Summary
이 프로토콜의 목표는 낭포성 섬유증 기도 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 위한 모형 시스템을 개발하는 것입니다. 인공 가래 배지는 가래의 조성을 모방하고, 과옥배양 조건은 폐 미생물 공동체에 대한 보충 산소의 효과를 모델링한다.
Abstract
기도 미생물 지역 사회는 낭포성 섬유증 (CF) 및 그밖 만성 폐 질병의 진행에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 생각됩니다. 미생물은 전통적으로 산소를 사용하거나 용인하는 능력에 따라 분류되었습니다. 보충 산소는 낭포성 섬유증을 가진 사람들에게 투여되는 일반적인 의학 치료입니다 (pwCF); 그러나, 산소와 기도 미생물군유전체에 대한 기존 연구는 아옥시아(high oxygen)가 아닌 저산소증(저산소)이 주로 호기성 및 촉진성 혐기성 폐 미생물 공동체에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞추고 있다. 이러한 중요한 지식 격차를 해결하기 위해 이 프로토콜은 pwCF의 가래 구성을 모방한 인공 가래 매체를 사용하여 개발되었습니다. 투명 배지를 산출하는 필터 살균을 사용하면 광학 방법이 서스펜션 배양에서 단세포 미생물의 성장을 따를 수 있습니다. 과산화 조건을 만들기 위해,이 모델 시스템은 hyperoxic 조건을 연구하기 위해 설립 혐기성 배양 기술을 활용; 산소를 제거하는 대신, 산소는 압축 산소와 공기의 혼합물과 혈청 병의 매일 스파깅에 의해 배양에 추가됩니다. 50 pwCF에서 가래는 차동 산소 조건을 유지하기 위해이 모델의 능력을 확인하기 위해 72-h 기간 동안 매일 스파깅을 겪었다. 산탄총 메타게놈 시퀀싱은 11 pwCF로부터 배양 및 비배양식 가래 샘플에서 수행되어 낭포성 섬유증 가래에서 흔히 발견되는 발생성 및 병원성 미생물의 성장을 지원하는 이 매체의 능력을 검증하였다. 성장 곡선은 일반적인 낭포성 섬유증 병원균의 성장을 지원하기 위해 이러한 인공 가래 배지의 능력을 확인하기 위해 pwCF로부터 얻은 112개의 분리물로부터 수득되었다. 우리는 이 모형이 CF 가래에 있는 병원균 및 교근의 다양한 문화가, normoxic 조건하에서 비배양되지 않은 가래와 매우 유사한 지역 사회를 복구하고, 다양한 산소 조건하에서 다른 문화 표현형을 창조할 수 있다는 것을 것을을 발견합니다. 이 새로운 접근은 기도 미생물 지역 사회와 일반적인 호흡 병원체에 pwCF에 있는 산소의 사용에 의해 유도된 예기치 않은 효력의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.
Introduction
낭포성 섬유증 (CF)은 폐에서 두꺼운 점액을 지우지 못하는 것을 특징으로하는 유전 질환으로, 반복되는 감염과 종종 폐 이식 또는 사망의 필요성을 초래하는 진보적 인 폐 기능 감소로 이어진다. 낭포성 섬유증(pwCF)을 가진 사람들의 기도 미생물군유전체는 질병 활동1을추적하는 것으로 나타났으며, 불리한 장기 결과2,3과관련된 미생물 다양성의 감소와 함께. pwCF의 임상 연구에서, 보충 산소 요법은 보다 진보된 질병4,5와연관되어 있다, 그러나 전통적으로, 산소 치료의 사용은 단순히 질병 심각도6에대한 마커로 간주되었습니다. 호흡기 부전 환자의 임상 시험에서 최근 연구는 높은 환자 산소 수준이 역설적으로 심각한 세균 감염의 증가와 관련된 것으로 나타났습니다7,보충 산소가 질병 병인에 기여할 수 있음을 시사. 낭포성 섬유증 폐 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과와 관련 폐 및 기도 미생물 공동체는 잘 연구되지 않았습니다.
기계학 연구는 종종 물류 어려움과 알 수없는 의료 혜택 이나 해의 개입과 관련된 잠재적 인 윤리적 문제로 인해 인간의 주제에 직접 수행 할 수 없습니다. 인간 바이오시편을 모델 시스템에 통합하는 번역 적 접근 법은 이러한 경우에 중요한 생물학적 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 산소를 사용하거나 용인하는 능력은 전통적으로 미생물 분류의 중요한 구성 요소였지만, 환경에 보충 산소의 치료 도입이 어떻게 기도 미생물 공동체를 방해할 수 있는지에 대해서는 거의 알려져 하지 않습니다. pwCF의 기도 미생물군유전체에 보충 산소의 알 수없는 효과에 빛을 비추기 위해, 우리는 두 가지 주요 과제를 해결해야했습니다. 첫째, CF 가래의 조성을 생리적으로 근사화하는 배양 배지의 생성; 둘째, 장기간 배양시 높은 산소 농도의 유지를 허용하는 모델 시스템의 생성.
