Målet med denne protokollen er å utvikle et modellsystem for effekten av hyperoksia på cystiske fibrose luftveismikrobielle samfunn. Kunstig sputummedium emulerer sammensetningen av sputum, og hyperoksiske kulturforhold modellerer effekten av supplerende oksygen på lungemikrobielle samfunn.
Luftveis mikrobielle samfunn antas å spille en viktig rolle i utviklingen av cystisk fibrose (CF) og andre kroniske lungesykdommer. Mikrober har tradisjonelt blitt klassifisert basert på deres evne til å bruke eller tolerere oksygen. Supplerende oksygen er en vanlig medisinsk terapi administrert til personer med cystisk fibrose (pwCF); Imidlertid har eksisterende studier på oksygen og luftveismikrobiomet fokusert på hvordan hypoksi (lavt oksygen) i stedet for hyperoksi (høyt oksygen) påvirker de overveiende aerobe og fakultets anaerobe lungemikrobielle samfunnene. For å løse dette kritiske kunnskapsgapet ble denne protokollen utviklet ved hjelp av et kunstig sputummedium som etterligner sammensetningen av sputum fra pwCF. Bruken av filtersterilisering, som gir et gjennomsiktig medium, gjør det mulig for optiske metoder å følge veksten av encellede mikrober i suspensjonskulturer. For å skape hyperoksiske forhold utnytter dette modellsystemet etablerte anaerobe kultiveringsteknikker for å studere hyperoksiske forhold; I stedet for å fjerne oksygen, tilsetter oksygen til kulturer ved daglig sparring av serumflasker med en blanding av trykkoksygen og luft. Sputum fra 50 pwCF gjennomgikk daglig sparring i en 72-timers periode for å verifisere denne modellens evne til å opprettholde differensialoksygenforhold. Hagle metagenomisk sekvensering ble utført på kultiverte og ukulturerte sputumprøver fra 11 pwCF for å verifisere dette mediets evne til å støtte veksten av kommensale og patogene mikrober som vanligvis finnes i cystisk fibrose sputum. Vekstkurver ble oppnådd fra 112 isolasjoner hentet fra pwCF for å verifisere evnen til dette kunstige sputummediet for å støtte veksten av vanlige cystiske fibrosepatogener. Vi finner at denne modellen kan dyrke et bredt utvalg av patogener og commensals i CF sputum, gjenoppretter et samfunn som ligner sterkt på ukulturert sputum under normoksiske forhold, og skaper forskjellige kulturfenotyper under varierende oksygenforhold. Denne nye tilnærmingen kan føre til en bedre forståelse av uforutsiktede effekter forårsaket av bruk av oksygen i pwCF på luftveis mikrobielle samfunn og vanlige respiratoriske patogener.
Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sykdom preget av manglende evne til å fjerne tykt slim fra lungene, noe som fører til gjentatte infeksjoner og progressiv lungefunksjonsnedgang som ofte resulterer i behovet for lungetransplantasjon eller død. Luftveismikrobiomet til personer med cystisk fibrose (pwCF) ser ut til å spore sykdomsaktivitet1, med en reduksjon i mikrobielt mangfold forbundet med ugunstige langsiktige resultater2,3. I kliniske studier av pwCF har supplerende oksygenbehandling vært forbundet med mer avansert sykdom4,5, men tradisjonelt har bruk av oksygenbehandling blitt sett på som bare en markør for sykdoms alvorlighetsgrad6. Nyere studier fra en klinisk studie av pasienter med luftveissvikt har vist at høyere oksygennivå hos pasienter paradoksalt nok er forbundet med en økning i alvorlige bakterielle infeksjoner og høyere dødelighet7, noe som tyder på at supplerende oksygen kan bidra til sykdomspatogenese. Effekten av supplerende oksygen på cystisk fibrose lungemikrobiom og tilhørende lunge- og luftveismikrobielle samfunn er ikke godt studert.
