Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Atemwegsmikrobiom
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, ein Modellsystem für die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Gemeinschaften der Mukoviszidose der Atemwege zu entwickeln. Künstliches Sputummedium emuliert die Zusammensetzung von Sputum, und hyperoxische Kulturbedingungen modellieren die Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf mikrobielle Lungengemeinschaften.
Abstract
Es wird angenommen, dass mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Mukoviszidose (CF) und anderer chronischer Lungenerkrankungen spielen. Mikroben wurden traditionell aufgrund ihrer Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, klassifiziert. Zusätzlicher Sauerstoff ist eine gängige medizinische Therapie, die Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) verabreicht wird. Bestehende Studien zu Sauerstoff und dem Mikrobiom der Atemwege haben sich jedoch darauf konzentriert, wie hypoxie (sauerstoffarm) und nicht Hyperoxie (hoher Sauerstoffgehalt) die überwiegend aeroben und fakultativen anaeroben mikrobiellen Lungengemeinschaften beeinflusst. Um diese kritische Wissenslücke zu schließen, wurde dieses Protokoll unter Verwendung eines künstlichen Sputummediums entwickelt, das die Zusammensetzung von Sputum aus pwCF nachahmt. Die Verwendung der Filtersterilisation, die ein transparentes Medium ergibt, ermöglicht optische Methoden, um das Wachstum von einzelligen Mikroben in Suspensionskulturen zu verfolgen. Um hyperoxische Bedingungen zu erzeugen, nutzt dieses Modellsystem etablierte anaerobe Kultivierungstechniken, um hyperoxische Bedingungen zu untersuchen; Anstatt Sauerstoff zu entfernen, wird den Kulturen Sauerstoff zugesetzt, indem täglich Serumflaschen mit einer Mischung aus komprimiertem Sauerstoff und Luft geschont werden. Sputum von 50 pwCF wurde über einen Zeitraum von 72 Stunden täglich gespart, um die Fähigkeit dieses Modells zur Aufrechterhaltung unterschiedlicher Sauerstoffbedingungen zu überprüfen. Die metagenomische Shotgun-Sequenzierung wurde an kultivierten und unkultivierten Sputumproben von 11 pwCF durchgeführt, um die Fähigkeit dieses Mediums zu überprüfen, das Wachstum von kommensalen und pathogenen Mikroben zu unterstützen, die häufig in Mukoviszidose-Sputum vorkommen. Wachstumskurven wurden aus 112 Isolaten von pwCF erhalten, um die Fähigkeit dieses künstlichen Sputummediums zur Unterstützung des Wachstums häufiger Mukoviszidose-Erreger zu überprüfen. Wir stellen fest, dass dieses Modell eine Vielzahl von Krankheitserregern und Kommensalen im CF-Sputum kultivieren kann, eine Gemeinschaft wiederherstellt, die dem unkultivierten Sputum unter normoxischen Bedingungen sehr ähnlich ist, und verschiedene Kulturphänotypen unter unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen erzeugt. Dieser neue Ansatz könnte zu einem besseren Verständnis der unvorhergesehenen Wirkungen führen, die durch die Verwendung von Sauerstoff in pwCF auf mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege und häufige Atemwegspathogene induziert werden.
Introduction
Mukoviszidose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, dicken Schleim aus der Lunge zu entfernen, was zu wiederholten Infektionen und fortschreitendem Rückgang der Lungenfunktion führt, was oft zu einer Lungentransplantation oder zum Tod führt. Das Atemwegsmikrobiom von Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) scheint die Krankheitsaktivität1zu verfolgen, wobei eine Verringerung der mikrobiellen Vielfalt mit unerwünschten Langzeitergebnissen verbunden ist2,3. In klinischen Studien mit pwCF wurde die ergänzende Sauerstofftherapie mit fortgeschrittenerenErkrankungen inVerbindung gebracht 4,5, obwohl traditionell die Verwendung der Sauerstofftherapie einfach als Marker für die Schwere der Erkrankung angesehen wurde6. Jüngste Studien aus einer klinischen Studie mit Patienten mit Atemversagen haben gezeigt, dass ein höherer Sauerstoffgehalt bei Patienten paradoxerweise mit einer Zunahme schwerer bakterieller Infektionen und einer höheren Mortalität verbunden ist7, was darauf hindeutet, dass zusätzlicher Sauerstoff zur Pathogenese der Krankheit beitragen kann. Die Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Lungenmikrobiom und die damit verbundenen mikrobiellen Lungen- und Atemwegsgemeinschaften wurde nicht gut untersucht.
