Summary
乳腺上皮细胞和内皮细胞之间的串扰对乳腺癌进展、肿瘤生长和转移有重要贡献。在这项研究中，球状体是由乳腺癌细胞与血管和/或淋巴内皮细胞一起制成的，并证明了它们作为乳腺癌研究 的体外 系统的适用性。
Abstract
乳腺癌是女性死亡的主要原因。乳腺癌细胞的生长及其随后的转移是其进展的关键因素。尽管使用MCF-7细胞等乳腺癌细胞的单一培养物对促进乳腺癌生长的机制进行了深入研究，但尚未深入研究其他细胞类型（例如密切参与肿瘤生长的血管和淋巴内皮细胞）的贡献。细胞 - 细胞相互作用在肿瘤生长和进展中起着关键作用。新血管生成或血管的发育对于肿瘤生长至关重要，而淋巴系统则是癌细胞迁移和随后转移的门户。最近的研究提供了证据表明，血管和淋巴内皮细胞可以显着影响癌细胞的生长。这些观察结果意味着需要开发体 外 模型，以更真实地反映 体内乳腺癌的生长过程 。此外，动物研究的限制要求开发 离体 模型，以更好地阐明所涉及的机制。
本文描述了由乳腺癌细胞（雌激素受体阳性MCF-7细胞）和血管和/或淋巴内皮细胞组成的乳腺癌球体的发展。该协议描述了使用两种不同的方法创建双细胞球体的详细分步方法，即悬挂式下降（黄金标准和便宜）和96孔U底板（昂贵）。提供了有关如何通过显微镜定量和使用死细胞和活细胞染色评估活力来精细拾取形成的球体以监测生长的深入说明。此外，还描述了用生长特异性抗体固定球体以进行切片和染色以区分球体中生长模式的程序。此外，还提供了用转染细胞制备球体的详细信息以及提取RNA进行分子分析的方法。总之，本文为制备用于乳腺癌研究的多细胞球体提供了深入的说明。
Introduction
使用动物进行实验有局限性。动物研究无法准确模拟人类的疾病进展，动物和人类对病原体的反应也不尽相同。此外，由于担心动物的痛苦和道德问题，动物实验受到限制1,2 越来越限制研究项目。 In vitro 系统已被广泛开发，以规避动物的使用;而且，利用人体细胞已经使 in vitro 与病理生理学和治疗学研究更相关的模型。传统的单层（2D）细胞培养物被广泛使用，因为它们在某种程度上模仿人体组织。然而，2D单一培养无法模仿人体器官，2D单一培养无法模拟原始器官的复杂微环境并模仿 in vivo 情况3,4,5,6.此外，在单层细胞培养物中，药物治疗很容易破坏/损伤所有细胞。重要的是，可以通过切换到多层三维（3D）细胞培养物来克服其中一些限制。7,8.事实上，3D培养模型已被证明可以更好地反映原代组织中细胞的结构，布局和功能。这些3D培养物可以使用各种细胞系形成，类似于功能器官。事实上，有两种3D文化模型。一种模型产生聚集细胞的球体，这些细胞形成簇并将它们重组为球体（无支架模型）。第二种产生类器官，其具有更复杂的结构，由多个器官特异性细胞的组合组成，这些细胞被认为是器官的微型版本。9,10.因此，3D培养系统代表了一种具有许多生物学和临床应用的创新技术。因此，球状体和类器官在疾病建模和与再生医学，药物筛选和毒理学研究相关的研究中具有许多应用。6,11,12,13,14,15.源自3D技术的致癌球体，重建相关细胞类型的形态和表型，模仿 in vivo 肿瘤微环境，并对肿瘤发展过程中可操作的细胞通信和信号通路进行建模16,17,18.此外，为了提高对癌症生物学的理解，肿瘤球状体/类器官还可用于识别潜在的患者特异性抗癌疗法（个性化）并评估其疗效，毒性和长期影响。19,20,21,22.球状体为研究病理生理学，疾病建模和药物筛选提供了突出的机会，因为它们能够保存细胞和三维组织结构，能够模仿 in vivo 情况，以及细胞 - 细胞相互作用。然而，人们还必须意识到该系统的局限性，例如缺乏血管/全身成分，功能性免疫或神经系统，并且与动物模型相比，该系统代表了还原论的方法。事实上，与动物模型相比，3D结构仅提供人体内生物学的近似值。了解3D方法的局限性可能有助于研究人员设计更精细和有效的过程，以产生在更大尺度上更好地代表器官的球体。23,24,25.