Mekanistiske studier kan ofte ikke utføres direkte på mennesker på grunn av logistiske vanskeligheter og potensielle etiske problemer knyttet til intervensjoner av ukjent medisinsk nytte eller skade. Translasjonelle tilnærminger som integrerer menneskelige biospecimens i modellsystemer, kan gi viktig biologisk innsikt i disse tilfellene. Mens evnen til å bruke eller tolerere oksygen tradisjonelt har vært en viktig komponent i mikrobiell klassifisering, er det lite kjent om hvordan den terapeutiske innføringen av supplerende oksygen til miljøet kan perturb luftveis mikrobielle samfunn. For å belyse de ukjente effektene av supplerende oksygen på luftveismikrobiomene til pwCF, måtte vi ta opp to store utfordringer; for det første, opprettelsen av et kulturmedium som fysiologisk tilnærmer sammensetningen av CF sputum; For det andre, opprettelsen av et modellsystem som tillater vedlikehold av forhøyede oksygenkonsentrasjoner i kulturen over lengre perioder.
Kunstige sputummedier (ASM) er mye brukt til å etterligne lunge sputum ex vivo8,9,10, men det er ingen klar konsensus om en bestemt oppskrift. Denne protokollen beskriver en kunstig sputum medium oppskrift og forberedelse strategi nøye designet for fysiologisk omtrentlig sputum fra pwCF. Tabell 1 skisserer de valgte oppskriftsverdiene basert på publisert litteratur. Grunnleggende kjemiske komponenter og pH ble matchet med verdier identifisert av studier av human CF sputum11,12,13. Lav konsentrasjon fysiologiske næringsstoffer ble tilsatt ved hjelp av eggeplomme, som ble inkludert som 0,25% av det endelige volumet10, samt vitamin- og spormetallblandinger14,15. Mucin, nøkkelkomponenten i sputum16, ble inkludert ved 1% m/ v14. Selv om det var mer arbeidskrevende, ble filtersterilisering valgt over den mer konvensjonelle praksisen med varmesterilisering for å redusere potensielle problemer fra varmeindusert denaturering av essensielle mediekomponenter10. En ekstra fordel med filtersterilisering er at den genererer medier som er gjennomsiktige (varmesterilisering kan skape uklare medier på grunn av nedbør og koagulasjon av salter og proteiner), slik at dette kunstige sputummediet kan brukes til å følge mikrobiell vekst basert på økning i turbiditet.
Dette modellsystemet for den hyperoksiske kulturen er basert på anaerobe kultiveringsteknikker der oksygen tilsetts i stedet for å fjernes, og skaper en modell for effekten av supplerende oksygenbruk for pwCF. Figur 1 og den tilhørende oksygensparingsprotokollen skisserer komponentene i et oksygensparingssystem, som kan oppnås til lave kostnader fra generelle laboratorie- og sykehusleverandører. Dette systemet gjør det mulig å blande trykkoksygen og luft til faste konsentrasjoner fra 21% -100% oksygen. Integreringen av en oksygensensor gjør det mulig å verifisere konsentrasjonen av utgangsgassblandingen, samt sjekke utstrømningsgasssammensetningen til tidligere sparte serumflasker for å bekrefte at oksygenforholdene er opprettholdt innenfor ønsket område.
Denne protokollen skisserer prosedyrer for å skape et kunstig sputummedium, bygging og bruk av et oksygensparingssystem, og anvendelsen av både til kultur CF sputum under differensial oksygenforhold.
I denne studien ble en in vitro-modell utviklet for å studere effekten av hyperoksia på lungemikrobielle samfunn. Denne modellen, basert på kunstig sputummedium og daglig sparging av serumflasker, opprettholder forhøyede oksygenkonsentrasjoner og støtter veksten av mikrober identifisert i sputum fra pwCF.
Det er flere kritiske trinn i denne tilnærmingen. Først er valget å bruke filtersterilisering i stedet for varmesterilisering av det kunstige sputummediet. Filtersteriliserin…
The authors have nothing to disclose.
En del av dette arbeidet ble utført ved Marine Biological Lab med støtte fra Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (tilskuddsnummer 5600373), og en gave fra Simons Foundation.
BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |