Diseño y desarrollo de un modelo para estudiar el efecto del oxígeno suplementario en el microbioma de las vías respiratorias de la fibrosis quística
Summary
El objetivo de este protocolo es desarrollar un sistema modelo para el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas de las vías respiratorias de la fibrosis quística. El medio de esputo artificial emula la composición del esputo, y las condiciones de cultivo hiperóxico modelan los efectos del oxígeno suplementario en las comunidades microbianas pulmonares.
Abstract
Se cree que las comunidades microbianas de las vías respiratorias desempeñan un papel importante en la progresión de la fibrosis quística (FQ) y otras enfermedades pulmonares crónicas. Los microbios se han clasificado tradicionalmente en función de su capacidad para usar o tolerar el oxígeno. El oxígeno suplementario es una terapia médica común administrada a personas con fibrosis quística (pwCF); sin embargo, los estudios existentes sobre el oxígeno y el microbioma de las vías respiratorias se han centrado en cómo la hipoxia (bajo nivel de oxígeno) en lugar de la hiperoxia (alto contenido de oxígeno) afecta a las comunidades microbianas pulmonares anaeróbicas predominantemente aeróbicas y facultativas. Para abordar esta brecha crítica de conocimiento, este protocolo se desarrolló utilizando un medio de esputo artificial que imita la composición del esputo de pwCF. El uso de la esterilización por filtro, que produce un medio transparente, permite que los métodos ópticos sigan el crecimiento de microbios unicelulares en cultivos en suspensión. Para crear condiciones hiperóxicas, este sistema modelo aprovecha las técnicas de cultivo anaeróbico establecidas para estudiar las condiciones hiperóxicas; en lugar de eliminar el oxígeno, el oxígeno se agrega a los cultivos mediante el sparging diario de botellas de suero con una mezcla de oxígeno comprimido y aire. El esputo de 50 pwCF se sometió a un sparging diario durante un período de 72 horas para verificar la capacidad de este modelo para mantener condiciones diferenciales de oxígeno. La secuenciación metagenómica con escopeta se realizó en muestras de esputo cultivadas y no cultivadas de 11 pwCF para verificar la capacidad de este medio para apoyar el crecimiento de microbios comensales y patógenos que se encuentran comúnmente en el esputo de fibrosis quística. Se obtuvieron curvas de crecimiento a partir de 112 aislamientos obtenidos de pwCF para verificar la capacidad de este medio de esputo artificial para apoyar el crecimiento de patógenos comunes de fibrosis quística. Encontramos que este modelo puede cultivar una amplia variedad de patógenos y comensales en el esputo cf, recupera una comunidad muy similar al esputo no cultivado en condiciones normóxicas y crea diferentes fenotipos de cultivo en condiciones variables de oxígeno. Este nuevo enfoque podría conducir a una mejor comprensión de los efectos imprevistos inducidos por el uso de oxígeno en pwCF en las comunidades microbianas de las vías respiratorias y los patógenos respiratorios comunes.
Introduction
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética caracterizada por una incapacidad para eliminar el moco espeso de los pulmones, lo que lleva a infecciones repetidas y disminución progresiva de la función pulmonar que a menudo resulta en la necesidad de un trasplante de pulmón o la muerte. El microbioma de las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (PTCF) parece rastrear la actividad de la enfermedad1,con una reducción de la diversidad microbiana asociada con resultados adversos a largo plazo2,3. En estudios clínicos de pwCF, la oxigenoterapia suplementaria se ha asociado con una enfermedad más avanzada4,5, aunque tradicionalmente, el uso de la oxigenoterapia se ha visto simplemente como un marcador de la gravedad de la enfermedad6. Estudios recientes de un ensayo clínico de pacientes con insuficiencia respiratoria han demostrado que los niveles más altos de oxígeno en los pacientes se asocian paradójicamente con un aumento de las infecciones bacterianas graves y una mayor mortalidad7,lo que sugiere que el oxígeno suplementario puede contribuir a la patogénesis de la enfermedad. El efecto del oxígeno suplementario sobre el microbioma pulmonar de la fibrosis quística y las comunidades microbianas pulmonares y respiratorias asociadas no se ha estudiado bien.