Mechanistische Studien können aufgrund logistischer Schwierigkeiten und potenzieller ethischer Probleme im Zusammenhang mit Interventionen mit unbekanntem medizinischem Nutzen oder Schaden oft nicht direkt am Menschen durchgeführt werden. Translationale Ansätze, die menschliche Bioproben in Modellsysteme integrieren, können in diesen Fällen wichtige biologische Erkenntnisse liefern. Während die Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, traditionell ein wichtiger Bestandteil der mikrobiellen Klassifizierung war, ist wenig darüber bekannt, wie die therapeutische Einführung von zusätzlichem Sauerstoff in die Umwelt mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege stören könnte. Um die unbekannten Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf die Atemwegsmikrobiome von pwCF zu beleuchten, mussten wir uns zwei großen Herausforderungen stellen; erstens die Schaffung eines Kulturmediums, das sich physiologisch der Zusammensetzung von CF-Sputum annähert; zweitens die Schaffung eines Modellsystems, das die Aufrechterhaltung erhöhter Sauerstoffkonzentrationen in Kultur über längere Zeiträume ermöglicht.
Künstliche Sputummedien (ASM) werden häufig verwendet, um Lungenputum ex vivo8,9,10zu emulieren , aber es gibt keinen klaren Konsens über ein bestimmtes Rezept. Dieses Protokoll beschreibt eine künstliche Sputum-Medium-Rezeptur und Zubereitungsstrategie, die sorgfältig entwickelt wurde, um Sputum von pwCF physiologisch anzunähern. Tabelle 1 zeigt die ausgewählten Rezeptwerte basierend auf veröffentlichter Literatur. Grundlegende chemische Komponenten und pH-Wert wurden mit Werten abgeglichen, die durch Studien an menschlichem CF-Sputum11,12,13 identifiziertwurden. Niedrige Konzentration physiologische Nährstoffe wurden unter Verwendung von Eigelb, das als 0,25% des Endvolumens10enthalten war, sowie Vitamin- und Spurenmetallmischungen14,15hinzugefügt. Mucin, die Schlüsselkomponente von Sputum16,wurde mit 1% w/v14eingeschlossen. Obwohl arbeitsintensiver, wurde die Filtersterilisation der konventionelleren Praxis der Wärmesterilisation vorgezogen, um potenzielle Probleme durch hitzeinduzierte Denaturierung wesentlicher Medienkomponenten zu reduzieren10. Ein zusätzlicher Vorteil der Filtersterilisation besteht darin, dass transparente Medien erzeugt werden (Die Wärmesterilisation kann aufgrund der Ausfällung und Koagulation von Salzen und Proteinen trübe Medien erzeugen), so dass diese künstlichen Auswurfmedien verwendet werden können, um das mikrobielle Wachstum auf der Grundlage einer Erhöhung der Trübung zu verfolgen.
Dieses Modellsystem für die hyperoxische Kultur basiert auf anaeroben Kultivierungstechniken, bei denen Sauerstoff hinzugefügt und nicht entfernt wird, wodurch ein Modell für die Wirkung der zusätzlichen Sauerstoffnutzung für pwCF erstellt wird. Abbildung 1 und das zugehörige Sauerstoffsparging-Protokoll skizziert die Komponenten eines Sauerstoff-Sparging-Systems, das kostengünstig von allgemeinen Labor- und Krankenhauslieferanten bezogen werden kann. Dieses System ermöglicht das Mischen von komprimiertem Sauerstoff und Luft zu festen Konzentrationen im Bereich von 21% -100% Sauerstoff. Die Integration eines Sauerstoffsensors ermöglicht die Überprüfung der Konzentration des Ausgangsgasgemisches sowie die Überprüfung der Ausflussgaszusammensetzung von zuvor verschonten Serumflaschen, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffbedingungen im gewünschten Bereich eingehalten wurden.
Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Erzeugung eines künstlichen Sputummediums, den Aufbau und die Verwendung eines Sauerstoffsparsystems und die Anwendung beider auf DIE Kultur von CF-Sputum unter differentiellen Sauerstoffbedingungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, um die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Lungengemeinschaften zu untersuchen. Dieses Modell, das auf künstlichem Sputummedium und täglichem Sparging von Serumflaschen basiert, hält erhöhte Sauerstoffkonzentrationen aufrecht und unterstützt das Wachstum von Mikroben, die im Sputum von pwCF identifiziert wurden.
Es gibt mehrere kritische Schritte dieses Ansatzes. Erstens ist die Wahl, Filter-Sterilisation anstelle von Hitze…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ein Teil dieser Arbeit wurde im Marine Biological Lab mit Unterstützung des Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (Fördernummer 5600373) und einem Geschenk der Simons Foundation durchgeführt.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
Referências
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