Design og utvikling av en modell for å studere effekten av supplerende oksygen på cystisk fibrose luftveismikrobiom

Summary

Målet med denne protokollen er å utvikle et modellsystem for effekten av hyperoksia på cystiske fibrose luftveismikrobielle samfunn. Kunstig sputummedium emulerer sammensetningen av sputum, og hyperoksiske kulturforhold modellerer effekten av supplerende oksygen på lungemikrobielle samfunn.

Abstract

Luftveis mikrobielle samfunn antas å spille en viktig rolle i utviklingen av cystisk fibrose (CF) og andre kroniske lungesykdommer. Mikrober har tradisjonelt blitt klassifisert basert på deres evne til å bruke eller tolerere oksygen. Supplerende oksygen er en vanlig medisinsk terapi administrert til personer med cystisk fibrose (pwCF); Imidlertid har eksisterende studier på oksygen og luftveismikrobiomet fokusert på hvordan hypoksi (lavt oksygen) i stedet for hyperoksi (høyt oksygen) påvirker de overveiende aerobe og fakultets anaerobe lungemikrobielle samfunnene. For å løse dette kritiske kunnskapsgapet ble denne protokollen utviklet ved hjelp av et kunstig sputummedium som etterligner sammensetningen av sputum fra pwCF. Bruken av filtersterilisering, som gir et gjennomsiktig medium, gjør det mulig for optiske metoder å følge veksten av encellede mikrober i suspensjonskulturer. For å skape hyperoksiske forhold utnytter dette modellsystemet etablerte anaerobe kultiveringsteknikker for å studere hyperoksiske forhold; I stedet for å fjerne oksygen, tilsetter oksygen til kulturer ved daglig sparring av serumflasker med en blanding av trykkoksygen og luft. Sputum fra 50 pwCF gjennomgikk daglig sparring i en 72-timers periode for å verifisere denne modellens evne til å opprettholde differensialoksygenforhold. Hagle metagenomisk sekvensering ble utført på kultiverte og ukulturerte sputumprøver fra 11 pwCF for å verifisere dette mediets evne til å støtte veksten av kommensale og patogene mikrober som vanligvis finnes i cystisk fibrose sputum. Vekstkurver ble oppnådd fra 112 isolasjoner hentet fra pwCF for å verifisere evnen til dette kunstige sputummediet for å støtte veksten av vanlige cystiske fibrosepatogener. Vi finner at denne modellen kan dyrke et bredt utvalg av patogener og commensals i CF sputum, gjenoppretter et samfunn som ligner sterkt på ukulturert sputum under normoksiske forhold, og skaper forskjellige kulturfenotyper under varierende oksygenforhold. Denne nye tilnærmingen kan føre til en bedre forståelse av uforutsiktede effekter forårsaket av bruk av oksygen i pwCF på luftveis mikrobielle samfunn og vanlige respiratoriske patogener.

Introduction

Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sykdom preget av manglende evne til å fjerne tykt slim fra lungene, noe som fører til gjentatte infeksjoner og progressiv lungefunksjonsnedgang som ofte resulterer i behovet for lungetransplantasjon eller død. Luftveismikrobiomet til personer med cystisk fibrose (pwCF) ser ut til å spore sykdomsaktivitet¹, med en reduksjon i mikrobielt mangfold forbundet med ugunstige langsiktige resultater^2,3. I kliniske studier av pwCF har supplerende oksygenbehandling vært forbundet med mer avansert sykdom^4,5, men tradisjonelt har bruk av oksygenbehandling blitt sett på som bare en markør for sykdoms alvorlighetsgrad⁶. Nyere studier fra en klinisk studie av pasienter med luftveissvikt har vist at høyere oksygennivå hos pasienter paradoksalt nok er forbundet med en økning i alvorlige bakterielle infeksjoner og høyere dødelighet⁷, noe som tyder på at supplerende oksygen kan bidra til sykdomspatogenese. Effekten av supplerende oksygen på cystisk fibrose lungemikrobiom og tilhørende lunge- og luftveismikrobielle samfunn er ikke godt studert.

Mekanistiske studier kan ofte ikke utføres direkte på mennesker på grunn av logistiske vanskeligheter og potensielle etiske problemer knyttet til intervensjoner av ukjent medisinsk nytte eller skade. Translasjonelle tilnærminger som integrerer menneskelige biospecimens i modellsystemer, kan gi viktig biologisk innsikt i disse tilfellene. Mens evnen til å bruke eller tolerere oksygen tradisjonelt har vært en viktig komponent i mikrobiell klassifisering, er det lite kjent om hvordan den terapeutiske innføringen av supplerende oksygen til miljøet kan perturb luftveis mikrobielle samfunn. For å belyse de ukjente effektene av supplerende oksygen på luftveismikrobiomene til pwCF, måtte vi ta opp to store utfordringer; for det første, opprettelsen av et kulturmedium som fysiologisk tilnærmer sammensetningen av CF sputum; For det andre, opprettelsen av et modellsystem som tillater vedlikehold av forhøyede oksygenkonsentrasjoner i kulturen over lengre perioder.

