Summary
Målet med denne protokol er at udvikle et modelsystem for effekten af hyperoxi på cystisk fibrose luftvejs mikrobielle samfund. Kunstigt spyt medium emulerer sammensætningen af spyt, og hyperoxiske kulturforhold modellerer virkningerne af supplerende ilt på lungemikrobielle samfund.
Abstract
Luftvejs mikrobielle samfund menes at spille en vigtig rolle i udviklingen af cystisk fibrose (CF) og andre kroniske lungesygdomme. Mikrober er traditionelt blevet klassificeret baseret på deres evne til at bruge eller tolerere ilt. Supplerende ilt er en almindelig medicinsk behandling administreres til mennesker med cystisk fibrose (pwCF); men eksisterende undersøgelser af ilt og luftvejene mikrobiom har fokuseret på, hvordan hypoxi (lavt iltindhold) snarere end hyperoxi (høj ilt) påvirker overvejende aerob og fakultetet anaerob lunge mikrobielle samfund. For at løse dette kritiske videnskløft blev denne protokol udviklet ved hjælp af et kunstigt spytmedie, der efterligner sammensætningen af spyt fra pwCF. Brugen af filtersterilisering, som giver et gennemsigtigt medium, gør det muligt for optiske metoder at følge væksten af encellede mikrober i suspensionskulturer. For at skabe hyperoxiske tilstande drager dette modelsystem fordel af etablerede anaerobe dyrkningsteknikker til at studere hyperoxiske tilstande; i stedet for at fjerne ilt tilsættes ilt til kulturer ved daglig sparging af serumflasker med en blanding af trykluft og luft. Sputum fra 50 pwCF gennemgik daglig sparging i en 72-timers periode for at kontrollere denne models evne til at opretholde differentierede iltforhold. Shotgun metagenomic sekventering blev udført på kultiverede og uncultured spyt prøver fra 11 pwCF at kontrollere evnen til dette medium til at støtte væksten af commensale og patogene mikrober almindeligt forekommende i cystisk fibrose spyt. Vækstkurver blev opnået fra 112 isolater opnået fra pwCF for at kontrollere dette kunstige spytmediums evne til at understøtte væksten af almindelige cystisk fibrosepatogener. Vi finder, at denne model kan kultur en bred vifte af patogener og commensals i CF spyt, genvinder et samfund meget lig uncultured spyt under normoxiske forhold, og skaber forskellige kultur fænotyper under varierende ilt betingelser. Denne nye tilgang kan føre til en bedre forståelse af uventede virkninger forårsaget af brugen af ilt i pwCF på luftvejsmikrobielle samfund og almindelige respiratoriske patogener.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sygdom karakteriseret ved en manglende evne til at rydde tyk slim fra lungerne, hvilket fører til gentagne infektioner og progressiv lungefunktion tilbagegang, der ofte resulterer i behovet for lungetransplantation eller død. Luftvejens mikrobiom hos mennesker med cystisk fibrose (pwCF) synes at spore sygdomsaktivitet1, med en reduktion i mikrobiel mangfoldighed forbundet med negative langsigtede resultater2,3. I kliniske undersøgelser af pwCF, supplerende iltbehandling har været forbundet med mere avanceret sygdom4,5, men traditionelt, brugen af iltbehandling er blevet betragtet som blot en markør for sygdommens sværhedsgrad6. Nylige undersøgelser fra et klinisk forsøg med patienter med respirationssvigt har vist, at højere patientens iltniveau paradoksalt nok er forbundet med en stigning i alvorlige bakterieinfektioner og højere dødelighed7, hvilket tyder på, at supplerende ilt kan bidrage til sygdomspatogenese. Effekten af supplerende ilt på cystisk fibrose lungemikrobiom og tilhørende lunge-og luftveje mikrobielle samfund er ikke blevet godt undersøgt.
Mekanistiske undersøgelser kan ofte ikke udføres direkte på mennesker på grund af logistiske vanskeligheder og potentielle etiske spørgsmål forbundet med interventioner af ukendt medicinsk fordel eller skade. Translationelle tilgange, der integrerer menneskelige biospecimens i modelsystemer, kan give vigtig biologisk indsigt i disse tilfælde. Mens evnen til at bruge eller tolerere ilt traditionelt har været en vigtig del af mikrobielle klassificering, lidt vides om, hvordan den terapeutiske indførelse af supplerende ilt til miljøet kan forstyrre luftvejene mikrobielle samfund. For at kaste lys over de ukendte virkninger af supplerende ilt på luftvejene mikrobiomer af pwCF, vi havde brug for at løse to store udfordringer; for det første oprettelsen af et kulturmedium, der fysiologisk tilnærmer sammensætningen af CF sputum; for det andet oprettelsen af et modelsystem, der gør det muligt at opretholde forhøjede iltkoncentrationer i kulturen over længere tid.