인공 가래 매체(ASM)는 폐 가래 를모방하는 데 널리사용되며,9,10,특정 레시피에 대한 명확한 합의는 없다. 이 프로토콜은 pwCF에서 생리학적으로 대략적인 가래를 위해 신중하게 설계된 인공 가래 매체 레시피 및 준비 전략을 설명합니다. 표 1은 게시된 문헌을 기반으로 선택한 레시피 값을 간략하게 설명합니다. 기본 화학 성분 및 pH는 인간 CF 가래11,12,13의연구에 의해 확인된값과일치시켰다. 저농도 생리영양분은최종부10의0.25%로 포함된 달걀 노른자를 사용하였으며, 비타민및미량금속믹스(14,15)를첨가하였다. 가래16의핵심 성분인 Mucin은 1%w/v14로포함되었다. 더 많은 노동 집약적이지만, 필터 살균은 필수 미디어 성분의 열 유도 데마튜레이션으로부터 잠재적인 문제를 줄이기 위해 열 살균의 전통적인 관행을 통해선택되었다(10). 필터 살균의 또 다른 이점은 투명한 매체를 생성한다는 것입니다 (열 살균은 소금과 단백질의 강수량 및 응고로 인해 탁구 미디어를 만들 수 있습니다), 이 인공 가래 매체는 탁도의 증가에 따라 미생물 성장을 따르는 데 사용할 수 있도록.
과옥배양을 위한 이 모델 시스템은 산소가 제거되지 않고 첨가되는 혐기성 배양 기술을 기반으로 pwCF에 대한 산소 보충 사용의 효과를 위한 모델을 생성한다. 도 1 및 관련 산소 스파깅 프로토콜은 일반 실험실 및 병원 공급 업체로부터 저렴한 비용으로 얻을 수있는 산소 스파징 시스템의 구성 요소를 간략하게 설명합니다. 이 시스템은 압축 산소와 공기를 21%-100% 산소에 이르는 고정 농도로 혼합할 수 있게 합니다. 산소 센서의 통합을 통해 출력 가스 혼합물의 농도를 검증할 수 있을 뿐만 아니라 이전에 분리된 혈청 병의 유출 가스 조성을 확인하여 산소 조건이 원하는 범위 내에서 유지되었는지 확인할 수 있습니다.
이 프로토콜은 인공 가래 매체를 만드는 절차를 간략하게 설명하고, 산소 스파깅 시스템의 구성 및 사용, 및 차동 산소 조건하에서 배양 CF 가래에 둘 다의 적용을 한다.
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Protocol
이 연구는 파트너 기관 검토 위원회 (프로토콜 # 2018P002934)의 승인을 받았습니다. 포함 기준은 낭포성 섬유증을 가진 성인 환자를 포함한 연구 결과에 대한 서면 통보 된 동의를 제공. 배제 기준은 없었다. 프로토콜 지침에 따르면, 모든 가래 샘플은 임상 공급자와 예정된 외래 환자 방문 중에 낭포성 섬유증 환자로부터 수집되었습니다.
1. 인공 가래 중간 준비
참고: 여기에 나열된 수량은 최종 인공 가래 매체 의 1 L의 생산을 위한 것이며 재료 표에나열된 특정 시약을 가정합니다. 동일한 최종 제품을 보장하기 위해 다른 볼륨또는 다른 시약을 사용하기 위해 숫자를 조정해야 합니다. 대상 농도의 표 1을 참조하십시오.
- 인공 가래 화학 혼합 (ASCM)
참고: ASCM은 최종 중간 량의 25%를 차지합니다. 선반안정이며 대량 또는 사전에 준비할 수 있습니다. 나중에 사용할 준비가되면 화학 혼합물을 오토클레이브하고 실온에서 안전하게 보관하십시오.- 성분 화학 주식 솔루션을 혼합합니다.
- M NaCl 스톡 1개 준비: 멸균수 리터당 58.44g의 NaCl을 추가합니다.
- 1 M KCl 스톡 준비: 멸균 수의 리터 당 KCl 74.55 g를 추가합니다.
- 준비 1 M MgSO4 재고: MgSO4·7H2O 의 MgSO 4,47 g, 또는 멸균 수의 리터 당 120.37 g를 추가 하십시오.
- 1M 포도당 육수를 준비: 멸균 수의 리터 당 포도당 180.16 g를 추가하십시오.
- 오토클레이브는 화학 적 재고 솔루션뿐만 아니라 빈 250 mL 병을 살균합니다. 30분 동안 121°C 및 15 PSI의 적어도 표준 값으로 자동 절제 단계를 수행합니다.
- 빈 250mL 병에 멸균 수의 80.59 mL을 추가합니다.
- 믹스에 1 M NaCl 스톡의 152.30 mL을 추가합니다.
- 믹스에 1 M KCl 스톡의 15.8 mL을 추가합니다.
- 믹스에 1 M MgSO4 스톡의 610 μL을 추가합니다.
- 믹스에 1 M 포도당 스톡의 700 μL을 추가합니다.
- 성분 화학 주식 솔루션을 혼합합니다.
- 인공 가래 뮤신 믹스 (ASMM)
참고: ASMM은 최종 중간 볼륨의 50%를 차지합니다. 최종 중간 배치와 같은 날에 준비되었는지 확인합니다.- 빈 1 L 병에 멸균 물 450mL를 추가합니다.
- 병에 10x 인산염 완충식식염(PBS)의 50mL를 추가합니다.
- 병에 일회용 마그네틱 교반 바를 추가합니다.
- PBS와 교반 바가 들어 있는 병을 자동 복제합니다.
- 뮤신 파우더 10g을 측정하고 PBS에 추가합니다.
- 예비 믹싱을 위해 병을 힘차게 흔들어 주세요.
- 마그네틱 교반기로 병을 핫 플레이트에 놓습니다. 50°C를 대상으로 중간 고체로 열을 설정하고 1100 rpm으로 교반 속도를 설정합니다. 바가 자석에서 날지 않도록 속도를 서서히 증가시킵니다.
