריאות.
קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה נחשבות לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות של סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלות ריאות כרוניות אחרות. חיידקים סווגו באופן מסורתי על סמך יכולתם להשתמש או לסבול חמצן. חמצן משלים הוא טיפול רפואי נפוץ שניתן לאנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF); עם זאת, מחקרים קיימים על חמצן ועל המיקרוביום דרכי הנשימה התמקדו באופן שבו היפוקסיה (חמצן נמוך) ולא היפרוקסיה (חמצן גבוה) משפיעה על קהילות מיקרוביות הריאות האירוביות והפקולטיביות בעיקר. כדי לטפל בפער ידע קריטי זה, פרוטוקול זה פותח באמצעות מדיום כיח מלאכותי המחקה את הרכב הליחה מ- pwCF. השימוש בעיקור מסננים, המניב מדיום שקוף, מאפשר לשיטות אופטיות לעקוב אחר הצמיחה של חיידקים חד-תאיים בתרביות השעיה. כדי ליצור תנאים היפרוקסיים, מערכת מודל זו מנצלת טכניקות פולחן אנאירובי מבוססות כדי ללמוד תנאים היפרוקסיים; במקום להסיר חמצן, חמצן מתווסף לתרבויות על ידי התכתות יומית של בקבוקי סרום עם תערובת של חמצן דחוס ואוויר. כיח מ 50 pwCF עבר סטרינג יומי לתקופה של 72 שעות כדי לאמת את היכולת של מודל זה לשמור על תנאי חמצן דיפרנציאליים. רצף מטגנומי רובה ציד בוצע על דגימות כיח מתורבתות ולא תרבותיות מ 11 pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום זה כדי לתמוך בצמיחה של חיידקים קומנסליים ופתוגניים הנפוצים בליח סיסטיק פיברוזיס. עקומות גדילה התקבלו מ 112 מבודדים שהתקבלו מ- pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום כיח מלאכותי זה לתמוך בצמיחה של פתוגנים סיסטיק פיברוזיס נפוצים. אנו מוצאים כי מודל זה יכול תרבות מגוון רחב של פתוגנים ו commensals כיח CF, משחזר קהילה דומה מאוד כיח לא תרבותי בתנאים נורמוקסיים, ויוצר פנוטיפים תרבות שונים בתנאי חמצן שונים. גישה חדשה זו עשויה להוביל להבנה טובה יותר של השפעות בלתי צפויות הנגרמות על ידי שימוש בחמצן ב- pwCF על קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה ופתוגנים נשימתיים נפוצים.
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית המאופיינת בחוסר יכולת לנקות ריר סמיך מהריאות, מה שמוביל לזיהומים חוזרים ונשנים ולירידה בתפקוד הריאות המתקדמת, שלעתים קרובות גורמת לצורך בהשתלת ריאות או למוות. המיקרוביום דרכי הנשימה של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF) נראהלעקובאחר פעילות המחלה 1 , עם ירידה במגוון מיקרוביאלי הקשורים לתוצאות שליליות לטווח ארוך2,3. במחקרים קליניים של pwCF, טיפול בחמצן משלים קושר למחלה מתקדמת יותר4,5, אם כי באופן מסורתי, השימוש בטיפול בחמצן נתפס פשוט כסמן לחומרת המחלה6. מחקרים אחרונים מניסוי קליני של חולים עם כשל נשימתי הראו כי רמות חמצן גבוהות יותר של המטופל קשורות באופן פרדוקסלי לעלייה בזיהומים חיידקיים חמורים ותמותה גבוהה יותר7, דבר המצביע על כך שחמצן משלים עשוי לתרום לפתוגנזה של המחלה. ההשפעה של חמצן משלים על מיקרוביום הריאות סיסטיק פיברוזיס וקהילות מיקרוביות הקשורות לריאות ודמתי הנשימה לא נחקרה היטב.