Los estudios mecanicistas a menudo no se pueden realizar directamente en sujetos humanos debido a dificultades logísticas y posibles problemas éticos asociados con intervenciones de beneficio o daño médico desconocido. Los enfoques traslacionales que integran bioespecímenes humanos en sistemas modelo pueden ofrecer importantes conocimientos biológicos en estos casos. Si bien la capacidad de usar o tolerar el oxígeno ha sido tradicionalmente un componente importante de la clasificación microbiana, se sabe poco sobre cómo la introducción terapéutica de oxígeno suplementario en el medio ambiente podría perturbar las comunidades microbianas de las vías respiratorias. Para arrojar luz sobre los efectos desconocidos del oxígeno suplementario en los microbiomas de las vías respiratorias de pwCF, necesitábamos abordar dos desafíos principales; primero, la creación de un medio de cultivo que se aproxime fisiológicamente a la composición del esputo cf; segundo, la creación de un sistema modelo que permita el mantenimiento de concentraciones elevadas de oxígeno en cultivo durante largos períodos de tiempo.
Los medios de esputo artificial (MAPE) se utilizan ampliamente para emular el esputo pulmonar ex vivo8,9,10,pero no hay un consenso claro sobre una receta específica. Este protocolo describe una receta de medio de esputo artificial y una estrategia de preparación cuidadosamente diseñada para aproximarse fisiológicamente al esputo de pwCF. La Tabla 1 describe los valores de la receta elegida en función de la literatura publicada. Los componentes químicos básicos y el pH se compararon con los valores identificados por los estudios de esputo de FQ humana11,12,13. Se añadieron nutrientes fisiológicos de baja concentración utilizando yema de huevo, que se incluyó como 0,25% del volumen final10,así como mezclas de vitaminas y metales traza14,15. La mucina, el componente clave del esputo16,se incluyó al 1% p/v14. Aunque requiere más mano de obra, se eligió la esterilización por filtro sobre la práctica más convencional de esterilización por calor para reducir los problemas potenciales de la desnaturalización inducida por el calor de los componentes esenciales de los medios10. Un beneficio adicional de la esterilización por filtro es que genera medios que son transparentes (la esterilización por calor puede crear medios turbios debido a la precipitación y coagulación de sales y proteínas), lo que permite que este medio de esputo artificial se utilice para seguir el crecimiento microbiano basado en aumentos en la turbidez.
Este sistema modelo para el cultivo hiperóxico se basa en técnicas de cultivo anaeróbico donde se agrega oxígeno en lugar de eliminarse, creando un modelo para el efecto del uso de oxígeno suplementario para pwCF. La Figura 1 y el protocolo de ahorro de oxígeno asociado describen los componentes de un sistema de ahorro de oxígeno, que se pueden obtener a bajo costo de proveedores generales de laboratorios y hospitales. Este sistema permite la mezcla de oxígeno comprimido y aire a concentraciones fijas que van desde el 21% hasta el 100% de oxígeno. La integración de un sensor de oxígeno permite verificar la concentración de la mezcla de gas de salida, así como verificar la composición del gas de salida de las botellas de suero previamente escasas para verificar que las condiciones de oxígeno se hayan mantenido dentro del rango deseado.
Este protocolo describe los procedimientos para crear un medio de esputo artificial, la construcción y el uso de un sistema de ahorro de oxígeno y la aplicación de ambos para cultivar esputo cf en condiciones diferenciales de oxígeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se desarrolló un modelo in vitro para estudiar el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas pulmonares. Este modelo, basado en medio de esputo artificial y sparging diario de botellas de suero, mantiene concentraciones elevadas de oxígeno y apoya el crecimiento de microbios identificados en esputo de pwCF.
Hay varios pasos críticos de este enfoque. La primera es la elección de usar la esterilización por filtro en lugar de la esterilización por calor …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parte de este trabajo se realizó en el Laboratorio de Biología Marina con el apoyo del Laboratorio de Biología Marina, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (número de subvención 5600373) y una donación de la Fundación Simons.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
Referências
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