癌症是全世界死亡的主要原因，而乳腺癌是女性中最常见的癌症26、27、28。为了模拟乳腺癌的复杂微环境，应使用在乳腺肿瘤中起突出作用的细胞（即上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞和/或免疫细胞）培养乳腺癌球状体。此外，对于代表乳腺癌的球状体，还应考虑女性激素受体（雌激素/孕激素受体）的表达，保存患者肿瘤组织学状态的能力以及模仿治疗反应的能力。研究表明，3D共培养系统具有与体内原代组织相似的细胞组织，具有对刺激实时反应的能力，并具有功能性雄激素受体29、30、31、32。因此，类似的方法可能有助于在体外模拟乳腺肿瘤 。当前方案的目的是建立一种产生乳腺癌球体的新方法。该方法利用雌激素受体阳性MCF-7细胞（上皮细胞的永生化人细胞系）和血管内皮细胞（HUVECs）或淋巴内皮细胞（HMVEC-DNeo）来创建模拟或密切反映肿瘤内这些细胞之间相互作用的模型。虽然MCF-7（雌激素反应性）和内皮细胞在本研究中已被用于发展球状体，但其他细胞，如占乳腺肿瘤质量约80%的成纤维细胞，也可以在未来结合，以更好地代表和模仿乳腺肿瘤。
形成球体的方法有几种，例如：1）采用重力33，34的悬挂液滴法;2）利用磁性纳米颗粒暴露于外部磁铁的磁悬浮法35，以及3）通过在低附着板上接种细胞来执行的球状微孔板法36，37。在仅使用一种细胞类型的现有方法的基础上，对本方案已利用上皮细胞和内皮细胞进行了优化，以更好地模拟乳腺癌肿瘤在体内38、39、40、41的生长条件。这种方法可以在实验室中以低成本和最低的设备要求轻松实现。根据实验室的需求/目标，使用不同的方法来形成旋转体并从这些旋转体中获得相关的细胞材料。在这种情况下，对于DNA，RNA或蛋白质分析，3D球体是通过与悬挂滴法共培养内皮和上皮细胞来产生的。然而，对于功能研究，例如，为了监测短干扰（siRNA）转染和/或激素处理后的细胞生长，使用U底板生成球状体。
该技术方案的目的是为1）形成乳腺癌多细胞型球体，2）制备用于组织学染色的样品以及3）收集用于提取RNA，DNA和蛋白质的细胞提供详细的分步描述。廉价的悬挂式下降方法和更昂贵的U底板都用于形成球体。在这里，提供了制备（固定）球体的方案，用于切片和随后的免疫染色，并用标记物评估细胞增殖，凋亡以及球体内上皮和内皮细胞的分布。此外，该协议显示了使用ImageJ软件对组织学数据的完整分步分析。生物数据的解释因实验类型和所用抗体而异。固定球体的切片和随后的切片染色由常规病理学实验室（Sophistolab：info@sophistolab.ch）进行
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Protocol
1. 细胞培养
注意：在无菌条件下进行细胞处理。
- 人脐静脉内皮细胞 （HUVECs） 传代培养
- 在室温（RT）下用胶原蛋白（5μg/ cm 2）（大鼠尾巴）在75cm 2烧瓶中涂布过夜（ON）或在37°C下涂覆2-3小时，用水冲洗，并让烧瓶干燥。
- 在补充谷氨酰胺（1x = 2 mM），抗生素 - 抗真菌溶液（AA;100μg/ mL链霉素，100μg/ mL青霉素和0.025μg/ mL两性霉素B），LSGS（2%v / v FCS，1μg/ mL氢化可的松，10ng / mL人表皮生长因子，3ng / mL人碱性成纤维细胞生长因子）中培养HUVECs， 10μg/ mL肝素）和10%FCS（胎儿小牛血清）在标准组织培养条件（37°C，5%CO2）下。每2天更换培养基，直到细胞达到70%-80%汇合。
- 用5 mL HBSS（不含Ca 2 +和Mg2 +）洗涤亚汇合培养物，并加入3mL胰蛋白酶（在HBSS中稀释0.25%（不含Ca2 +和Mg2 +））。
注意：HBSS也可以用PBS代替。 - 将细胞在37°C下孵育2分钟（显微镜检查细胞是否分离并四舍五入），并通过加入6mL的10%FCS培养基（DMEM-F12或EBM-2，10%FCS）停止分离反应。
- 在室温下以250×g离心细胞悬浮液5分钟，并弃去上清液。
- 将细胞悬浮在生长培养基中，种子放入75 cm2 烧瓶或培养皿中。
- 密歇根癌症基金会-7（MCF-7，人乳腺癌细胞）传代培养
- 在生长培养基（补充有商业谷氨酰胺（1x）的DMEM / F12培养基，抗生素 - 抗真菌溶液（AA; 100μg/ mL链霉素，100μg/ mL青霉素和0.025μg/ mL两性霉素B）和10%FCS的生长培养基中培养人乳腺癌细胞系，并在标准组织培养条件下（37°C，5%CO2）下培养10%FCS。每2-3天更换一次培养基。