- 가열하고 15 분 동안 저어.
- 내열 장갑으로 병을 집어 들십시오. 뮤신 파우더가 용액에서 정착하는지 확인하십시오.
- 뮤신 파우더가 완전히 용해되지 않으면 병을 완전히 용해 될 때까지 5 분 간격으로 가열 / 교반기로 돌려줍니다.
- 뮤신 믹스를 실온으로 식힙니다.
- 인공 가래 생물학적 혼합 (ASBM)
참고: ASBM은 최종 중간 량의 25%입니다. 최종 중간 배치와 같은 날에 준비하고 다른 믹스와 달리 구성 요소를 열에 노출시키지 마십시오.- 4°C 냉장고 또는 얼음에 100x 비타민 육수를 해동하십시오.
참고: 비타민 육수를 10mL 알리쿼트에 미리 분배하여 동결/해동 주기 수를 최소화합니다. - 빈 오토클레이브 250mL 병에 멸균 수의 124.24 mL을 추가합니다.
- 믹스에 50x 필수 아미노산 스톡의 25.76 mL을 추가합니다.
- 혼합에 100x 비 필수 아미노산 스톡의 80.14 mL을 추가합니다.
- 믹스에 10 mL (해동) 100 x 비타민 육수를 추가합니다.
- 믹스에 1000x 미량 금속 스톡 1mL를 추가합니다.
- 혼합에 30 % 달걀 노른자 에멀젼의 8.33 mL을 추가합니다.
- 믹스에 10 g / L 페리틴 재고의 400 μL을 추가합니다.
- 수동 흔들림을 통해 솔루션을 잘 섞습니다.
- 4°C 냉장고 또는 얼음에 100x 비타민 육수를 해동하십시오.
- 인공 가래 매체 (ASM)
- ASMM이 포함된 1L 병에 ASCM 250mL를 추가합니다.
- 중간 병에 ASBM 250mL를 추가합니다.
- 기본 MOPS 버퍼(1M)로 배지를 적시하여 좁은 범위 pH 용지에서 6.3의 pH에 도달합니다. 적정 전에, 중간 혼합은 너무 산성 될 것입니다.
- 여과준비가 될 때까지 결과 인공 가래 매체를 4°C에서 냉장 보관합니다.
- 여과 공정을 시작하려면 필터링되지 않은 인공 가래 배지 200mL을 0.22 μm 모공 크기 필터가 있는 진공 여과 시스템으로 이송합니다.
- 여과 시스템을 진공 펌프에 연결하고 진공 펌프를 켜고 70mbar로 설정한 다음 4 °C의 차가운 방에서 90 rpm에서 흔들리는 궤도 셰이커에 챔버를 놓습니다.
- 상당한 양이 필터링됨에 따라 배지의 추가 150mL로 위로 를 드시면 됩니다. 1L의 중간을 완전히 걸게 하는 데 1-2일이 걸립니다.
- 모든 용지가 필터링될 때까지 추가 챔버로 반복합니다.
참고: mucin이 시간이 지남에 따라 필터를 연결하기 때문에 동일한 0.22 μm 필터를 통해 매체의 350mL 이상을 필터링하지 않도록 하십시오.
- 여과된 인공 가래 매체를 4°C에서 냉장 보관하여 사용할 준비가 될 때까지 냉장 보관합니다. 최상의 결과를 위해 준비 한 달 이내에 ASM을 사용합니다.
2. 산소 스파깅
- 스파깅 스테이션 설정
참고: 이 프로토콜은 한 번만 완료해야 하며, 그 후에필요한 간단한 유지 관리를 통해 설정을 유지할 수 있습니다. 산소 스파기 시스템의 시각적 회로도는 그림 1을 참조하십시오.- 압축 공기 및 산소 탱크를 확보하고 적절하게 고정하십시오.
주의: 고압으로 인해 탱크를 잘못 다룰 때 매우 위험합니다. 탱크가 완전히 밀봉되고 고정되어 있는지, 탱크가 닫히면 누출이 없으며 모든 취급 인력이 완전히 사용하도록 하십시오. - 렌치가 있는 압축 공기 탱크에 공기 레귤레이터를 부착합니다. 레귤레이터에서 최적의 흐름 판독을 위해 레귤레이터를 가능한 한 똑바로 세워 두는 위치에 부착하십시오.
- 압축 된 산소 탱크에 산소 레귤레이터를 부착하여 가능한 한 똑바로 세워 놓습니다. 산소 탱크에 따라 조여기 방향으로 반전해야 할 수도 있습니다.
- 레귤레이터의 튜브를 Y 커넥터에 연결하여 두 탱크의 가스 흐름을 결합합니다.
- Y 커넥터의 출력을 중앙 T-접합 밸브에 연결합니다.
- 중앙 T-접합 밸브의 한쪽을 가스 압력 게이지에 연결합니다.
- 가스 압력 게이지의 다른 쪽을 0.22 μm 모공 크기의 25mm 직경멸균 주사기 필터에 연결합니다.
- 두 번째 25mm 직경 주사기 필터를 감미 전 시 가스 방출로 사용할 플런저 없이 주사기에 부착합니다.
- 중앙 T-접합 밸브의 마지막 면을 산소 모니터의 두 번째 T 접합 밸브에 연결합니다.
- 25mm 직경 주사기 필터를 이 두 번째 T-접합 밸브의 한쪽에 연결하고 튜브와 함께 18G 바늘을 부착합니다.
- 제2 T-접합 밸브의 마지막 면을 산소 모니터링 장치에 연결합니다.
