Ek Oksijenin Kistik Fibrozis Hava Yolu Mikrobiyomu Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Modelin Tasarımı ve Geliştirilmesi
Summary
Bu protokolün amacı hiperoksinin kistik fibrozis hava yolu mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisi için bir model sistemi geliştirmektir. Yapay balgam ortamı balgam bileşimine öykünür ve hiperoksik kültür koşulları ek oksijenin akciğer mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkilerini modeller.
Abstract
Hava yolu mikrobiyal topluluklarının kistik fibrozis (CF) ve diğer kronik pulmoner hastalıkların ilerlemesinde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Mikroplar geleneksel olarak oksijen kullanma veya tolere etme yeteneklerine göre sınıflandırılmıştır. Ek oksijen kistik fibrozis (pwCF) olan kişilere uygulanan yaygın bir tıbbi tedavidir; bununla birlikte, oksijen ve hava yolu mikrobiyomu üzerinde yapılan mevcut çalışmalar, hiperoksi (yüksek oksijen) yerine hipoksinin (düşük oksijen) ağırlıklı olarak aerobik ve öğretim üyesi anaerobik akciğer mikrobiyal topluluklarını nasıl etkilediğine odaklanmıştır. Bu kritik bilgi açığını gidermek için, bu protokol pwCF’den balgam bileşimini taklit eden yapay bir balgam ortamı kullanılarak geliştirilmiştir. Şeffaf bir ortam sağlayan filtre sterilizasyonunun kullanımı, optik yöntemlerin süspansiyon kültürlerinde tek hücreli mikropların büyümesini takip etmesini sağlar. Hiperoksik koşullar yaratmak için, bu model sistemi hiperoksik koşulları incelemek için yerleşik anaerobik kültleme tekniklerinden yararlanır; oksijeni çıkarmak yerine, serum şişelerinin sıkıştırılmış oksijen ve hava karışımı ile günlük olarak parçalanarak kültürlere oksijen eklenir. 50 pwCF’den balgam, bu modelin diferansiyel oksijen koşullarını koruma yeteneğini doğrulamak için 72-h süre boyunca günlük sparging geçirdi. Kistik fibrozis balgamında yaygın olarak bulunan kommensal ve patojenik mikropların büyümesini desteklemek için bu ortamın yeteneğini doğrulamak için 11 pwCF’den kültürlü ve kültürsüz balgam örneklerine av tüfeği metagenomik dizilemesi yapıldı. Bu yapay balgam ortamının yaygın kistik fibrozis patojenlerinin büyümesini destekleme yeteneğini doğrulamak için pwCF’den elde edilen 112 izolattan büyüme eğrileri elde edildi. Bu modelin CF balgamında çok çeşitli patojenleri ve kommensalları kültüre edebildiğini, normoksik koşullar altında kültürsüz balgama çok benzeyen bir topluluğu kurtardığını ve değişen oksijen koşullarında farklı kültür fenotipleri oluşturduğunu görüyoruz. Bu yeni yaklaşım, pwCF’de oksijen kullanımının hava yolu mikrobiyal toplulukları ve yaygın solunum yolu patojenleri üzerinde neden olduğu beklenmedik etkilerin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
Introduction
Kistik fibrozis (CF), akciğerlerden kalın mukusu temizleyememe ile karakterize genetik bir hastalıktır ve sıklıkla akciğer nakli veya ölüm ihtiyacı ile sonuçlanan tekrarlayan enfeksiyonlara ve ilerleyici akciğer fonksiyon düşüşüne yol açar. Kistik fibrozis (pwCF) olan kişilerin hava yolu mikrobiyomu hastalık aktivitesini izler1, olumsuz uzun vadeli sonuçlarla ilişkili mikrobiyal çeşitlilikte bir azalmaile 2,3. PwCF’nin klinik çalışmalarında, ek oksijen tedavisi daha ileri hastalık4,5ile ilişkilendirilmiştir , geleneksel olarak, oksijen tedavisinin kullanımı sadece hastalık şiddeti için bir belirteç olarak açılmıştır6. Solunum yetmezliği olan hastaların klinik çalışmalarından elde edilen son çalışmalar, daha yüksek hasta oksijen seviyelerinin paradoksal olarak ciddi bakteriyel enfeksiyonlardaki artış ve daha yüksek mortalite7ile ilişkili olduğunu göstermiştir Ek oksijenin hastalık patogenezine katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Ek oksijenin kistik fibrozis akciğer mikrobiyomu ve ilişkili akciğer ve hava yolu mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisi iyi incelenmemiştir.