- 用5mL HBSS（不含Ca 2 +和Mg2 +）洗涤亚汇合细胞培养物（70%-80%汇合），并在37°C下加入3mL胰蛋白酶（在HBSS中稀释0.5%（不含Ca2 +和Mg2 +）5分钟（显微镜验证细胞是否分离）。
注意：HBSS也可以用PBS代替。 - 加入8mL10%FCS培养基以停止分离反应，在室温下以250×g离心5分钟并弃去上清液。
- 将沉淀悬浮在生长培养基中，并将平板放入75 cm2 烧瓶或培养皿中。
2. 球体形成
- 在3.5 厘米圆形培养皿中平板5×10 5个细胞/mL（HUVECs和MCF-7）并培养48小时。
- 处理或转染接种的细胞24小时或根据需要。
- 在96孔U底板中执行的可选步骤：用1mL HBSS（Ca2 + 和Mg2 +）洗涤细胞，并使用蓝色染料（0.5μg/ mL）染色HUVECs，并使用绿色染料（0.5μM）稀释在相应生长培养基中的MCF-7细胞，并置于37°C和5%CO2 培养箱中30-40分钟。
- 使用P1000移液管用1mL HBSS（不含Ca2 + 和Mg2 +）洗涤细胞，加入1mL酶分离试剂（HUVEC为0.25%胰蛋白酶，MCF-7为0.5%胰蛋白酶）到每个圆形培养皿中，然后孵育2-5分钟，直到细胞分离。
- 将每种细胞类型分别收集在5 mL圆底聚苯乙烯管中，并使用P1000移液管加入1mL10%FCS培养基以停止酶促反应。将细胞悬浮液以250×g离心5分钟。
- 小心地吸出上清液并将细胞悬浮在1mL无类固醇培养基（EBM-2，谷氨酰胺，抗生素抗真菌剂，0.4%FCS sf（木炭剥离））中。
注意：无类固醇培养基可以用正常的生长培养基代替。 - 使用100μL用10mL稀释剂II稀释的每个细胞悬浮液（见 材料表）来确定总细胞数并计算获得5 x 103 个细胞/ mL或3.4 x 105 个细胞/ mL每种细胞类型所需的处理培养基（EBM-2，谷氨酰胺，抗生素 - 抗真菌剂，0.4%FCS sf，载体/处理）的量。
- 细胞计数
- 打开机器并通过按下"功能"和"开始"按钮（设置S3）冲洗，将稀释剂II溶液放入细胞计数器小瓶中。
- 使用设置S4并按 开始 ，用新鲜的稀释剂II溶液测量坯料。
- 在10 mL稀释剂II溶液中用100μL细胞悬浮液更换闪烁小瓶并测量样品：设置S4并按 开始。
- 记下数字显示屏上每 mL 的细胞数。
注意：细胞计数也可以使用其他手动或自动系统进行：血细胞计数器网格线，光散射细胞计数技术，电阻抗，使用细胞染色的基于成像的系统，例如台盼蓝。
- 96 孔 U 型底板
- 准备5 mL每个细胞悬浮液（5 x 103 个细胞/ mL）并混合它们以1：1的比例获得10 mL的最终体积。
- 使用手动重复移液器将100μL细胞悬浮液移出到96孔U底板的每个孔中。
- 将板置于标准组织培养条件下的培养箱中，并在48小时后检查球体形成。
- 可选步骤：使用荧光体视显微镜拍摄球体（40x）的照片。
注意：此方法在48小时后产生96个球体（一个球体/孔）（面积1-2像素2），通常用于生长研究。
- 吊坠
- 以1：1的比例混合细胞悬浮液（3.4×10 5 个细胞/ mL），以获得2 mL的最终体积。
- 使用P20移液器以15μL滴剂的形式在10cm培养皿的倒盖上接种细胞混合物。
- 用滴剂倒盖，在培养皿底部加入5毫升基础培养基（EBM-2），以避免滴剂蒸发。
注意：此方法在 48 小时后生成一个旋转椭球体/液滴。确保液滴彼此之间足够分开，以便在切换盖子时它们不会合并。如有必要，使用多个10厘米培养皿。
- 细胞计数
3. 球体生长研究
- 将100μLHUVECs和MCF-7细胞混合物（5×102 个细胞/孔）加入96孔U型底板中，并将其置于培养箱中。
- 电镀后48小时，用倒置显微镜（明场）检查球体的形成。在培养96小时时拍照（每次治疗至少六张照片，40倍）。
- 使用图像处理软件打开图片，将图像处理为300像素/英寸，并将图像另存为tiff文件。
- 下载 ImageJ 软件并将其打开。单击"文件"选项，然后转到"打开"。
- 以统一的方式将感兴趣的区域转换为饱和的黑色区域，以获得二进制图像（黑白）。为此，请选择" 图像 "选项，然后选择 "键入| 8 位"。现在，图像是黑白的。
- 使用手绘选择工具绘制旋转椭球体的边框。
- 要计算感兴趣区域并将对象或前景像素与背景像素分开，请使用阈值功能：选择" 图像 "选项，选择" 调整 "，然后单击" 阈值"。
- 现在将打开一个阈值弹出窗口。顶栏指示最小阈值：将值设置为零。底部条表示最大阈值：移动柱，直到感兴趣区域完全变为红色。
注意：如果颜色不是红色，请从"阈值"窗口中选择 "红色 "。 - 转到分析|设置测量值，然后选择"面积和周长"。