- 모니터링 하는 동안 가스 방출로 사용할 산소 모니터링 장치의 반대편에 컷오프 튜브를 연결합니다.
주의: 산소 스파기 시스템을 테스트/사용할 때T-접합의 위치를 주의 깊게 살펴보고 시스템을 통과하는 의도된 경로와 일치하는지 확인합니다. 이렇게 하지 않으면 시스템 내부의 압력 축적이 발생하고 구성 요소가 실패하고 분해됩니다. - 시스템의 유지 보수와 최적의 성능으로 작동하도록 하려면 다음 관행이 유용합니다.
- 분리된 양의 Teflon 테이프와의 연결을 강화하여 씰을 크게 개선하고 내부 압력에서 분리되는 구성 요소의 가능성을 줄입니다.
- 최대 압력을 완화하고 오류를 방지하기 위해 결합 된 유량은 10 L / min 미만을 유지합니다.
- 누출이 의심되는 경우, 가스 누출 보다 거품이 발생하므로 시판되는 액체 누출 감지기와 같은 세제 용액을 사용하여 해당 위치를 쉽게 식별할 수 있습니다. 폴리테트라플루오로틸렌 테이프(예: 테플론)를 사용하여 누수 패치.
- 산소 스파기 시스템에서 25mm 직경 주사기 필터를 격주마다 교체하지만 사용 빈도에 따라 다릅니다. 시간이 지남에 따라 필터에 걸린 입자는 가스 유량을 줄이고 압력 축적을 유발합니다.
- 측정을 수행하기 전에 산소 모니터를 산소 압축 공기를 21%로 보정합니다.
- 시스템 사용이 완료되면 탱크를 끄고 흐름이 완전히 멈출 때까지 레귤레이터에서 과도한 가스를 출혈합니다.
- 압축 공기 및 산소 탱크를 확보하고 적절하게 고정하십시오.
- 세럼 병 문화 스파깅
- 샘플 식별자, 접종 날짜/시간 및 표적 산소 백분율로 500mL 자동 혈청 병을 라벨로 지정합니다.
- 생물학적 후드에 인공 가래 배지의 24mL을 설정 중인 각 혈청 병에 추가합니다.
- 각 혈청 병에 18G 바늘로 균질화 된 환자 가래 1 mL (각 배양 조건에 대한 충분한 양의 샘플을 얻기 위해 필요한 경우 멸균 식염수로 희석)를 추가하십시오.
- 멸균 핀셋을 사용하여 오토클레이브 고무 스토퍼를 각 세럼 병 의 상단에 놓습니다.
- 고무 스토퍼를 누르고 스토퍼의 밑면을 손으로 만지지 않도록주의하십시오.
- 후드에서 병을 제거하고 알루미늄 씰을 바르고 압착합니다. 씰에서 중앙 조각을 제거합니다.
- 술 닦아병 의 상단을 닦아 분젠 버너 불꽃을 통해 전달합니다.
- 멸균 18-G 바늘을 플런저리스 주사기에 필터를 부착합니다. 이 가스 방출을 병에 먼저 삽입합니다.
- 멸균 18-G 바늘을 시스템에서 가스 출력에 부착하고 가스 출력 바늘을 병에 삽입합니다.
- 탱크에서 산소 모니터를 통해 T-접합을 라우팅합니다. 대상 산소 농도가 시스템을 통해 흐르는지 확인합니다. 약 5 L/분의 가스 흐름을 목표로 합니다.
- 탱크에서 가스 출력으로 T-접합을 다시 라우팅합니다. 가스가 혈청 병을 통해 흐르기 시작합니다.
주의: 산소 스파징 중 압력 게이지에 주의를 기울이세요. 압력이 예기치 않게 증가하면 즉시 시스템을 종료하십시오. - 혈청 병을 통해 산소 스파지를 1 분 동안 실행합니다. 5 L/min에서 10개의 항공 교환을 허용하고 내부 대기가 원하는 부분 압력에 도달할 수 있습니다.
- 가스 방출 18-G 바늘을 제거합니다.
- 혈청 병의 압력이 +1 대기 (해수면의 대기 2)로 구축 한 다음 즉시 가스 출력 바늘을 제거합니다.
참고: 압력을 유지하여 시간이 지남에 따라 hyperoxic 조건을 유지합니다. - 혈청 병을 37°C 인큐베이터 셰이커에 150 RPM에 넣습니다. 3개의 24-h 간격에 대한 샘플을 배양합니다. 각 24-h 간격에서, 다운스트림 분석을 위해 알리쿼트를 취하고, 샘플을 다시 분리하고, 72h의 총 배양 시간 동안 인큐베이션으로 돌려보세요.
- 유출 산소 측정
- 산소 계수를 압축 공기를 21%로 보정한 다음 탱크를 끕니다.
- 혈청 병 섭취를 산소 모니터를 통해 라우팅하고 멸균 바늘을 끝까지 부착합니다.
- 고무 스토퍼를 통해 바늘을 혈청 병에 삽입합니다.
- 유출 판독이 안정화될 때까지 기다립니다. 혈청 병에서 낮은 유량은 최대 2 분이 걸릴 수 있음을 의미합니다. 객실 공기와 가장 큰 차이를 보고합니다(21%에서 가장 먼 숫자).
