Projeto e Desenvolvimento de um Modelo para Estudar o Efeito do Oxigênio Suplementar no Microbioma da Fibrose Cística

Summary

O objetivo deste protocolo é desenvolver um sistema modelo para o efeito da hiperoxia nas comunidades microbianas da fibrose cística. O meio de escarro artificial emula a composição da escarro, e as condições de cultura hiperóxica modelam os efeitos do oxigênio suplementar nas comunidades microbianas pulmonares.

Abstract

Acredita-se que as comunidades microbianas das vias aéreas desempenham um papel importante na progressão da fibrose cística (CF) e outras doenças pulmonares crônicas. Micróbios têm sido tradicionalmente classificados com base em sua capacidade de usar ou tolerar oxigênio. O oxigênio suplementar é uma terapia médica comum administrada a pessoas com fibrose cística (pwCF); no entanto, estudos existentes sobre oxigênio e microbioma das vias aéreas têm se concentrado em como a hipóxia (baixo oxigênio) em vez de hiperoxia (alto oxigênio) afeta as comunidades microbianas pulmonares aeróbicas e facultativas predominantemente aeróbicas e facultativas. Para resolver essa lacuna de conhecimento crítico, este protocolo foi desenvolvido utilizando um meio de escarro artificial que imita a composição da escarro da pwCF. O uso da esterilização do filtro, que produz um meio transparente, permite que métodos ópticos acompanhem o crescimento de micróbios unicelulares em culturas de suspensão. Para criar condições hiperóxiicas, esse sistema modelo aproveita técnicas de cultivo anaeróbicas estabelecidas para estudar condições hiperóxiis; em vez de remover oxigênio, o oxigênio é adicionado às culturas por meio de uma mistura diária de garrafas de soro com uma mistura de oxigênio comprimido e ar. A sputum de 50 pwCF passou por uma sparging diária por um período de 72h para verificar a capacidade deste modelo de manter condições diferenciais de oxigênio. O sequenciamento metagenômico da espingarda foi realizado em amostras de escarro cultivadas e não cultivadas de 11 pwCF para verificar a capacidade deste meio de suportar o crescimento de micróbios commensais e patogênicos comumente encontrados em escarro de fibrose cística. As curvas de crescimento foram obtidas a partir de 112 isolados obtidos da PwCF para verificar a capacidade deste meio de escarro artificial para apoiar o crescimento de patógenos comuns de fibrose cística. Descobrimos que este modelo pode cultivar uma grande variedade de patógenos e commensais na escória CF, recupera uma comunidade altamente semelhante à escória não cultivada sob condições normóxias, e cria diferentes fenótipos de cultura em condições variadas de oxigênio. Essa nova abordagem pode levar a uma melhor compreensão dos efeitos imprevistos induzidos pelo uso de oxigênio em pwCF em comunidades microbianas das vias aéreas e patógenos respiratórios comuns.

Introduction

A fibrose cística (CF) é uma doença genética caracterizada pela incapacidade de limpar muco espesso dos pulmões, levando a infecções repetidas e declínio da função pulmonar progressiva que muitas vezes resulta na necessidade de transplante de pulmão ou morte. O microbioma das vias aéreas de pessoas com fibrose cística (pwCF) parece acompanhar a atividade da doença¹, com redução da diversidade microbiana associada a desfechos adversos a longo prazo^2,3. Em estudos clínicos da PWCF, a oxigenoterapia suplementar tem sido associada a uma doença mais avançada^4,5, embora tradicionalmente, o uso de oxigenoterapia tenha sido visto como simplesmente um marcador para a gravidade da doença⁶. Estudos recentes de um estudo clínico de pacientes com insuficiência respiratória mostraram que níveis mais altos de oxigênio do paciente estão paradoxalmente associados a um aumento de infecções bacterianas graves e maior mortalidade^7,sugerindo que o oxigênio suplementar pode contribuir para a patogênese da doença. O efeito do oxigênio suplementar no microbioma pulmonar da fibrose cística e nas comunidades microbianas pulmonares e aéreas associadas não tem sido bem estudado.

Estudos mecanicistas muitas vezes não podem ser realizados diretamente em seres humanos devido a dificuldades logísticas e potenciais questões éticas associadas a intervenções de benefício ou dano médico desconhecido. Abordagens translacionais que integram bioespégios humanos em sistemas de modelos podem oferecer importantes insights biológicos nesses casos. Embora a capacidade de usar ou tolerar oxigênio tenha sido tradicionalmente um componente importante da classificação microbiana, pouco se sabe sobre como a introdução terapêutica de oxigênio suplementar ao meio ambiente pode perturbar as comunidades microbianas das vias aéreas. Para lançar luz sobre os efeitos desconhecidos do oxigênio suplementar nos microbiomas das vias aéreas da PWCF, precisávamos enfrentar dois grandes desafios; primeiro, a criação de um meio de cultura que se aproxima fisiologicamente da composição do escarro CF; segundo, a criação de um sistema modelo que permita a manutenção de concentrações elevadas de oxigênio na cultura por longos períodos de tempo.