- 要测量感兴趣区域，请选择 分析 选项，然后使用 分析粒子 工具。在 "分析粒子" 窗口中，将 "大小" 设置为测量（0.00003-无穷大或 3-无穷大，具体取决于球体的大小），选择" 汇总 并 显示结果"。然后，单击 确定。
- 结果将显示在图表中。将测量结果复制到电子表格中以分析数据。
注意：面积按总像素数计算;使用总面积进行计算。
4. 球状免疫组织化学研究
- 样品制备
- 将HUVECs和MCF-7的细胞混合物（5×103 个细胞/孔）在HUVEC生长培养基的96孔U底板中平板96小时。
- 将约50个球体收集到1.5mL管中，用P200μL移液器的切割尖端;让它们通过重力沉降到管的底部，然后丢弃上清液。
- 用500μL4%PFA固定球体1小时，室温。
- 使用带有磁力搅拌器的热板将2%的诺贝尔琼脂溶液在PBS中煮沸3-5分钟，以完全溶解琼脂糖粉末并冷却至约60°C。
- 用P1000移液器除去PFA，用500μLPBS洗涤球体，并让它们沉淀。丢弃上清液。
- 小心地将600μL琼脂糖溶液移液到带有球体的1.5mL管中，并立即将管放入具有177×g水平转子的离心机中2分钟。
- 在琼脂糖溶液的中间加入一根短绳，以轻松从管中取出插头。
- 将琼脂糖塞固化在冰上或4°C。 将500μLPBS加入1.5mL管中，以避免从沉淀中干燥。
注意：样品已准备好进行后续脱水，石蜡包埋，切片，转移到显微镜载玻片上和IHC染色（由Sophistolab进行）。
- 图像采集和处理
- 使用立体显微镜采集球体切片的图像。
- 将每个示例的三个图像保存为.jpg文件。
- 打开 ImageJ 软件。打开 JPEG 图像，单击"文件"，然后单击"打开"。
- 在"图像"选项中选择"颜色"和"颜色反卷积"。
- 在"颜色反卷积 1.7"窗口中选择 H DAB 矢量，将显示三个图像。
注：这三幅图像分别为：颜色1仅代表苏木精染色（蓝色/紫色），颜色2仅代表DAB染色（棕色）。使用两次染色进行图像分析时不需要颜色 3。 - 选择" 颜色 1" 窗口并设置"阈值：转到 图像|调整 并单击 阈值。将出现 "阈值 "窗口。
- 将最小阈值设置为零，并调整最大阈值以删除背景信号，而不会影响真实信号。单击"应用"。
- 面积测量
- 单击分析，选择设置测量。选择面积、平均灰度值以及最小和最大灰度值，然后单击确定进行确认。
- 使用" 分析 "选项测量原子核的大小，然后选择" 测量"。
注：" 结果 "窗口提供图像的名称（标签）、图像的大小（面积）、IHC 图像的平均像素强度（平均值）以及最小和最大灰度值（最小值、最大值）。使用平均值进行计算。 - 对"颜色 2"（如果有双重染色，则为"颜色 3"）窗口重复步骤4.2.6-4.7.1.2。
- 细胞定量
- 单击" 处理"，选择" 二进制" 选项，然后选择" 分水岭" 以分隔单元格。
- 转到 "分析 "，然后单击" 分析粒子"。在 "分析粒子" 弹出窗口中，设置单元格的大小以排除非特异性粒子。接下来，在 "显示 "选项上，单击下拉框，然后选择 "大纲"。然后，单击 确定。
- 对颜色2（如果有双重染色，则为颜色3）窗口重复步骤4.2.6-4.2.2.7和细胞定量步骤（第4.2.7.2节）。
注意：现在将出现三个窗口：1）摘要结果（计数的单元格数，总面积，平均大小，面积和平均值的百分比），2）结果（分别对应于计数的单元格）和3）绘图窗口（计数单元格的描绘图像）。
- 面积测量
5. 球体中的活/死染色
- 在1.5mL管中制备4mM的CALCEIN AM在DMSO中（将活细胞染成绿色）和在DMSO中制备2mM的乙锭同源二聚体（将死细胞染成红色）的储备溶液。
- 计算在EBM-2中以1：50稀释的钙绿素AM和锭均聚二聚体混合物中加入10μL/孔所需的溶液量。
- 将染色混合物加入球体中，并将板置于标准组织培养条件下的培养箱中30-60分钟。
- 使用荧光体视显微镜获取照片（40倍）。
6. 球体蛋白和RNA分离
- 以每种细胞类型3.4×105 个细胞/ mL制备细胞悬浮液，以1：1的比例混合，并使用P20移液器以15μL滴剂的形式在10cm培养皿的盖子上接种细胞混合物。倒置盖子并将其置于标准组织培养条件下的培养箱中96小时。
- 使用 5-6 mL PBS 使用 5 mL 无菌聚苯乙烯移液器将球体收集到 15 mL 圆底聚苯乙烯管中。
注意：也可以使用 15 mL 锥形管。 - 将球体悬浮液以250×g离心5分钟，然后小心地吸出上清液。
- 加入500μL胰蛋白酶（100%），并使用P1000移液器上下移液30秒以分解球状体，实现细胞悬浮液。