- 여러 판독값을 수행하는 경우 판독값 사이에 압축 공기로 시스템을 플러시합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 매사추세츠 주 보스턴에 있는 매사추세츠 종합 병원에 있는 외래 환자 낭포성 섬유증 진료소에 일상적인 배려를 위해 제출하는 pwCF에서 50의 예상한 가래 견본에 적용되었습니다. 각 환자의 가래는 인공 가래 매체를 사용하여 21%, 50%, 산소 100% 산소 조건 하에서 배양되었으며, 각 배양에서 0.5mL 알리쿼트가 24시간, 48h, 72h의 배양 시간으로 배양하였다. 시각적 변화를 추적하기 위해 추출할 때 문화가 촬영되었습니다. 또한, 각 1차 가래 샘플의 0.5mL 알리쿼트(aliquot)는 배양 전에 채취하였다. 이로 인해 환자당 10개의 개별 샘플과 500개의 샘플의 최종 N이 발생했습니다. 이들 중 11명의 환자(11명의 배양되지 않은 스푸타, 11개의 배양스스퍼타, 11개의 배양된 스푸타에서 48h의 인큐베이션에서 산소)가 핵산 추출17을받았으며, 시퀀싱 라이브러리는 상업용 DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성되었으며, 메타게노믹 시퀀싱 플랫폼은 전체 게놈 시퀀싱 플랫폼 ~55쌍에서 15개의 기저시퀀싱 을 실시하였다. 페어링 된 끝 읽기. 원시 읽기는 메타플란3 프로파일러(19)를 이용한 인간 "오염물질" 서열 및 분류계 프로파일링을 포함하는 바이오베이커리도구(18)를사용하여 처리되었다. 핵산 추출 시, 인간 미생물 공동체가 아닌 하구 생태계에서 일반적으로 발견되는 할로관용 종인 1천만 개의 임테텔라 할로탈레란세포가각 시료로 스파이크되어 각샘플(20)에대한 절대 미생물 하중의 정량화를 가능하게 하였다.
도 2는 각 산소 조건 하에서 배양된 50개의 가래 샘플에 대한 배양 과정의 과정을 통해 개별 및 평균 유출 산소 측정 및 pH 수준을 나타내며 시각적 차동 배양 표현형의 예이다. 배양은 샘플 알리쿼트의 스파징 및 제거가 수행된 짧은 기간을 제외하고 37°C에서 유지되었다. 12h와 24h의 간격을 모두 절약한 결과, 산소 농도가 유지되었지만, 세 가지 산소 조건 모두에 대해 시간이 지남에 따라 하락이 관찰되었지만 100% 산소는 약 85%, 산소가 약 85%, 산소가 40%로 떨어지고 21%는 산소가 18%로 떨어졌다. 산소 조건은 뚜렷하게 남아 있었고, 중요한 것은, 높은 산소 농도는 hyperoxic 견본을 위한 프로세스 내내 유지되었습니다. pH 측정은 가변성의 더 큰 정도를 보여주었지만 시간이 지남에 따라 통계적으로 유의한 변화가없는 생리학적으로 정상 범위 내에 잘 머물렀다. 이러한 측정은 이러한 방법이 배양 과정 전반에 걸쳐 이산 차동 산소 조건을 유지함을 나타낸다. 마지막으로, 산소 농도를 통해 분화된 많은 시각 배양 표현형 중 하나의 예가 나타난다. 이 샘플은 낮은 시각적 탁도와 관련된 더 높은 산소와 문화의 72 시간 후 탁도 차이를 표시했다. 차동 배양 표현형은 문화 공동체에 대한 아구시아 유도 효과의 존재를 지원합니다.
도 3는 비배양양자 가래와 배양된 가래(48h 의 기간 동안 21%의 산소 상태) 사이의 미생물 부하, 미생물 다양성 및 미생물 공동체 조성물을 비교합니다. 측정은 배양되지 않은 가래에 비해 미생물 하중의 약 20배 증가로 배양행위에 의해 도입된 유일한 주요 차이점을 드러낸다. 면역 계통 및 기침과 같은 전형적인 기계적인 가래 통관 기계장치는 일반적으로 pwCF에서 보인 것과 같은 기능 장애 및 감염의 경우에, 폐에 있는 미생물 부하를 제한하는 규정 프로세스로 봉사합니다. Ex vivo 문화는 그러한 규제 메커니즘이 없으며 미생물 공동체는 대신 세포 포화로 진행할 수 있습니다. 알파 및 베타 다양성 지표는 미생물 부하의 차이에도 불구하고, 기본 커뮤니티 구성은 문화 과정에 의해 도입 된 최소한의 글로벌 차이와 함께 잘 보존 남아 있음을 나타냅니다.
도 4는 11명의 환자로부터 얻은 배양 및 비배양비가 11명으로부터 얻은 산탄총 메각지노믹스에 의해 결정적으로 확인된 120개의 미생물 종의 이진 존재/부재를 살펴보면, 비배양및 배양된 가래 샘플 사이의 비교를 확장한다. 미생물은 계통 유전학 유사성에 근거를 둔 군집됩니다. 이들 종의 46개(38.3%)는 비배양시 및 배양시(시안색)에서 모두 확인되었으며, 35개(29.2%)는 비배양식 시료(yellow)와 39개(32.5%)에서 독점적으로 식별되었다.( 청색). 우리가 존재하는 것과 결석한 것의 관점에서 시퀀싱을 사용하여 확인한 것보다 더 큰 패리티가 있을 가능성이 높지만, 일부 택시는 경우에 따라 시퀀싱 검출 임계값 이하로 떨어집니다. 차이점은 문화 과정이 비배양 양봉에 비해 배양에 약간의 편견을 도입한다는 것을 나타냅니다. 특히, 배양은 칸디다와 아스퍼길루스와같은 곰팡이의 존재뿐만 아니라 에셀리치아, 세라티아, 연쇄상 구균 회원을 포함한 엔테로박테라알레스 회원들의 존재를 증가시킵니다. 반대로, 혐기성 인 Prevotella와 클로스트리디알레스와 같은 박테로이드 회원들은 배양되지 않은 샘플에 존재했지만 배양 된 샘플에는 존재하지 않았습니다. 이것은 우리의 실험 모형에 있는 혐기성 조건의 부족에 기인할 지도 모릅니다.