Kunstige spytmedier (ASM) bruges i vid udstrækning til at efterligne lungesputum ex vivo8,9,10, men der er ingen klar konsensus om en bestemt opskrift. Denne protokol beskriver en kunstig spyt medium opskrift og forberedelse strategi omhyggeligt designet til fysiologisk omtrentlige spyt fra pwCF. Tabel 1 skitserer de valgte opskriftsværdier baseret på udgivet litteratur. Grundlæggende kemiske komponenter og pH blev matchet med værdier, der blev identificeret ved undersøgelser af human CF sputum11,12,13. Lav koncentration fysiologiske næringsstoffer blev tilsat ved hjælp af æggeblomme, som blev inkluderet som 0,25% af det endelige volumen10, samt vitamin og spormetal blander14,15. Mucin, den vigtigste komponent i spyt16, blev inkluderet på 1% w /v14. Selvom mere arbejdskrævende, filter sterilisering blev valgt over de mere konventionelle praksis med varme sterilisering for at reducere potentielle problemer fra varme-induceret denaturering af væsentlige mediekomponenter10. En yderligere fordel ved filtersterilisering er, at det genererer medier, der er gennemsigtige (varmesterilisering kan skabe uklare medier på grund af nedbør og koagulering af salte og proteiner), hvilket gør det muligt at bruge dette kunstige spytmedier til at følge mikrobiel vækst baseret på stigninger i turbiditet.
Dette modelsystem til den hyperoxiske kultur er baseret på anaerobe dyrkningsteknikker, hvor ilt tilsættes i stedet for at fjernes, hvilket skaber en model for effekten af supplerende iltforbrug til pwCF. Figur 1 og den tilhørende iltskåringsprotokol skitserer komponenterne i et iltskåringssystem, som kan opnås til lave omkostninger fra almindelige laboratorie- og hospitalsleverandører. Dette system gør det muligt at blande trykluft og luft til faste koncentrationer fra 21%-100% ilt. Integrationen af en iltsensor gør det muligt at kontrollere koncentrationen af outputgasblandingen samt kontrollere udstrømningsgassammensætningen af tidligere sparrede serumflasker for at kontrollere, at iltforholdene er blevet opretholdt inden for det ønskede interval.
Denne protokol skitserer procedurer for at skabe et kunstigt spyt medium, opførelse og brug af en ilt sparging system, og anvendelsen af både til kultur CF spyt under differentierede ilt betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse fik godkendelse fra Partners Institutional Review Board (protokol nr. 2018P002934). Inklusionskriteriet omfattede voksne patienter med cystisk fibrose, som gav skriftligt informeret samtykke til undersøgelsen. Der var ikke noget udelukkelseskriterium. Ifølge protokollen retningslinjer, alle spyt prøver blev indsamlet fra patienter med cystisk fibrose under en planlagt ambulant besøg med deres kliniske udbyder.
1. Kunstig spyt medium forberedelse
BEMÆRK: De her anførte mængder er til produktion af 1 L af det endelige kunstige spytmedium og antager de specifikke reagenser, der er angivet i materialetabellen. Numrene skal justeres for andre mængder eller for brug af forskellige reagenser for at sikre det samme slutprodukt. Se tabel 1 for målkoncentrationer.
- Kunstig spyt kemisk blanding (ASCM)
BEMÆRK: ASCM udgør 25% af den endelige medium volumen. Det er hylde-stabil og kan tilberedes i løs vægt eller på forhånd. Hvis den fremstilles til senere brug, skal du autoklave den kemiske blanding og opbevare den sikkert ved stuetemperatur.- Bland de konstituerende kemiske lagerløsninger.
- Forbered 1 M NaCl lager: Tilsæt 58,44 g NaCl per liter sterilt vand.
- Forbered 1 M KCl lager: Tilsæt 74,55 g KCl per liter sterilt vand.
- Forbered 1 M MgSO4 lager: Tilsæt 246,47 g MgSO4·7H2O pr. liter sterilt vand eller 120,37 g vandfri MgSO4 pr. liter sterilt vand.
- Forbered 1 M glukoselager: Tilsæt 180,16 g glukose pr. liter sterilt vand.
- Autoklave steriliserer de kemiske lageropløsninger samt en tom 250 mL flaske. Udfør autoklaveringstrinnene til mindst standardværdier på 121 °C og 15 PSI i 30 min.
- Tilsæt 80,59 mL sterilt vand til den tomme 250 mL flaske.
- Tilføj 152,30 mL af 1 M NaCl lager til blandingen.
- Tilføj 15,8 mL af 1 M KCl lager til mix.
- Tilsæt 610 μL af 1 M MgSO4 lager til blandingen.
- Tilsæt 700 μL af 1 M glukoselager til blandingen.
- Bland de konstituerende kemiske lagerløsninger.
- Kunstig spyt mucin mix (ASMM)
BEMÆRK: ASMM udgør 50% af den endelige medium volumen. Sørg for, at den tilberedes samme dag som det sidste mediumbatch.- Tilsæt 450 mL sterilt vand til en tom 1 L flaske.
- Tilsæt 50 mL 10x Fosfat-Buffered Saltvand (PBS) til flasken.
- Tilsæt en engangs magnetisk rørstang til flasken.
- Autoklave flasken indeholdende PBS og rørestangen.
- Mål 10 g mucinpulver og tilsæt det til PBS.
- Ryst flasken kraftigt for indledende blanding.
- Læg flasken på en kogeplade med en magnetisk omrører. Indstil varmen til medium-høj målretning 50 °C og omrøring hastighed til 1100 rpm. Rampe op hastigheden gradvist, så baren ikke flyver ud af magneten.