Kunstige sputummedier (ASM) er mye brukt til å etterligne lunge sputum ex vivo^8,9,10, men det er ingen klar konsensus om en bestemt oppskrift. Denne protokollen beskriver en kunstig sputum medium oppskrift og forberedelse strategi nøye designet for fysiologisk omtrentlig sputum fra pwCF. Tabell 1 skisserer de valgte oppskriftsverdiene basert på publisert litteratur. Grunnleggende kjemiske komponenter og pH ble matchet med verdier identifisert av studier av human CF sputum^11,12,13. Lav konsentrasjon fysiologiske næringsstoffer ble tilsatt ved hjelp av eggeplomme, som ble inkludert som 0,25% av det endelige volumet¹⁰, samt vitamin- og spormetallblandinger^14,15. Mucin, nøkkelkomponenten i sputum¹⁶, ble inkludert ved 1% m/ v¹⁴. Selv om det var mer arbeidskrevende, ble filtersterilisering valgt over den mer konvensjonelle praksisen med varmesterilisering for å redusere potensielle problemer fra varmeindusert denaturering av essensielle mediekomponenter¹⁰. En ekstra fordel med filtersterilisering er at den genererer medier som er gjennomsiktige (varmesterilisering kan skape uklare medier på grunn av nedbør og koagulasjon av salter og proteiner), slik at dette kunstige sputummediet kan brukes til å følge mikrobiell vekst basert på økning i turbiditet.

Dette modellsystemet for den hyperoksiske kulturen er basert på anaerobe kultiveringsteknikker der oksygen tilsetts i stedet for å fjernes, og skaper en modell for effekten av supplerende oksygenbruk for pwCF. Figur 1 og den tilhørende oksygensparingsprotokollen skisserer komponentene i et oksygensparingssystem, som kan oppnås til lave kostnader fra generelle laboratorie- og sykehusleverandører. Dette systemet gjør det mulig å blande trykkoksygen og luft til faste konsentrasjoner fra 21% -100% oksygen. Integreringen av en oksygensensor gjør det mulig å verifisere konsentrasjonen av utgangsgassblandingen, samt sjekke utstrømningsgasssammensetningen til tidligere sparte serumflasker for å bekrefte at oksygenforholdene er opprettholdt innenfor ønsket område.

Denne protokollen skisserer prosedyrer for å skape et kunstig sputummedium, bygging og bruk av et oksygensparingssystem, og anvendelsen av både til kultur CF sputum under differensial oksygenforhold.

Protocol

Denne studien fikk godkjenning fra Partners Institutional Review Board (Protokoll # 2018P002934). Inklusjonskriteriet omfattet voksne pasienter med cystisk fibrose som ga skriftlig informert samtykke til studien. Det var ikke noe eksklusjonskriterium. I henhold til protokollretningslinjer ble alle sputumprøver samlet inn fra pasienter med cystisk fibrose under et planlagt poliklinisk besøk hos deres kliniske leverandør. 1. Kunstig Sputum Medium Forberedelse MERK: M…

Representative Results

Disse protokollene ble brukt på 50 ekspektorerte sputumprøver fra pwCF som presenterte for rutinemessig behandling til en poliklinisk cystisk fibroseklinikk ved Massachusetts General Hospital i Boston, Massachusetts. Hver pasients sputum ble dyrket under 21%, 50% og 100% oksygenforhold ved hjelp av det kunstige sputummediet, med 0,5 ml aliquots tatt fra hver kultur ved 24 timer, 48 timer og 72 timers kulturtid for testing. Kulturer ble fotografert da det ble gjort ekstraksjoner for å spore visuelle endringer. I tilleg…

Discussion

I denne studien ble en in vitro-modell utviklet for å studere effekten av hyperoksia på lungemikrobielle samfunn. Denne modellen, basert på kunstig sputummedium og daglig sparging av serumflasker, opprettholder forhøyede oksygenkonsentrasjoner og støtter veksten av mikrober identifisert i sputum fra pwCF.

Det er flere kritiske trinn i denne tilnærmingen. Først er valget å bruke filtersterilisering i stedet for varmesterilisering av det kunstige sputummediet. Filtersteriliserin…

Materials

BME Vitamins (100x) Solution	MilliporeSigma	B6891	Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021	Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion	HiMedia	FD045	Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen	MilliporeSigma	F7879	Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner	Integra Biosciences	144000	Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge	MilliporeSigma	20469	Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle	Becton Dickinson	309580	Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment	World Precision Instruments	14011	Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-346-15FM	Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution	MilliporeSigma	M5550	Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution	MilliporeSigma	M7145	Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor	MSA	814365	Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach	MilliporeSigma	M2378	Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit	Harvard Apparatus	72-1413	Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System	Illumina	770-2016-025-N	Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-540-15FM	Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors	SunMed	2001-01	Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer	Marshall Scientific	CO-PC420	Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride	MilliporeSigma	P9541	Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape	VWR	470042-938	Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge	MilliporeSigma	QGARD00D2	Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles	ThermoFisher Scientific	06-423A	Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set	Braun Medical	471960	Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride	MilliporeSigma	S3014	Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load)	ZymoBIOMICS	D6320	Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes	Professional Disposables International	H04082	Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank	Airgas	AI USP200	Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank	Airgas	OX USP200	Compressed oxygen tank for input to sparging system.