도 5는 50개의 상이한 pwCF로부터 얻어진 가래로부터 분리된 일반적인 CF 폐 병원균의 흡수기반 성장 곡선을 나타낸다. 이들 분리제는 매사추세츠 종합병원 임상미생물학연구소로부터 농축 배양 절차를 사용하여 수득된 페노전상 상이한 임상 분리를 나타내며, 슈도모나스 아루기노사(N= 53), 황색포도상구균(N= 37), 스테노트로폰스 말토필리아(N= 12), 클레브세포(N= 12), 클레브시(N= 12), 클렙스(Nmobe)를 나타낸다. (N = 7). 성장 곡선은 어두운 37°C에서 인공 가래 매체에서 각각 의 분리를 배양하여 얻어졌으며, ASMsans 세균 접종은 음의 대조군역할을 한다. ASM의 투명한 품질(열 살균이 아닌 필터로 인한)을 통해 성장 곡선을 추정하기 위한 광학 적 조치를 수행할 수 있습니다. 600nm(OD600)의 광학 판독값은 10분마다 촬영되었으며, 각 곡선의 첫 24h가 표시됩니다. ASM 전용 음수 제어에서 광학 판독값이 변경되지 는 않습니다. 여기에 표시된 데모 곡선은 흡수성 성장 곡선 생성을 위한 매체로서 이 ASM 레시피의 생존가능성을 나타내는 일반적인 성장 곡선 패턴을 따릅니다.
| 열 1 | 열 2 | 열 3 | 열 4 | 열 5 | 열 6 | 열 7 | 열 8 | 열 9 | |
| 값 | 컴스톡 | 키르치네르 | 스리라말루 | 팔 머 | 플 린 | 갤러거 | 라이 (주) | 근원 | |
| 뮤신 (주) | 2% w/v | 0.5% w/v | 0.5% w/v | - | 1% w/v | 2% w/v | 1% w/v | 플 린 | |
| 소금 | 85.5 mM | 85.5 mM | 85.5 mM | 66.6 mM | 89.8 mM | 85.5 mM | 152.3 mM | 라피에르 (Lapierre)는 | |
| 염화칼륨 | 29.5 mM | 29.5 mM | 29.5 mM | 15.8 mM | - | 2.95 mM | 15.8 mM | 팔 머 | |
| 황산 마그네슘 | - | - | - | 0.6 mM | 1 mM | 1 mM | 0.61 mM | 팔 머 | |
| 철 황산염 | - | - | - | 0.0036 mM | - | - | - | - | |
| 염화암모늄 | - | - | - | 2.3 mM | 60mM | - | - | - | |
| 모노칼륨 인산염 | - | - | - | 2.5 mM | 60mM | - | - | - | |
| 포도당 | - | - | - | 3.2 mM | 13 mM | 40mM | 0.7 mM | 삼벡 | |
| 락테이트 | - | - | - | 9mM | - | - | - | - | |
| 필수 아미노산 | 14.45x | 0.25 g/L | 0.25 g/L | 산당 | 0.5배 | 0.375x | 1.29x | 팔 머 | |
| 비필수 아미노산 | 28.9x | 0.25 g/L | 0.25 g/L | 산당 | 0.25x | 0.5배 | 8.01x | 팔 머 | |
| 비타민 | - | - | - | - | - | 1x | 1x | 갤러거 | |
| 트레이스 메탈 | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | 플 린 | |
| 달걀 노른자 | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | 키르치네르 | |
| 페리틴 () | 0.0003 g/L | - | - | - | - | 0.0004 g/L | 0.0004 g/L | 갤러거 | |
| 연어 정자 DNA | 1.4 g/L | 4 g/L | 4 g/L | - | - | 1.4 g/L | - | - | |
| DPTA | - | - | 0.0059 g/L | - | - | - | - | - | |
| pH | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | 라피에르 (Lapierre)는 | |
| 보관 | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | 키르치네르 | |
| 멸균 | 오토 클레이 브 | 필터 | 오토 클레이 브 | - | 오토 클레이 브 | 오토 클레이 브 | 필터 | 키르치네르 | |
표 1: 문학의 검토에서 파생 된 인공 가래 매체 조리법. (열1) 인공 가래 배지의 제형에 시약 및 핵심 값. (열2-7) 현존문학8,9,10,12,14,15에서조리법의 비교 . (열8-9) 본 프로토콜에 상세히 설명된 인공 가래 매체 레시피및 각 선택된값(10,11,12, 13,14,15)을통보한 해당 소스.