- 用10%食品接触物质培养基中和胰蛋白酶，以250×g离心管5分钟，并吸出上清液。
- 根据制造商的协议（用于无DNARNA分离的特定试剂盒），使用300μLRNA裂解缓冲液裂解细胞沉淀。
注意：裂解缓冲液也可以直接加入到完整的球体中（不需要胰蛋白酶步骤）以提取RNA。向沉淀的球体中加入300μL裂解缓冲液，将试管置于冰中，并使用P200移液器研磨10次。随后，如上所述分离RNA。如果由于基质干扰导致RNA回收率低，则可能需要球体解离。 - 或者，使用70μL裂解缓冲液进行蛋白质分离。通过超声处理匀浆2-4秒，并使用BCA检测试剂盒根据制造商的方案确定蛋白质浓度。
注意：对于蛋白质分离，可以直接在裂解缓冲液中裂解沉淀的球体，然后进行超声处理。使用25μg总蛋白进行蛋白质印迹。
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Representative Results
需要使用上皮和内皮共培养物的球状体模型来密切模拟乳腺肿瘤的 体内 条件以进行 体外 实验。 图1 中的方案描述了与乳腺癌上皮细胞和血管或淋巴内皮细胞形成球状体的方案（图1）。将每种细胞类型分别接种在3.5cm的圆形培养皿中，并用生长刺激剂/抑制剂处理或使用脂质聚胺转染寡核苷酸。上皮细胞或内皮细胞的汇合单层在胰蛋白酶消化后收获，洗涤并以1：1的比例混合。随后将细胞接种在96孔U底板（图1A）或直径为10厘米的圆形培养皿的倒盖上，以利于悬挂式培养物（图1B）。接种后不久，细胞在每个孔或液滴的底部显示为平坦，致密的细胞片，随后，它们随着时间的推移（24-48小时）聚集，从而在48小时形成完整的球体。为了防止对松散形成的细胞聚集体造成任何损害，板不得扰至少 24 小时。
在U底板中，MCF-7细胞的接种，而不是内皮细胞或淋巴细胞的接种，导致48小时后球状体的形成（分别为图2A，B）。此外，以1：1的比例接种MCF-7加上内皮细胞或淋巴细胞也导致球状体形成（分别为图2C，D）。为了验证球体作为研究肿瘤生长的模型，测量/量化了响应生长刺激溶液的球体大小的时间依赖性变化，并与未处理的对照组进行了比较（图2）。图2E中的显微照片显示了具有代表性的MCF-7球体的时间依赖性（24-120小时）顺序生长。图2F中的折线图描绘了使用或不使用生长刺激剂处理时MCF-7球体面积随时间的变化。球体尺寸在5天内从~100μm增加到~200μm;此外，在用生长刺激剂处理的球体中观察到生长速率增加（图2F）。由于长期处理（168小时）导致MCF-7活力降低，可能是由于球体中心的缺氧条件（图3），因此研究3D结构生长至96小时。与单独用MCF-7形成的球状体相比，用MCF-7细胞和HUVECs形成的球体在168小时显示出更少的死细胞数量。
在最初的实验中，在培养4天后仅观察到球体大小的小幅增长。据推测，这可能是由于大量细胞被接种形成球体。在U型底培养板中，球体的生长可能受到孔凹形的限制。由于生长依赖于初始接种的细胞数量，因此使用不同的细胞数量来形成球状体，以测试和建立监测球体生长的最佳条件。如图4所示，研究结果表明，对于球体生长研究，接种500个细胞/孔以形成球体是可靠和可重复的，用于监测球体的生长4-6天，以响应生长调节因子。在接种5×103个细胞/孔后，在第4天获得最适合组织学或免疫组织学观察的球状体。相同的初始浓度用于细胞蛋白或RNA提取。将初始细胞浓度增加超过7.5 x 103个细胞/孔并不能改善球状体的形成，并且细胞不能正确聚集并假设不规则的结构（图4）。
为了评估细胞组成，增殖和凋亡状态，使用H&E和Ki67（稀释1：300）和切割Caspase-3（稀释1：500）抗体检查了由乳腺癌细胞和内皮细胞形成的球体的组织学切片。最终样品制备过程需要小心/关注和精确。图5A描述了收集球体并将其掺入琼脂糖中进行切片的工作流程。图5B-C中的显微照片显示了在脂质端胺（终浓度为0.17%）（一种常用的转染剂）存在（图5B）和不存在（图5C）时MCF-7球体形成的差异。组织学切片的明场显微图像显示了两种细胞类型的均质混合物的圆形，紧凑的结构（图5D-G）。在脂质纤维胺存在下，用对照寡核苷酸转染后，球状体的结构和细胞的形状没有异常（图5D）。此外，表达增殖标记Ki67的细胞均匀分布在球体中;然而，在球体表面也观察到一圈增殖细胞（图5E）。切割的Caspase-3染色显示培养4天后凋亡细胞（图5F）。组织学切片有助于使用特定标志物评估球体中上皮细胞和内皮细胞的分布。使用CD31作为内皮细胞的特异性标记，可以确定它们在3D结构中的分布。由于所有细胞都用苏木精染色（细胞核的蓝色染色），CD31表达的计算可以提供治疗或转染后含有内皮细胞的球体的面积（方案部分4.2.7.1.）。此外，通过进行双重染色测定，可以获得更多信息，例如，如图5G所示，CD31染色内皮细胞（红色）和Ki67染色增殖细胞（棕色）。按照方案部分4.2.7.2，图5G显示55%是上皮细胞，45%是内皮细胞，25%的细胞是增殖。