- Lad det varme og rør i 15 min.
- Saml flasken op med varmebestandige handsker. Vær opmærksom på at kontrollere, om mucinpulver sætter sig ud af opløsningen.
- Hvis mucinpulveret ikke er helt opløst, skal flasken varmes/omrøres i 5 minutters intervaller, indtil den er helt opløst.
- Lad mucinblandingen køle af til stuetemperatur.
- Kunstig spyt biologisk blanding (ASBM)
BEMÆRK: ASBM er 25% af den endelige medium volumen. Forbered det på samme dag som den endelige medium batch, og i modsætning til de andre blander, ikke udsætte sine komponenter til nogen varme.- Optø 100x vitaminlageret i et køleskab på 4 °C eller på is.
BEMÆRK: Fordelen af vitaminlageret i 10 mL aliquots for at minimere antallet af fryse-/optøningscyklusser. - Tilsæt 124,24 mL sterilt vand til den tomme autoklavede 250 mL flaske.
- Tilsæt 25,76 mL 50x essentielle aminosyre bestand til blandingen.
- Tilsæt 80,14 mL 100x ikke-essentielle aminosyre lager til blandingen.
- Tilsæt 10 mL (optøet) 100x vitamin lager til blandingen.
- Tilsæt 1 mL af 1000x spormetaller lager til blandingen.
- Tilsæt 8,33 mL 30% æggeblommeemulsion til blandingen.
- Der tilsættes 400 μL 10 g/L ferritinlager til blandingen.
- Bland opløsningen godt via manuel rystelser.
- Optø 100x vitaminlageret i et køleskab på 4 °C eller på is.
- Kunstigt spytmedium (ASM)
- Der tilsættes 250 mL ASCM til den 1 L-flaske, der indeholder ASMM.
- Tilsæt 250 mL ASBM til den mellemstore flaske.
- Titrere mediet med grundlæggende MOPS buffer (1 M) for at nå en pH-6.3 på et smalt pH-papir. Før titreringen vil mediumblandingen være for sur.
- Køle det resulterende kunstige spytmedium ved 4 °C, indtil det er klar til filtrering.
- For at starte filtreringsprocessen overføres 200 mL ufiltreret kunstigt spytmedium til et vakuumfiltreringssystem med et 0,22 μm porestørrelsesfilter.
- Tilslut filtreringssystemet til vakuumpumpen, tænd for vakuumpumpen, sæt den til 70 mbar, og placer derefter kammeret på en orbital shaker, der ryster ved 90 omdrejninger i et koldt rum ved 4 °C.
- Top off med yderligere 150 mL af mediet som en betydelig mængde filtreres. Det tager 1-2 dage at filtrere 1 L medium helt.
- Gentag med flere kamre, indtil alle medier er filtreret.
BEMÆRK: Prøv ikke at filtrere mere end 350 mL af mediet gennem det samme 0,22 μm filter, da mucin vil tilslutte filteret over tid.
- Kølefiltreret kunstigt spytmedium ved 4 °C, indtil det er klar til brug. Brug ASM inden for en måned efter forberedelse for de bedste resultater.
2. Iltskåring
- Opsætning af spargingstation
BEMÆRK: Denne protokol bør kun udføres fuldt ud én gang, hvorefter opsætningen kan opretholdes gennem simpel vedligeholdelse efter behov. Se figur 1 for et visuelt skema over iltskåringssystemet.- Fastgør og fastgør trykluft- og ilttankene korrekt.
FORSIGTIG: Højt tryk gør tankene ekstremt farlige, når de håndteres forkert. Sørg for, at tankene er helt forseglede og sikrede, der er ingen lækager, når tanken er lukket, og at alt håndteringspersonale er fuldt uddannet i deres brug. - Fastgør en luftregulator til tryklufttanken med en skruenøgle. For optimal flowaflæsning på regulatoren skal regulatoren fastgøres så tæt som muligt på en opretstående stilling.
- Fastgør en iltregulator til den komprimerede ilttank, der fastgøres så tæt som muligt på en opretstående stilling. Afhængigt af ilttanken kan det være nødvendigt at vende retningen for at stramme.
- Tilslut slangen fra regulatorerne til et Y-stik for at kombinere gasstrømmen fra de to tanke.
- Tilslut Y-stikkets udgang til den centrale T-samlingsventil.
- Tilslut den ene side af den centrale T-junction ventil til en gastrykmåler.
- Tilslut den anden side af gastrykmåleren til et sterilt sprøjtefilter med en 25 mm diameter med en 0,22 μm porestørrelse.
- Fastgør et andet sprøjtefilter med en diameter på 25 mm på en sprøjte uden et stempel, der skal bruges som gasudslip under sparging.
- Tilslut den sidste side af den centrale T-junction ventil til en anden T-junction ventil til iltmonitoren.
- Tilslut et sprøjtefilter med en diameter på 25 mm på den ene side af denne anden T-forgreningsventil sammen med slanger, der skal fastgøres med 18 G nåle.
- Tilslut den sidste side af den anden T-junction ventil til ilt overvågningsapparatet.
- Tilslut et afskæringsrør på den anden side af iltovervågningsapparatet, der skal anvendes som gasudslip under overvågningen.