Asm (Artificial sputum media, mídia artificial) são amplamente utilizados para emular escarro pulmonar ex vivo^8,9,10, mas não há um consenso claro sobre uma receita específica. Este protocolo descreve uma receita média de escarro artificial e estratégia de preparação cuidadosamente projetada para se aproximar fisiologicamente da pwCF. A Tabela 1 descreve os valores da receita escolhida com base na literatura publicada. Componentes químicos básicos e pH foram combinados com valores identificados por estudos de espiato de CF humano^11,12,13. Foram adicionados nutrientes fisiológicos de baixa concentração utilizando-se gema de ovo, que foi incluída em 0,25% do volume final^10,bem como misturas de vitamina e metal trace^14,15. A mucina, o componente-chave da escarro^16,foi incluída em 1% c/v¹⁴. Embora mais trabalhosa, a esterilização do filtro foi escolhida sobre a prática mais convencional de esterilização térmica para reduzir problemas potenciais da desnaturação induzida pelo calor dos componentes essenciais da mídia¹⁰. Um benefício adicional da esterilização do filtro é que ele gera mídia transparente (a esterilização de calor pode criar mídia turva devido à precipitação e coagulação de sais e proteínas), permitindo que essa mídia artificial de escarro seja usada para acompanhar o crescimento microbiano com base no aumento da turbidez.

Este sistema modelo para a cultura hiperóxica é baseado em técnicas de cultivo anaeróbica onde o oxigênio é adicionado em vez de removido, criando um modelo para o efeito do uso de oxigênio suplementar para pwCF. A Figura 1 e o protocolo de sparging de oxigênio associados descrevem os componentes de um sistema de sparging de oxigênio, que pode ser obtido a baixo custo de fornecedores gerais de laboratórios e hospitais. Este sistema permite a mistura de oxigênio comprimido e ar para concentrações fixas que variam de 21%a 100% de oxigênio. A integração de um sensor de oxigênio permite a verificação da concentração da mistura de gás de saída, bem como verificar a composição do gás de saída de garrafas de soro previamente espaçadas para verificar se as condições de oxigênio foram mantidas dentro da faixa desejada.

Este protocolo descreve procedimentos para criar um meio de escarro artificial, a construção e o uso de um sistema de sparging de oxigênio, e a aplicação de ambos para cultura de escarro CF em condições diferenciais de oxigênio.

Protocol

Este estudo recebeu aprovação do Conselho de Revisão Institucional de Parceiros (Protocolo nº 2018P002934). O critério de inclusão incluiu pacientes adultos com fibrose cística que forneceram consentimento por escrito informado para o estudo. Não houve critério de exclusão. De acordo com as diretrizes do protocolo, todas as amostras de escarro foram coletadas de pacientes com fibrose cística durante uma visita ambulatorial agendada com seu provedor clínico. 1. Preparação média art…

Representative Results

Esses protocolos foram aplicados a 50 amostras de escarro esperados da PWCF apresentando cuidados de rotina para uma clínica de fibrose cística ambulatorial no Massachusetts General Hospital em Boston, Massachusetts. A escarro de cada paciente foi cultivada abaixo de 21%, 50% e 100% de oxigênio usando o meio de escarro artificial, com alíquotas de 0,5 mL tiradas de cada cultura às 24h, 48h e 72h de tempo de cultura para testes. As culturas foram fotografadas quando foram feitas extrações para acompanhar as mudanç…

Discussion

Neste estudo, desenvolveu-se um modelo in vitro para estudar o efeito da hiperoxia nas comunidades microbianas pulmonares. Este modelo, baseado na escarro artificial média e diária de garrafas de soro, mantém concentrações elevadas de oxigênio e suporta o crescimento de micróbios identificados em escarro da pwCF.

Há várias etapas críticas dessa abordagem. Primeiro é a escolha de usar a esterilização do filtro em vez da esterilização térmica do meio de escarro artificia…

Materials

BME Vitamins (100x) Solution	MilliporeSigma	B6891	Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021	Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion	HiMedia	FD045	Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen	MilliporeSigma	F7879	Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner	Integra Biosciences	144000	Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge	MilliporeSigma	20469	Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle	Becton Dickinson	309580	Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment	World Precision Instruments	14011	Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-346-15FM	Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution	MilliporeSigma	M5550	Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution	MilliporeSigma	M7145	Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor	MSA	814365	Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach	MilliporeSigma	M2378	Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit	Harvard Apparatus	72-1413	Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System	Illumina	770-2016-025-N	Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-540-15FM	Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors	SunMed	2001-01	Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer	Marshall Scientific	CO-PC420	Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride	MilliporeSigma	P9541	Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape	VWR	470042-938	Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge	MilliporeSigma	QGARD00D2	Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles	ThermoFisher Scientific	06-423A	Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set	Braun Medical	471960	Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride	MilliporeSigma	S3014	Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load)	ZymoBIOMICS	D6320	Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes	Professional Disposables International	H04082	Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank	Airgas	AI USP200	Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank	Airgas	OX USP200	Compressed oxygen tank for input to sparging system.