在用活性染料标记细胞后，也可以使用免疫荧光分析来研究球状体的结构。用蓝色（HUVEC）和绿色（MCF-7）染料分别染色HUVEC和MCF-7细胞的融合2D培养物。随后，收集染色的细胞并以1：1的比例混合，并在孔中接种以形成球体。染色的荧光细胞的图像在接种后立即拍摄（图6A）和培养3天后（图6B）。为了评估活细胞和死细胞的百分比，用钙黄绿素AM（绿色）和乙锭同源二聚体（红色）染色4天龄的球体（图6C）。用MCF-7和HUVECs形成的球状体不能使用用于冷冻细胞的标准方案（补充有10%DMSO和10%FCS的生长培养基）成功冷冻/保存用于冷冻细胞。在冷冻和解冻的球体中，细胞聚集体的破裂和细胞活力损失的增加是显而易见的。 图6D 中的代表性图像显示了刚解冻的球体，染色用于死细胞和活细胞。它表明球体对冰冻条件非常敏感。
在实验条件下培养5天后，需要裂解约100个球体以收集足够的蛋白质（〜3μg/ mL）或RNA（〜60ng / μL）进行分析。 图7 显示了从球体收集（使用悬挂滴剂方法生成）到蛋白质提取的细胞裂解以执行蛋白质印迹或RNA分离以进行未来的微阵列测定或RT-PCR分析的工作流程。从球体中的异质细胞群中分离RNA / DNA进行微阵列分析可以带来一些有用的信息。然而，为了鉴定关键的细胞特异性机制或细胞间相互作用，可以使用FACS分析和来自用于微阵列分析的特定细胞的RNA，在酶促（胰蛋白酶或针灸酶）解离后分离球状细胞。此外，抗生素耐药细胞系（例如，通过使用EGFP和/或嘌呤霉素耐药细胞系）可用于球状体中，以解决特定细胞类型细胞 - 细胞相互作用的作用。此外，基因沉默工具可用于设计细胞以解决特定的细胞 - 细胞相互作用问题。
图1：旋转椭球体形成的工作流程。2D培养物中的MCF-7和HUVEC或LEC细胞单独生长并在各种所需处理后收集。随后，球体通过直接混合（A）96孔U底板中的细胞而产生，通过细胞间聚集促进3D结构的形成，或者通过使用（B）悬挂液滴培养物，通过重力支持球体的形成。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：球体随时间推移的形成和发展。 图像描绘了MCF-7细胞形成的球体（图A），内皮或淋巴细胞（HUVECs;（图 B）以相同的密度接种，并通过MCF-7细胞加上HUVECs或LEC以1：1的比例混合形成球体（图C，D）。还描绘了椭球体随时间（24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）的大小增长。该球体由MCF-7和HUVECs的混合物以1：1的比例形成，并以96孔U底板（图E）的500个细胞/孔的密度接种（比例尺= 200μm，40x）。折线图（图F）显示了对照（CTR）与生长刺激（治疗）球体的时间依赖性生长。测量旋转椭球体的面积，并在未经处理和处理的球体之间进行比较。结果表示±SEM，*** p<0.001与相应的对照组相比。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：球体长期培养和生存能力。 显微照片显示了单独用MCF-7细胞在96小时（图A）和168小时（图C）形成的球体中的细胞活力，而 图B 和 D 描绘了用MCF-7加HUVECs（1：1比例）在96小时（图B）和168小时（图D）（比例尺= 100μm）制成的球体中的细胞活力。用钙黄绿素（红色，死细胞）和乙锭同源二聚体（绿色，活细胞）染色细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：MCF-7加HUVEC球体的细胞接种密度和时间依赖性生长曲线。以1：1的比例混合的HUVECs和MCF-7细胞以增加的密度接种（102-104个细胞/孔），并在24-96小时内监测球体的生长。拍摄微观明场图像（比例尺= 200μm，40x）以评估球体随时间的变化。密度为500个细胞/孔的细胞为研究球体生长提供了最佳尺寸。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：用于切片和组织学染色的球体包埋。图 A：描绘了将 HUVECs/MCF-7 球体收集和掺入琼脂糖的工作流程的卡通。将球体嵌入琼脂糖塞中并切片石蜡块后，将样品用于标准组织学染色。图B和C分别显示了具有代表性的MCF-7和HUVEC球状体，这些球体分别在没有和用Lipofectamine 2000处理的情况下处理（比例尺= 200μm，40x）。图D-G显示了用特定标记染色的球体切片的代表性图像。图D显示了用苏木精 - 曙红染色的球体，以评估球体结构（比例尺= 100μm）。图E中的染色描绘了用Ki67进行阳性染色的增殖细胞。图F显示用切割的Caspase-3（比例尺= 50μm）阳性染色的球体中的凋亡细胞。图G描绘了具有双重染色的球体切片：CD31（内皮细胞标志物）和Ki67（增殖标志物）（比例尺= 100μm）。球体的切片和染色由Sophistolab（info@sophistolab.ch）进行。请点击此处查看此图的放大版本。
图6：MCF-7 / HUVEC球体的荧光图像显示细胞分布和活力。 图 A 和 B 描绘了具有代表性的球体，其中HUVECs被蓝色染料染色，MCF-7细胞被绿色染料染色。HUVEC和MCF-7在球体内的定位在播种后（A）和球体形成后（B）立即变化（比例尺= 250μm）。 图C-D 显示了用钙黄绿素/锭同源二聚体染色的球体，以在正常培养条件（C）和冷冻后（D）（比例尺= 100μm）识别3D结构中的活（绿色）和死细胞（红色）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7：用于生化分析的球体收集示意图。 漫画展示了收获球体，分离或释放细胞并将其悬浮在裂解溶液中以进行蛋白质分析或RNA提取的方案。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
与2D细胞培养相比，革命性的3D球体培养技术是重建器官微环境，细胞间相互作用和 体外药物反应的更好，更强大的工具。这是描述用于乳腺癌研究的多细胞（上皮和内皮）细胞系中球状体形成的第一个方案。该协议可确保球体的球体3D生长长达5天，并且可以在石蜡包埋，切片和组织学染色后检查球体。有趣的是，球体内的细胞元件仍然表达促进细胞生长的受体，并对增殖和凋亡刺激有反应。所述方案产生足够的生物材料用于蛋白质或RNA / DNA分析。上述共培养系统在实验室条件下易于实现，成本低廉，可能是未来应用的优势，特别是在乳腺癌治疗和药物敏感性测试中。此外，该方案可应用于不同的上皮和内皮细胞类型。
在体外模仿体内存在的复杂组织是极其困难的。这是因为体内组织由许多相互作用的成分组成，包括神经，血管，间充质和免疫细胞30，42。该协议的目的是通过使用具有两种不同细胞类型的3D共培养系统来接近实际的肿瘤状态来克服其中一些限制。在这里，球状体已经与上皮肿瘤细胞结合内皮细胞或淋巴细胞形成，以尽可能地模仿体内情况，包括细胞 - 细胞相互作用，对染色细胞释放到细胞间空间的凋亡因子的敏感性，以及球体中心的缺氧条件。该协议已经过优化，用于测试细胞对生长因子，信号传导因子和激素的反应，其快速激活信号级联和靶向基因转录并刺激蛋白质表达和转运30，31。在球状体中，但不是在体内，肿瘤细胞对刺激的反应可以快速而频繁地被评估。
在本研究中，球状体中的内皮细胞似乎没有形成毛细血管样结构。由于内皮细胞已被证明在低密度接种时形成毛细血管，在高密度下接种单层时形成毛细血管，因此降低MCF-7与内皮细胞的比例可能导致球体内毛细血管形成是可行的。或者，添加特定的基质蛋白或基质胶可以促进毛细血管的形成。球体中毛细血管样结构的缺乏并不能稀释MCF-7加内皮细胞与MCF-7细胞本身的优势，因为MCF-7细胞释放的因子可以促进内皮细胞增殖，反之亦然;这种相互作用在MCF-7中仍然未被发现，只有球体。
一些研究表明，5 x 103个细胞/孔是种子细胞形成球体的适当浓度43，44，45，46，47;然而，在96孔U底板中，这个细胞的数量限制了实验条件下球体的协调生长。因此，在每项新研究中，对于每种新细胞类型，重要的是监测药物治疗后3D系统的生长，以确定治疗对球体大小的影响。
当前方案的局限性在于，通过经典的DMSO方法冷冻和解冻后，先前形成的球体的培养不能继续。事实上，当解冻时，大多数细胞都死了。玻璃化可能被证明是保持细胞存活的替代方案48。
必须仔细注意技术细节，以避免错误并产生和维护形状良好的球体。一个挑战是免疫染色的样品制备（第4.1节）。为了通过将球体移液到1.5 mL管中来促进转移，重要的是使用用剪刀切割的P200尖端，以使孔的面积大于球体本身。否则，转移可能会破坏球体。另一个挑战是如何在球体沉降到试管底部后吸出培养基。在这方面，最好使用P1000移液器而不是真空泵，以避免球体的吸出。准备用于切片的球体的一个重要而微妙的步骤是将琼脂糖添加到颗粒状的球体中。一旦悬浮在琼脂糖中，必须在琼脂糖聚合之前使用卧式离心将球体快速沉淀到微量离心管的底部。