Mekanistik çalışmalar genellikle lojistik zorluklar ve bilinmeyen tıbbi fayda veya zarar müdahaleleriyle ilişkili potansiyel etik sorunlar nedeniyle doğrudan insan denekler üzerinde yapılamamaktadır. İnsan biyospepsimenlerini model sistemlerine entegre eden çeviri yaklaşımları bu durumlarda önemli biyolojik içgörüler sunabilir. Oksijen kullanma veya tolere etme yeteneği geleneksel olarak mikrobiyal sınıflandırmanın önemli bir bileşeni olsa da, ek oksijenin çevreye terapötik olarak tanıtılmasının hava yolu mikrobiyal topluluklarını nasıl bozabileceği hakkında çok az şey bilinmektedir. Ek oksijenin pwCF’nin hava yolu mikrobiyomları üzerindeki bilinmeyen etkilerine ışık tutmak için iki büyük zorluğu ele almamız gerekiyordu; birincisi, fizyolojik olarak CF balgamının bileşimine yakın bir kültür ortamının oluşturulması; ikinci olarak, kültürdeki yüksek oksijen konsantrasyonlarının uzun süreler boyunca korunmasına izin veren bir model sisteminin oluşturulması.
Yapay balgam ortamı (ASM), akciğer balgam ex vivo8 , 9,10‘ u taklit etmek için yaygın olarak kullanılır, ancak belirli bir tarif üzerinde net bir fikir birliği yoktur. Bu protokol, pwCF’den fizyolojik olarak balgam hakkında dikkatlice tasarlanmış yapay bir balgam ortamı tarifi ve hazırlama stratejisini açıklar. Tablo 1, yayınlanan literatüre göre seçilen tarif değerlerini özetlemektedir. Temel kimyasal bileşenler ve pH, insan CF balgam11 , 12,13çalışmaları ile tanımlanan değerlerle eşleştirildi. Düşük konsantrasyonda fizyolojik besinler, son hacim10’un%0.25’i olarak dahil edilen yumurta sarısı kullanılarak eklenmiştir vitamin ve eser metal karışımları14,15. Balgam16’nınanahtar bileşeni olan Mucin, %1 w/v14‘te dahil edildi. Daha emek yoğun olmasına rağmen, temel ortam bileşenlerinin ısı kaynaklı denatürasyonundan kaynaklanan potansiyel sorunları azaltmak için daha geleneksel ısı sterilizasyonu uygulaması yerine filtre sterilizasyonu seçilmiştir10. Filtre sterilizasyonunun ek bir yararı, şeffaf ortamlar üretmesidir (ısı sterilizasyonu, tuzların ve proteinlerin yağması ve pıhtılaşması nedeniyle bulanık ortam oluşturabilir), bu yapay balgam ortamlarının bulanıklıktaki artışlara dayalı mikrobiyal büyümeyi takip etmek için kullanılmasına izin verir.
Hiperoksik kültür için bu model sistemi, pwCF için ek oksijen kullanımının etkisi için bir model oluşturarak oksijenin çıkarılması yerine eklendiği anaerobik kültleme tekniklerine dayanmaktadır. Şekil 1 ve ilgili oksijen sparging protokolü, genel laboratuvar ve hastane tedarikçilerinden düşük maliyetle elde edilebilen bir oksijen sıçrama sisteminin bileşenlerini özetlemektedir. Bu sistem basınçlı oksijen ve havanın %21-%100 oksijen arasında değişen sabit konsantrasyonlara karıştırılmasını sağlar. Bir oksijen sensörünün entegrasyonu, çıkış gazı karışımının konsantrasyonunun doğrulanmasının yanı sıra, oksijen koşullarının istenen aralıkta korunduğunu doğrulamak için daha önce sıçramış serum şişelerinin çıkış gazı bileşimini kontrol etmeyi sağlar.
Bu protokol, yapay bir balgam ortamı oluşturma prosedürlerini, bir oksijen sıçrama sisteminin inşasını ve kullanımını ve her ikisinin de diferansiyel oksijen koşulları altında kültür CF balgamının uygulanmasını özetlemektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada hiperoksinin akciğer mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisini incelemek için bir in vitro model geliştirilmiştir. Serum şişelerinin yapay balgam ortamına ve günlük spargingine dayanan bu model, yüksek oksijen konsantrasyonlarını korur ve pwCF’den balgamda tanımlanan mikropların büyümesini destekler.
Bu yaklaşımın birkaç kritik adımı vardır. Birincisi, yapay balgam ortamının ısı sterilizasyonu yerine filtre sterilizasyonu kullanma seçimi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın bir kısmı Deniz Biyolojik Laboratuvarı, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (hibe numarası 5600373) ve Simons Vakfı’nın hediyesi ile Deniz Biyolojik Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
Referências
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model – An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , (2010).
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicina. 96 (47), 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta’omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