| 열 1 | 열 2 | 열 3 |
| CF 스푸텀 | ASM | |
| 총 아미노산 | 10.25 mM | 10.76 mM |
| 알라닌 | 0.96 mM | 0.80 mM |
| 아르기닌 | 0.17 mM | 0.94 mM |
| 아스파라진 | 0.91 mM | |
| 아파르산 | 0.45 mM | 0.80 mM |
| 시스테인 | 0.09 mM | 0.33 mM |
| 글루타믹 산 | 0.84 mM | 0.80 mM |
| 글리신 | 0.65 mM | 0.80 mM |
| 히스티딘 | 0.28 mM | 0.35 mM |
| 이솔루신 | 0.60 mM | 0.52 mM |
| 신 | 0.87 mM | 0.52 mM |
| 리신 () | 1.15 mM | 0.64 mM |
| 메티오닌 | 0.34 mM | 0.13 mM |
| 오르니틴 | 0.36 mM | |
| 페닐알라닌 | 0.29 mM | 0.26 mM |
| 프롤린 | 0.90 mM | 0.80 mM |
| 세린 () | 0.78 mM | 0.80 mM |
| 트레오닌 | 0.58 mM | 0.52 mM |
| 트립토판 | 0.07 mM | 0.06 mM |
| 티로신 | 0.43 mM | 0.26 mM |
| 볼린 () | 0.60 mM | 0.52 mM |
표 2: 이전에 낭포성 섬유증 가래및 이 프로토콜에 자세히 설명된 인공 가래 매체 레시피에 기술된 아미노산 농도. (열1) 주요 아미노산. (열2) 낭포성 섬유증을 가진 사람들로부터 가래의 아미노산 농도(12). (열3) 이 프로토콜에 자세히 설명된 인공 가래 매체의 아미노산 농도
그림 1: 산소 스파기 시스템 구성 요소의 연결 회로도. 혈청 병을 21%에서 100% 사이의 원하는 산소 농도로 분리하는 데 사용되는 시스템의 구성 요소 간의 연결 흐름 다이어그램. 이 시스템은 두 개의 T-접합 밸브의 위치에 따라 결정된 3가지 사용 모드가 있습니다. 이 시스템은 탱크에서 가스 출력 또는 산소 백분율 모니터를 통해 가스를 라우팅할 수 있으며, 모니터를 통해 이전에 분리된 혈청 병에서 배출가스를 라우팅하여 시간이 경과한 후 농도를 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 표적 산소 농도는 대략 12h 및 24 h 스파징 간격으로 유지되며, pH는 배양 중에 생리범위에 남아 있다. (A)72-h 기간 동안 12h 및 24h 산소 스파기 간격으로부터 산소 판독값을 유출한다. (B)매 24시간(C) 72h이후 배양시 CFB010의 예상, 산소 농도에 걸쳐 차도 탁도를 나타내는 샘플에 대한 pH 판독값. 색상은 대상 산소 백분율을 나타냅니다. 오류 막대는 95% 신뢰도 간격을 나타냅니다. 임계 임계값은 파선으로 강조됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배양은 미생물 부하를 증가하지만 기본 커뮤니티 구성이 유지됩니다. 48h용 21%의 산소로 인공 가래 매체를 이용한 비배양비(yellow) 및 배양 가래(blue). Aliquots는 핵산 추출 및 산탄총 메타게노믹스 를 시퀀싱하여 배양 조건에서 도입 된 가능한 편견을 감지했습니다. (A)절대 미생물 부하(스파이크 인 컨트롤에 의해 결정) 및 알파 다이버시티 메트릭. 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 배양되지 않은 가래는 미생물 하중을 예측하지만 알파 다이버시티는 예측하지 못했습니다. (B)베타 다이버시티 메트릭의 처음 두 구성 요소의 성임, 미생물 부하의 차이 제어. PERMANOVA 이후 두 메트릭에 큰 차이가 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 식별 된 세금의 대부분은 소스 가래와 문화 모두에 존재하며 다른 사람들은 소스 가래 또는 문화에만 나타납니다. 산탄총 메라지노믹스 시퀀싱은 비배양문화와 배양된 가래 샘플 사이의 미생물 공동체 구성의 차이를 비교하는 데 사용됩니다. 서열 시원시 샘플에서 모든 확인 된 미생물 종의 필로 유전학 나무 (N = 120). 노란색으로 표시된 종(N = 35, 29.2%)은 비배양식 가래 샘플에서만 볼 수 있었습니다. 파란색으로 표시된 종(N = 39, 32.5%)은 인공 가래 배지 배양 샘플에서만 볼 수 있었다. 시안(N=46, 38.3%)으로 표시된 종은 비배양 시료와 배양 된 샘플 모두에서 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 인공 가래 배지는 임상 분리를 배양하기 위한 성장 곡선 매체로 사용할 수 있을 정도로 투명하다. 600 nm에서 최적의 밀도 판독값은 10분마다 촬영되었으며, 각 곡선의 첫 24h가 표시됩니다. 회색 선은 개별 판독값을 나타내며 주황색 선은 각 분류에 대한 평균 흡광도를 나타냅니다. 인공 가래 중간 블랭크는 대조군으로 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는, 체외 모형은 폐 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 연구하기 위하여 개발되었습니다. 이 모델은 인공 가래 매체와 혈청 병의 일일 스파깅을 기반으로 산소 농도가 상승하여 pwCF에서 가래로 확인된 미생물의 성장을 지원합니다.