FORSIGTIG: Når du tester/bruger iltskåringssystemet, skal du være opmærksom på T-vejkrydsenes position og sikre, at den matcher den ønskede sti gennem systemet. Hvis du ikke gør det, vil det resultere i trykopbygning inde i systemet og få komponenterne til at svigte og skilles ad . - For vedligeholdelse af systemet og for at holde det fungerer ved optimal ydeevne, følgende praksis er gavnligt.
- Styrke forbindelserne med liberale mængder af Teflon tape til i høj grad at forbedre deres forsegling og reducere risikoen for komponenter, der kommer bortset fra det interne pres.
- Hold den kombinerede strømningshastighed under 10 L/min for at mindske det maksimale tryk og forhindre fejl.
- Hvis der er mistanke om en lækage, skal du bruge en vaskemiddelopløsning som kommercielt tilgængelige væskelækagedetektorer til nemt at identificere dens placering, da den vil boble over eventuelle gaslækager. Patch lækker ved hjælp af et Polytetrafluoroethylen tape (f.eks Teflon).
- Udskift sprøjtefiltrene med en diameter på 25 mm i iltskåringssystemet hver anden uge, men dette varierer med brugsfrekvensen. Over tid reducerer partikler, der fanges i filteret, gasstrømmen og forårsager trykopbygninger.
- Kalibrer iltmonitoren til 21 % ilttrykluft, før der foretages målinger.
- Når systemet er færdigt, skal du slukke for tankene og bløder den overskydende gas fra tilsynsmyndigheder, indtil strømmen helt stopper.
- Fastgør og fastgør trykluft- og ilttankene korrekt.
- Serum flaske kultur sparging
- Mærk 500 mL autoklavede serumflasker med prøve-identifikatorer, dato/klokkeslæt for podning og mål oxygenprocent.
- I en biologisk hætte tilsættes 24 mL af det kunstige spytmedium til hver serumflaske, der sættes op.
- Der tilsættes 1 mL af patientens spyt homogeniseret med en 18-G nål (fortyndet med steril saltvand, hvis det er nødvendigt for at opnå tilstrækkelig mængde prøve for hver kulturtilstand) til hver serumflaske.
- Brug sterile pincet, placere autoklave gummi propper på toppen af hver serum flaske.
- Tryk gummipropperne ned, pas på ikke at røre undersiden af proppen med hænderne.
- Fjern flaskerne fra emhætten, påfør og pres aluminiumstætningerne. Fjern midterstykket fra tætningerne.
- Tør ned toppen af flasker med en alkohol tørre og passere dem gennem en Bunsen brænder flamme.
- Anbringe en steril 18-G nål til et stempel-mindre sprøjte med et filter. Sæt denne gas frigivelse i flasken først.
- Sæt en steril 18-G nål på gasudgangen fra systemet og sæt gasudgangsnålen også i flasken.
- Før T-vejkrydsene fra tankene gennem iltmonitoren. Kontroller, at målet ilt koncentration flyder gennem systemet. Mål ca. 5 L/min gasstrøm.
- Omdiriger T-vejkrydsene fra tankene til gasudgangen. Gassen begynder at strømme gennem serumflasken.
FORSIGTIG: Vær meget opmærksom på trykmåleren under iltskåring. Hvis trykket stiger uventet, skal du straks slukke for systemet. - Kør ilt sparge gennem serumflasken i 1 min. Ved 5 L/min giver dette mulighed for 10 luftudvekslinger og sikrer, at den indre atmosfære når det ønskede delvise tryk.
- Fjern gasudslip 18-G nål.
- Lad trykket i serumflasken bygge til +1 atmosfære (2 atmosfærer ved havets overflade) og fjern derefter straks gasudgangsnålen.
BEMÆRK: Fastholdelse af tryk hjælper med at opretholde hyperoxiske forhold over tid. - Serumflasken placeres i en inkubator shaker på 37 °C ved 150 omdr./min. Inkuber prøverne i tre 24-timers intervaller. Ved hvert interval på 24 timer skal du tage en aliquot til downstream-analyse, sparre prøverne igen og returnere dem til inkubation i en samlet inkubationstid på 72 timer.
- Måling af ilt udstrømning
- Kalibrer iltmåleren til 21% trykluft, og sluk derefter for tanken.
- Før indsugningen af serumflasken gennem iltmåleren, og fastgør en steril nål til enden.
- Sæt nålen gennem gummiproppen i serumflasken.
- Vent på, at udstrømningen stabiliseres. En lav strømningshastighed ud af serumflaskerne betyder, at dette kan tage op til 2 min. Anmeld den maksimale forskel fra rumluft (antal længst fra 21%).