总体而言，由MCF-7和内皮细胞组成的双细胞球体为研究驱动肿瘤内癌细胞或内皮细胞生长的细胞 - 细胞相互作用和机制提供了一种可行的替代方案。球状体可以作为评估靶向肿瘤或癌症生长的治疗剂疗效的模型。重要的是，这种双细胞模型可以进一步即兴创作，以包括与肿瘤生长相关的其他细胞类型。在这种情况下，可以包括构成乳腺肿瘤肿块80%的成纤维细胞以形成MCF-7，内皮细胞和成纤维细胞球体。此外，基因沉默和基因工程细胞可用于解决细胞 - 细胞相互作用，激素受体（雌激素/孕激素），生长因子和信号通路对肿瘤/癌症生长的作用，以及测试新的抗癌分子的功效。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了癌症研究基金会/瑞士癌症联盟资助KFS-4125-02-2017给RKD和国家卫生研究院资助DK079307给EKJ的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) | Lonza | CC-2516 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica fully motorized fluorescence stereo microscope | Leica Microsystems | M205 FA | |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
References
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
- Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
- Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
- Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
- Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
- Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
- Little, M. H.
- Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
- Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
- Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W.
- Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
- Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
- DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A.
- Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
- Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
- Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
- Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C.
- Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
- Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
- Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
- Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
- Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
- Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
- Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).