이 방법의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 인공 가래 매체의 열 살균보다는 필터 살균을 사용하는 선택입니다. 필터 멸균은 뮤신 및 기타 열에 민감한 성분의 절전을 방지하고 미생물 성장의 광학 측정에 사용할 수 있는 명확한 매체를 생성합니다. 다른프로토콜(10)에서필터 멸균이 제안되었지만, 준비된 매체의 최소량이 여과되었을 때 그렇지 않으면 발생하는 필터의 막힘을 방지하기 위해 여과 과정에서 궤도 흔들림을 첨가하는 것이 필수적이라는 것을 발견했습니다. 여과된 인공 가래 배지는 필터내의 머신 내막 작용으로 인해 의도된 최종 뮤신 농도보다 낮을 수 있지만, pwCF의 가래는 낭포성섬유증이없는 사람으로부터 가래보다 뮤신 농도가 낮은 것으로 나타났다. 이 프로토콜에 사용되는 1%의 시작 뮤신 농도는 필터 멸균을 사용한 다른 접근법보다 높으며, 일반적인 레시피는 0.5%-2%(표1)에이르는 뮤신 농도를 사용하는 반면, 한 그룹은 0.5%-10의 시작 뮤신 농도를 사용한다. 따라서, 필터 멸균 공정에서 뮤신의 손실이 있더라도, 이 프로토콜을 사용하여 제조된 최종 배지는생리범위(22)내의 무신 농도를 가질 가능성이 있다.
두 번째는 인공 가래 매체의 조성이다. 인공 가래 매체에 대한 조리법은 pwCF(표 1)에서가래의 기존 생리학적 연구에 따라 선택되었다. 산탄총 메타게노믹스 시퀀싱을 사용하여, 우리는 이 인공 가래 매체로 배양된 가래가 비배양적 가래의 미생물 공동체 조성을 광범위하게 재구성한다는 것을 확인할 수있었다(도 3). 노목 조건에서, 이 매체는 또한 낭포성 섬유증 환자의 가래에서 분리된 일반적인 병원체를 대표하는 112개의 다른 임상 분리의 성장을 지원했습니다. 따라서, 이러한 데이터는 이러한 인공 가래 매체의 이러한 제형이 pwCF로부터기도 미생물의 성장을 지원한다는 것을 보여준다. 연어 정자 DNA, 기존 조리법에 일반적인 추가(표 1),생략 되었다. 이 모델의 한 가지 의도된 적용은 메타게노믹스 염기서열분석이며, 따라서 연어 정자 DNA는 비미생물 핵산의 첨가를 줄이기 위해 포함되지 않았으며, 이러한 판독은 시퀀싱 후 필터링될 것이기 때문에 효과적인 시퀀싱 깊이를 감소시킨다. pwCF로부터의 가래는 세포외DNA(23)의고농도를 가지고 있지만, 그 중 상당 부분이기원(24)에서미생물이며, 연어 정자 DNA를 인공 가래 매체에 첨가하면 더 생리적이거나 이 프로토콜에 기술된 배양 접근법이 미생물 유래 외세포 DNA의 높은 수준으로 이어지는지 여부는 불분명합니다. 우리는 우리의 연구 결과에 있는 추가 세포 내 DNA 사격량 사이 구별하지 않았습니다. 미래 연구는 이 배양 방법에 의해 생성된 세포외 DNA의 농도를 확인하길 원할 수 있습니다.
셋째, 우리의 지식에, 낭포성 섬유증 폐 미생물 지역 사회에 대한 출판 된 연구는 과옥증 조건을 해결했다. 이 모델은 일반 실험실 이나 병원 공급 업체에서 저렴 하 고 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 산소 스파기 시스템을 구축. 과옥조건의 유지를 위한 중요한 고려사항은 혈청병에서 사용 가능한 헤드스페이스에 비해 배양 배지의 부피를 포함한다. 프로토콜 개발 중 초기 시도에서 125 mL 혈청 병이 사용되었습니다. 그러나, 500mL 혈청병(475mL 헤드스페이스에서 25mL 배양비까지 허용)의 사용은 최대 24시간 동안 원하는 농도의 유지를 허용하여 산소 스파깅 빈도를 감소시킨다. 이 접근법은 이산 산소 조건을 생성하므로 여러 산소 조건에 걸쳐 다른 환자 샘플의 동시 배양을 허용합니다. 혐기성 배양에서 그밖 공구는 산소로 희소한 혐기성 항아리 또는 발치 형 관의 사용을 포함하여 hyperoxic 문화에 이용될 수 있습니다. 메타게노믹스 염기서열분석을 이용한 폐 미생물 공동체의 분석은 전반적인 알파와 베타 다이버시티가 배양된 가래와 비교된다는 것을 나타냅니다. 종 수준에서 차동 풍부를 평가할 때, 21%의 산소에서 배양하고, 엔테로박테라레, 연쇄상 구균 및 곰팡이를 포함한 에어로브 및 능력성 혐기성의 성장을 위해 풍요로워졌다. 이는 pwCF25,26의기도에서 관찰된 혐기성 상태의 배제 때문일 가능성이 있다. 미래 연구는 이 모형에 질소 가스의 포함을 고려할 수 있었습니다 무산소및 소성 조건 및 기도 미생물 지역 사회에서 찾아낸 관련 호기성 및 혐기성 microbiota의 범위를 연구하기 위하여.
이러한 프로토콜에 설명 된 주요 원칙은 복잡한 미생물 지역 사회 또는 일반적인 폐 병원체에 산소의 영향과 관련된 유사한 연구의 수행을 위해 유익할 수 있습니다. 산소는 모든 향상된 폐 질환 치료에 사용되는 가장 일반적인 치료법이며, 기도 미생물 지역 사회와 일반적인 호흡기 병원체에 부수적 인 예기치 않은 효과로 이어질 수있는 방법의 더 나은 이해는 pwCF 및 기타 만성 폐 질환의 치료에 중요 할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업의 일부는 해양 생물 연구소, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (보조금 번호 5600373), 사이먼스 재단의 선물의 지원을 받아 해양 생물 연구소에서 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
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