- Hvis du udfører flere aflæsninger, skal du skylle systemet med trykluft mellem aflæsningerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse protokoller blev anvendt på 50 eksprentes sputum prøver fra pwCF præsentere for rutinemæssig pleje til en ambulant cystisk fibrose klinik på Massachusetts General Hospital i Boston, Massachusetts. Hver patients spyt blev kultiveret under 21%, 50% og 100% iltforhold ved hjælp af det kunstige spytmedium, med 0,5 mL aliquots taget fra hver kultur ved 24 timer, 48 timer og 72 timers kulturtid til test. Kulturer blev fotograferet, da der blev foretaget ekstraktioner for at spore visuelle ændringer. Derudover blev der udtaget en 0,5 mL aliquot af hver primær spytprøve før dyrkningen. Dette resulterede i 10 diskrete prøver pr. patient og et endeligt N på 500 prøver. Af disse gennemgik spyt fra 11 patienter (11 ukulturelle sputa, 11 kultiverede sputa fra 21% ilt ved 48 timers inkubation) nukleinsyreudvinding17,sekventeringsbiblioteker blev genereret ved hjælp af et kommercielt DNA-biblioteksforberedelsessæt, og metagenomic sekventering blev udført på en hel genomsekvenseringsplatform rettet mod ~ 5 Gb sekvens pr. prøve med 150 basispar, parrede end-læsninger. Raw læser blev behandlet ved hjælp af bioBakery suite af værktøjer18, som omfatter kvalitetskontrol og fjernelse af menneskelige "forurenende" sekvenser og taksonomisk profilering med MetaPhlAn3 profiler19. På tidspunktet for udvinding af nukleinsyre blev 10 millioner celler imtechella halotoleraner, en halotolerant art, der normalt findes i flodmundingsøkosystemer og ikke i menneskelige mikrobielle samfund, hældt ind i hver prøve, hvilket gjorde det muligt at kvantificere absolut mikrobiel belastning for hver prøve20.
Figur 2 viser individuelle og gennemsnitlige udstrømnings oxygenmålinger og pH-niveauer i løbet af kulturprocessen for 50 spytprøver, der dyrkes under hver ilttilstand, og et eksempel på en visuel differentialkulturfænotype. Kulturer blev opretholdt ved 37 °C, undtagen i korte perioder, hvor der blev udført sparging og fjernelse af prøve aliquots. Med både sparsomme intervaller på 12 timer og 24 timer blev forhøjede iltkoncentrationer opretholdt, selv om der blev observeret et fald over tid for alle tre iltforhold, hvor 100% ilt faldt til ca. 85%, 50% ilt faldt til 40%, og 21% ilt faldt til 18%. Iltforholdene forblev forskellige, og vigtigere blev forhøjede iltkoncentrationer opretholdt under hele processen for hyperoxiske prøver. pH-målinger viste en større grad af variation, men holdt sig godt inden for et fysiologisk normalt interval uden statistisk signifikante ændringer over tid. Disse målinger viser, at disse metoder opretholder diskrete differentierede iltforhold gennem hele kulturprocessen. Endelig er et eksempel på en af mange visuelle kultur fænotyper, der differentieres på tværs af ilt koncentration er vist. Denne prøve havde markeret uklarhedsforskelle efter 72 timers kultur, med højere ilt forbundet med lavere visuel turbiditet. Differentialkultur fænotyper støtte tilstedeværelsen af hyperoxia-induceret virkninger på kultur samfund.
Figur 3 sammenligner mikrobiel belastning, mikrobiel mangfoldighed og mikrobiel samfundssammensætning mellem ubekulturelt spyt og kultiveret spyt (21% ilttilstand i en periode på 48 timer). Målinger viser, at den eneste store forskel, der er indført ved dyrkningshandlingen, er en ca. 20-dobling af mikrobiel belastning sammenlignet med ubekulturelt spyt. Immunsystemet og de typiske mekaniske spyt clearance mekanismer såsom hoste normalt tjene som en lovgivningsmæssig proces, der begrænser den mikrobielle belastning i lungerne, selv i tilfælde af dysfunktion og infektion som dem, der ses i pwCF. Ex vivo kultur har ikke sådanne reguleringsmekanismer, og mikrobielle samfund er i stedet fri til at gå videre mod cellulære mætning. Alfa- og betadiversitetsmålinger indikerer, at på trods af denne forskel i mikrobiel belastning forbliver den underliggende fællesskabssammensætning velbevaret med minimale globale forskelle indført af kulturprocessen.
Figur 4 udvider sammenligningen mellem ikke-dyrkede og kultiverede spytprøver, ser på den binære tilstedeværelse / fravær af de 120 mikrobielle arter endeligt identificeret ved shotgun metagenomics sekventering fra kultiveret og uncultured spyt opnået fra 11 patienter. Mikrober er grupperet baseret på fylogenetiske ligheder. 46 (38,3%) af disse arter blev identificeret i både ikke-dyrkede og kultiverede prøver (cyanfarve), mens 35 (29,2%) udelukkende blev identificeret i ikke-dyrkede prøver (gul) og 39 (32,5%) blev udelukkende identificeret i dyrkede prøver (blå). Det er sandsynligt, at der er større paritet end det, vi identificerede ved hjælp af sekventering med hensyn til, hvad der er til stede, og hvad der er fraværende, men nogle taxa falder under sekventeringsregistreringstærsklen i nogle tilfælde. Forskellene tyder på, at kulturprocessen introducerer en vis bias i kultiveret i forhold til uncultured sputum. Mest bemærkelsesværdigt, dyrkning øger tilstedeværelsen af svampe som Candida og Aspergillus, samt Enterobacterales medlemmer, herunder Escherichia, Serratia, og Streptococcus medlemmer. Omvendt var Bacteroidetes medlemmer som Prevotella og Clostridiales, som er anaerober, til stede i ikke-dyrkede prøver, men ikke til stede i dyrkede prøver. Dette kan tilskrives manglen på en anaerobe tilstand i vores eksperimentelle model.
Figur 5 viser absorbansbaserede vækstkurver for almindelige CF lungepatogener isoleret fra spyt fremstillet af 50 forskellige pwCF. Disse isolater repræsenterer fænotypet forskellige kliniske isolater opnået ved hjælp af berigelseskulturprocedurer fra Massachusetts General Hospital Clinical Microbiology Laboratory og omfatter Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) og Achromobacter sp (N = 7). Vækstkurver blev opnået ved dyrkning af hver isolere i kunstige spyt medier ved 37 °C i mørke, med ASM sans bakteriel podning tjener som en negativ kontrol. Den gennemsigtige kvalitet af ASM (som skyldes filter snarere end varmesterilisering) giver mulighed for at gennemføre optiske foranstaltninger til at estimere vækstkurver. Optiske aflæsninger ved 600 nm (OD600) blev taget hvert 10. minut, og de første 24 timer i hver kurve vises. Fraværet af ændringer i optiske aflæsninger i asm-only negativ kontrol indikerer kulturer fri for forurening. De demonstrative kurver, der vises her, følger typiske vækstkurvemønstre, der angiver levedygtigheden af denne ASM-opskrift som et medium for den absorbansbaserede generation af vækstkurver.
| Kolonne 1 | Kolonne 2 | Kolonne 3 | Kolonne 4 | Kolonne 5 | Kolonne 6 | Kolonne 7 | Kolonne 8 | Kolonne 9 | |
| Værdi | Comstock | Kirchner | Sriramulu | Palmer | Flynn | Gallagher | Lai | Kilde | |
| Mucin | 2% w/v | 0,5% w/v | 0,5% w/v | - | 1% w/v | 2% w/v | 1% w/v | Flynn | |
| Natriumchlorid | 85,5 mM | 85,5 mM | 85,5 mM | 66,6 mM | 89,8 mM | 85,5 mM | 152,3 mM | Lapierre | |
| Kaliumchlorid | 29,5 mM | 29,5 mM | 29,5 mM | 15,8 mM | - | 2,95 mM | 15,8 mM | Palmer | |
| Magnesiumsulfat | - | - | - | 0,6 mM | 1 mM | 1 mM | 0,61 mM | Palmer | |
| Jernsulfat | - | - | - | 0,0036 mM | - | - | - | - | |
| Ammoniumchlorid | - | - | - | 2,3 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Monopotassium Fosfat | - | - | - | 2,5 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Glukose | - | - | - | 3,2 mM | 13 mM | 40 mM | 0,7 mM | Sambeek | |
| Laktat | - | - | - | 9 mM | - | - | - | - | |
| Essentielle aminosyrer | 14.45x | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Pr. syre | 0,5x | 0,375x | 1,29x | Palmer | |
| Ikke-essentielle aminosyrer | 28,9x | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Pr. syre | 0,25x | 0,5x | 8.01x | Palmer | |
| Vitaminer | - | - | - | - | - | 1x | 1x | Gallagher | |
| Spormetaller | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | Flynn | |
| Æggeblomme | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | Kirchner | |
| Ferritin | 0,0003 g/L | - | - | - | - | 0,0004 g/L | 0,0004 g/L | Gallagher | |
| Laks Sperm DNA | 1,4 g/L | 4 g/L | 4 g/L | - | - | 1,4 g/L | - | - | |
| DPTA | - | - | 0,0059 g/L | - | - | - | - | - | |
| ph | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | Lapierre | |
| Oplagring | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | Kirchner | |
| Sterilisering | Autoklave | Filter | Autoklave | - | Autoklave | Autoklave | Filter | Kirchner | |
Tabel 1: Kunstig spyt medium opskrift stammer fra gennemgang af litteratur. (Kolonne 1) Reagenser og nøgleværdier i formuleringen af kunstigt spyt medium. (Kolonne 2-7) Sammenligning af opskrifter fra ekstant litteratur8,9,10,12,14,15. (Kolonne 8-9) Kunstig spyt medium opskrift beskrevet i denne protokol og de tilsvarende kilder, der informerede hver valgt værdi10,11,12,13,14,15.
| Kolonne 1 | Kolonne 2 | Kolonne 3 |
| CF Sputum | ASM | |
| Aminosyrer i alt | 10,25 mM | 10,76 mM |
| Alanin | 0,96 mM | 0,80 mM |
| Arginin | 0,17 mM | 0,94 mM |
| Asparagine | 0,91 mM | |
| Aspartsyre | 0,45 mM | 0,80 mM |
| Cystein | 0,09 mM | 0,33 mM |
| Glutaminsyre | 0,84 mM | 0,80 mM |
| Glycin | 0,65 mM | 0,80 mM |
| Histidin | 0,28 mM | 0,35 mM |
| Isoleucin | 0,60 mM | 0,52 mM |
| Leucin | 0,87 mM | 0,52 mM |
| Lysin | 1,15 mM | 0,64 mM |
| Methionin | 0,34 mM | 0,13 mM |
| Ornithin | 0,36 mM | |
| Fenylalanin | 0,29 mM | 0,26 mM |
| Prolin | 0,90 mM | 0,80 mM |
| Serin | 0,78 mM | 0,80 mM |
| Threonine | 0,58 mM | 0,52 mM |
| Tryptophan | 0,07 mM | 0,06 mM |
| Tyrosin | 0,43 mM | 0,26 mM |
| Valin | 0,60 mM | 0,52 mM |
Tabel 2: Aminosyrekoncentrationer, der tidligere er beskrevet i cystisk fibrose spyt og i kunstig spyt medium opskrift beskrevet i denne protokol. (Kolonne 1) Vigtige aminosyrer. (Kolonne 2) Aminosyrekoncentrationer af spyt fra personer med cystisk fibrose12. (Kolonne 3) Aminosyrekoncentrationer i kunstigt spytmedium, der er beskrevet i denne protokol
Figur 1: Tilslutningsskemaet for komponenter i systemet til iltskåring. Flow diagram over forbindelserne mellem komponenter i systemet, der anvendes til at sparge serum flasker til ønskede ilt koncentrationer mellem 21% og 100%. Systemet har 3 brugsmåder bestemt af placeringen af de to T-junction ventiler. Systemet kan dirigere gas fra tankene gennem gasudgangen eller gennem iltprocentmåleren samt ruteudstrømningsgas fra tidligere sparrede serumflasker gennem skærmen for at kontrollere koncentrationen, når tiden er gået. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mål iltkoncentrationerne opretholdes ca. med både 12 timer og 24 timers spargingintervaller, og pH forbliver i det fysiologiske område under kulturen. (A) Udstrømning ilt aflæsninger fra 12 timer og 24 timer ilt sparging intervaller over en 72-timers periode. (B) pH-aflæsninger for prøver målt hver 24. h. (C) Et eksempelbillede af den dyrkede prøve CFB010 efter 72 timer, der viser differentieret turbiditet på tværs af iltkoncentrationer. Farven angiver mål oxygenprocent; fejllinjer angiver 95 % konfidensintervaller. Kritiske tærskler fremhæves med stiplede linjer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dyrkning øger den mikrobielle belastning, men den underliggende fællesskabssammensætning bevares. Ukultureret spyt (gul) og kultiveret spyt (blå) ved hjælp af kunstigt spytmedium ved 21% ilt i 48 timer. Aliquots gennemgik nukleinsyreudvinding og shotgun metagenomics sekventering for at opdage mulig bias indført fra kulturforhold. (A) Absolut mikrobiel belastning (bestemt af spike-in kontrol) og alfa mangfoldighed målinger. Ved hjælp af lineære blandede effekter modeller, uncultured vs kultiveret spyt forudsagt mikrobielle belastning, men ikke alpha mangfoldighed. (B) Ordination af de to første komponenter i betadiversitetsmålinger, der kontrollerer for forskel i mikrobiel belastning. Ingen signifikant forskel i nogen af målingerne efter PERMANOVA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Størstedelen af de identificerede taxaer er til stede i både kildesputum og kultur, mens andre kun optræder i kildesputum eller kultur. Shotgun metagenomics sekventering bruges til at sammenligne forskelle i mikrobielle samfund sammensætning mellem uncultured og kultiveret spyt prøver. Fylogenetisk træ af alle identificerede mikrobielle arter i sekvenserede prøver (N = 120). Arter markeret med gul (N = 35, 29,2%) blev kun set i uncultured spyt prøver. Arter markeret med blå (N = 39, 32,5%) blev kun set i kunstige spyt medium kulturprøver. Arter markeret med cyan (N = 46, 38,3%) blev set i både ikke-dyrkede og kultiverede prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kunstigt spytmedium er tilstrækkeligt gennemsigtigt til at kunne anvendes som vækstkurvemedium til dyrkning af kliniske isolater. Der blev foretaget optimale densitetsaflæsninger ved 600 nm hvert 10. minut, og de første 24 timer i hver kurve vises. Grå linjer repræsenterer individuelle aflæsninger, og orange linjer repræsenterer den gennemsnitlige absorbans for hver takson. Kunstig spyt medium tom inkluderet som en kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev der udviklet en in vitro-model for at studere hyperoxiaens virkning på lungemikrobielle samfund. Denne model, der er baseret på kunstigt spyt medium og daglig sparging af serumflasker, opretholder forhøjede iltkoncentrationer og understøtter væksten af mikrober identificeret i spyt fra pwCF.
Der er flere kritiske trin i denne tilgang. For det første er valget om at bruge filtersterilisering i stedet for varmesterilisering af det kunstige spytmedie. Filtersterilisering forhindrer denaturering af mucin og andre varmefølsomme komponenter i mediet og giver et klart medium, der kan bruges til optiske målinger af mikrobiel vækst. Mens filtersterilisering er blevet foreslået i andre protokoller10, har vi konstateret, at tilsætning af orbital rysten under filtreringsprocessen var afgørende for at forhindre tilstopning af filteret, der ellers opstod, da en minimumsmængde af det forberedte medium var blevet filtreret. Mens det filtrerede kunstige spyt medium kan have en lavere end beregnet endelige mucin koncentration på grund af mucin impaction i filteret, spyt fra pwCF har vist sig at have lavere mucin koncentrationer end spyt fra mennesker uden cystisk fibrose21. Den begyndende mucinkoncentration på 1 %, der anvendes i denne protokol, er højere end ved andre metoder, der har anvendt filtersterilisering, idet en gruppe bruger en begyndende mucinkoncentration på 0,5 %10, mens typiske opskrifter anvender mucinkoncentrationer fra 0,5 %-2 % (tabel 1). Selv med tab af mucin i filtersteriliseringsprocessen vil det endelige medium, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol, sandsynligvis have mucinkoncentrationer inden for det fysiologiske område22.
Den anden er sammensætningen af kunstigt spyt medium. Opskriften på kunstigt spytmedium blev valgt på grundlag af eksisterende fysiologiske undersøgelser af spyt fra pwCF (tabel 1). Ved hjælp af shotgun metagenomics sekventering, vi var i stand til at kontrollere, at spyt dyrkes med denne kunstige spyt medium stort set opsummerer den mikrobielle samfund sammensætning af uncultured spyt(Figur 3). Ved normoxiske tilstande støttede dette medium også væksten af 112 forskellige kliniske isolater, der repræsenterer almindelige patogener isoleret fra spyt af cystisk fibrosepatienter. Disse data viser således, at denne formulering af kunstigt spyt medium understøtter væksten af luftvejsmikrobiota fra pwCF. Laks sperm DNA, en fælles tilføjelse til eksisterende opskrifter (Tabel 1), blev udeladt. En bestemt anvendelse af denne model er metagenomics sekventering, og dermed laks sperm DNA blev ikke medtaget for at reducere tilsætning af ikke-mikrobielle nukleinsyrer, som disse aflæsninger ville blive filtreret ud efter sekventering, hvilket reducerer vores effektive sekventering dybde. Mens spyt fra pwCF har høje koncentrationer af ekstracellulært DNA23, er en betydelig del af det mikrobielt af oprindelse24, og det er uklart, om tilsætning af laksesæds DNA til det kunstige spytmedium gør det mere fysiologisk, eller om den kulturtilgang, der er beskrevet i denne protokol, fører til høje niveauer af mikrobielt afledt ekstracellulært DNA; vi skelnede ikke mellem ekstra- og intracellulære DNA-koncentrationer i vores undersøgelser. Fremtidige undersøgelser kan ønske at kontrollere koncentrationen af ekstracellulært DNA genereret ved denne dyrkningsmetode.
For det tredje, så vidt vi ved, ingen offentliggjorte undersøgelser af cystisk fibrose lunge mikrobielle samfund har behandlet hyperoxiske tilstande. Denne model bruger billigt og almindeligt tilgængeligt udstyr fra generelle laboratorie- eller hospitalsleverandører til at opbygge et iltbesparende system. Vigtige overvejelser for vedligeholdelsen af hyperoxiske forhold omfatter volumenet af kulturmediet i forhold til det tilgængelige headspace i serumflaskerne. I de første forsøg under protokoludvikling blev der anvendt 125 mL serumflasker. Brugen af 500 mL serumflasker (der giver mulighed for et 475 mL headspace til 25 mL-kulturforhold) gjorde det imidlertid muligt at opretholde den ønskede koncentration i op til 24 timer, hvilket reducerede hyppigheden af iltskåring. Denne tilgang genererer diskrete iltforhold, hvilket muliggør samtidig kultur af forskellige patientprøver på tværs af flere iltforhold. Andre værktøjer fra anaerobe kultur kan udnyttes til hyperoxisk kultur, herunder brug af anaerobe krukker eller Balch-type rør sparret med ilt. Analyser af lungemikrobielle samfund ved hjælp af metagenomics sekventering viser, at den samlede alfa- og betadiversitet er sammenlignelig mellem kultiveret og uncultured sputum. Ved evaluering af forskellen overflod på artsniveau, dyrkning på 21% ilt, beriget til vækst af aerobes og fakultetet anaerober, herunder Enterobacterale, Streptococcus, og svampe. Dette skyldes sandsynligvis udelukkelsen af en anaerobe tilstand , som er blevet observeret i luftvejene på pwCF25,26. Fremtidige undersøgelser kunne overveje optagelse af kvælstofgas i denne model til at studere en række anoxiske og oxiske tilstande og tilsvarende aerob og anaerobe mikrobiota findes i luftveje mikrobielle samfund.
De centrale principper, der er skitseret i disse protokoller, kan være lærerige for gennemførelsen af lignende undersøgelser i forbindelse med ilts indflydelse på komplekse mikrobielle samfund eller almindelige lungepatogener. Oxygen er den mest almindelige behandling, der anvendes til behandling af alle avancerede lungesygdomme, og en bedre forståelse af, hvordan det kan føre til indirekte uventede virkninger på luftvejsmikrobielle samfund og almindelige respiratoriske patogener vil være vigtigt for pleje af pwCF og andre kroniske lungesygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
En del af dette arbejde blev udført på Marine Biological Lab med støtte fra Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (tilskudsnummer 5600373) og en gave fra Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S.
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K.
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