לעתים קרובות לא ניתן לבצע מחקרים מכניים ישירות בנושאים אנושיים בשל קשיים לוגיסטיים וסוגיות אתיות פוטנציאליות הקשורות להתערבויות של תועלת רפואית לא ידועה או נזק. גישות תרגומיות המשלבות ביו-פיסצימנים אנושיים במערכות מודל יכולות להציע תובנות ביולוגיות חשובות במקרים אלה. בעוד היכולת להשתמש או לסבול חמצן היה באופן מסורתי מרכיב חשוב של סיווג מיקרוביאלי, מעט מאוד ידוע על איך הקדמה טיפולית של חמצן משלים לסביבה עלולה להרגיז קהילות מיקרוביות דרכי הנשימה. כדי לשפוך אור על ההשפעות הלא ידועות של חמצן משלים על המיקרוביום דרכי הנשימה של pwCF, היינו צריכים להתמודד עם שני אתגרים עיקריים; ראשית, יצירת מדיום תרבותי המהוער מבחינה פיזיולוגית את הרכב כיח CF; שנית, יצירת מערכת מודל המאפשרת שמירה על ריכוזי חמצן גבוהים בתרבות על פני פרקי זמן ממושכים.
מדיה כיח מלאכותי (ASM) נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות כיח ריאות ex vivo8,9,10, אבל אין קונצנזוס ברור על מתכון מסוים. פרוטוקול זה מתאר מתכון בינוני כיח מלאכותי ואסטרטגיית הכנה שתוכננה בקפידה כדי לתבח פיזיולוגית מ- pwCF. טבלה 1 מתארת את ערכי המתכון הנבחרים בהתבסס על ספרות שפורסמה. רכיבים כימיים בסיסיים ו- pH הותאמו לערכים שזוהו על ידי מחקרים של כיח CF אנושי11,12,13. חומרים מזינים פיזיולוגיים בריכוז נמוך נוספו באמצעות חלמון ביצה, אשר נכלל כמו 0.25% של נפח סופי10, כמו גם ויטמין ומתכת קורט מתערבב14,15. Mucin, המרכיב העיקרי של כיח16,נכלל ב 1% w / v14. למרות שעיקור מסנן אינטנסיבי יותר נבחר על פני הנוהג הקונבנציונלי יותר של עיקור חום כדי להפחית בעיות פוטנציאליות מפני denaturation הנגרמת על ידי חום של רכיבי מדיה חיוניים10. יתרון נוסף של עיקור מסנן הוא שהוא מייצר מדיה שקופה (עיקור חום יכול ליצור מדיה עכורה עקב משקעים ו קרישה של מלחים וחלבונים), ומאפשר מדיה כיח מלאכותי זה לשמש כדי לעקוב אחר צמיחה מיקרוביאלית המבוססת על עליות עכורה.
מערכת מודל זו לתרבות ההיפרוקסיקית מבוססת על טכניקות פולחן אנאירוביות שבהן מוסיפים חמצן ולא מוסרים, ויוצרים מודל להשפעת שימוש בחמצן משלים עבור pwCF. איור 1 ופרוטוקול התזת החמצן הנלווה מתארים את הרכיבים של מערכת שפיצוח חמצן, שניתן להשיג בעלות נמוכה מספקי מעבדה כלליים ומכלי בית חולים. מערכת זו מאפשרת ערבוב של חמצן דחוס ואוויר לריכוזים קבועים הנעים בין 21%-100% חמצן. השילוב של חיישן חמצן מאפשר אימות של ריכוז תערובת גז הפלט, כמו גם בדיקת הרכב גז הזרימה של בקבוקי סרום שהופצו בעבר כדי לוודא שתנאי החמצן נשמרו בטווח הרצוי.
פרוטוקול זה מתאר נהלים ליצירת מדיום כיח מלאכותי, בנייה ושימוש במערכת התזת חמצן, ויישום של שניהם על כיח CF תרבית בתנאי חמצן דיפרנציאליים.
במחקר זה פותח מודל במבחנה כדי לחקור את ההשפעה של היפרוקסיה על קהילות חיידקי ריאות. מודל זה, המבוסס על כיח מלאכותי בינוני ויומיומי של בקבוקי סרום, שומר על ריכוזי חמצן גבוהים ותומך בצמיחת חיידקים המזוהים בליחה מ- pwCF.
ישנם מספר שלבים קריטיים של גישה זו. הראשון הוא הבחירה לה?…
The authors have nothing to disclose.
חלק מעבודה זו בוצע במעבדה הביולוגית הימית בתמיכת המעבדה הביולוגית הימית, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (מספר מענק 5600373) ומתנה מקרן סימונס.
BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |