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Cancer Research

स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए एक संभावित कार्यात्मक इन विट्रो मॉडल के रूप में मैमेरी एपिथेलियल और एंडोथेलियल सेल स्फेरॉइड

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

स्तन कैंसर की प्रगति, ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस में स्तन कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण रूप से स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच क्रॉसटॉक महत्वपूर्ण रूप से योगदान देता है। इस अध्ययन में, स्तन कैंसर कोशिकाओं से संवहनी और/या लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ स्फेरॉइड बनाए गए हैं और स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए इन विट्रो प्रणाली के रूप में उनकी प्रयोज्यता प्रदर्शित करते हैं ।

Abstract

महिलाओं में स्तन कैंसर मृत्यु का प्रमुख कारण है। स्तन कैंसर की कोशिकाओं का विकास और उनके बाद मेटास्टेसिस इसकी प्रगति के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। हालांकि स्तन कैंसर के विकास को बढ़ावा देने में शामिल तंत्र गहन एमसीएफ-7 कोशिकाओं के रूप में स्तन कैंसर कोशिकाओं की मोनोकल्चर का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, इस तरह के संवहनी और लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं है कि परिचित ट्यूमर के विकास में शामिल है के रूप में अंय सेल प्रकार के योगदान, गहराई में जांच नहीं की गई है । सेल-सेल इंटरैक्शन ट्यूमर विकास और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। नेओंगियोजेनेसिस, या जहाजों का विकास, ट्यूमर के विकास के लिए आवश्यक है, जबकि लिम्फेटिक सिस्टम कैंसर सेल माइग्रेशन और बाद में मेटास्टेसिस के लिए एक पोर्टल के रूप में कार्य करता है। हाल के अध्ययनों से सबूत है कि संवहनी और लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं को काफी कैंसर सेल के विकास को प्रभावित कर सकते है प्रदान करते हैं । इन टिप्पणियों का अर्थ है कि विट्रो मॉडल विकसित करने की आवश्यकता है जो वीवो मेंस्तन कैंसर के विकास की प्रक्रियाओं को अधिक वास्तविक रूप से प्रतिबिंबित करेगा । इसके अलावा, पशु अनुसंधान में प्रतिबंध शामिल तंत्र को बेहतर स्पष्ट करने के लिए पूर्व वीवो मॉडल के विकास की आवश्यकता होती है ।

यह लेख स्तन कैंसर कोशिकाओं (एस्ट्रोजन रिसेप्टर-सकारात्मक एमसीएफ-7 कोशिकाओं) और संवहनी और/या लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं दोनों से बना स्तन कैंसर के विकास का वर्णन करता है । प्रोटोकॉल दो अलग-अलग दृष्टिकोणों, हैंगिंग ड्रॉप (गोल्ड स्टैंडर्ड और सस्ते) और 96-वेल यू-बॉटम प्लेट्स (महंगी) का उपयोग करके दोहरी-सेल स्फेरॉइड बनाने में एक विस्तृत कदम-दर-कदम दृष्टिकोण का वर्णन करता है। मृत और जीवित कोशिका धुंधला का उपयोग करके व्यवहार्यता का आकलन करने और सूक्ष्म आकार देने और व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए गठित गोलाकारों को नाजुक रूप से लेने के लिए गहराई से निर्देश प्रदान किए जाते हैं। इसके अलावा, स्पेरोइड में विकास पैटर्न में अंतर करने के लिए विकास-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ खंडिंग और धुंधला करने के लिए स्फेरॉइड को ठीक करने की प्रक्रियाओं को चित्रित किया जाता है। इसके अतिरिक्त, आणविक विश्लेषण के लिए आरएनए निकालने के लिए संक्रमित कोशिकाओं और तरीकों के साथ गोलाकार तैयार करने के लिए विवरण प्रदान किए जाते हैं। अंत में, यह लेख स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए बहु-कोशिका स्फेरॉइड तैयार करने के लिए गहन निर्देश प्रदान करता है।

Introduction

प्रयोगों के लिए जानवरों के उपयोग की सीमाएं हैं। पशु अध्ययन मनुष्यों में रोग प्रगति की सही नकल नहीं कर सकते हैं, और जानवरों और मनुष्यों में रोगजनकों के लिए समान प्रतिक्रियाएं नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, पशु दुख और नैतिक समस्याओं के लिए चिंताओं के कारण पशु प्रयोग में प्रतिबंध1,2 तेजी से अनुसंधान कार्यक्रमों को विवश। In vitro जानवरों के उपयोग को दरकिनार करने के लिए सिस्टम को व्यापक रूप से विकसित किया गया है; इसके अलावा, मानव कोशिकाओं का उपयोग किया गया है in vitro रोगविज्ञान और चिकित्सीय जांच के लिए अधिक प्रासंगिक मॉडल। पारंपरिक मोनोलेयर (2डी) सेल संस्कृतियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि वे मानव ऊतकों को कुछ हद तक नकल करते हैं। हालांकि, 2डी मोनोकल्चर मानव अंगों की नकल करने में विफल रहे हैं, और 2डी मोनोकल्चर मूल अंगों के जटिल माइक्रोएनवायरमेंट का अनुकरण करने और नकल करने में असमर्थ हैं in vivo स्थिति3,4,5,6. इसके अतिरिक्त, मोनोलेयर सेल संस्कृतियों में, दवा उपचार आसानी से नष्ट कर सकता है/ महत्वपूर्ण बात, इन सीमाओं में से कुछ मल्टीलेयर त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृतियों पर स्विच करके दूर किया जा सकता है7,8. वास्तव में, प्राथमिक ऊतकों में कोशिकाओं की सेलुलर संरचना, लेआउट और कार्य को बेहतर तांडवित करने के लिए 3 डी संस्कृति मॉडल दिखाए गए हैं। इन 3 डी संस्कृतियों को एक कार्यात्मक अंग के समान विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों का उपयोग करके बनाया जा सकता है। दरअसल, 3डी संस्कृतियों के दो मॉडल हैं। एक मॉडल एकत्रित कोशिकाओं के गोलाकार पैदा करता है जो क्लस्टर बनाते हैं और उन्हें क्षेत्रों (पाड़ मुक्त मॉडल) में पुनर्गठित करते हैं। दूसरी पैदावार ऑर्गेनॉइड, जिसमें अधिक जटिल संरचना होती है और इसमें कई अंग-विशिष्ट कोशिकाओं के संयोजन होते हैं, जिन्हें अंगों के लघु संस्करण के रूप में माना जाता है9,10. इसके कारण, 3 डी संस्कृति प्रणालियां कई जैविक और नैदानिक अनुप्रयोगों के साथ एक अभिनव तकनीक का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस प्रकार, स्फेरॉइड और ऑर्गेनॉइड में रोग मॉडलिंग और पुनर्योजी दवा, दवा स्क्रीनिंग और विष विज्ञान अध्ययन से संबंधित अध्ययनों के लिए कई अनुप्रयोग हैं6,11,12,13,14,15. कार्सिनोजेनिक स्फेरॉइड, 3 डी तकनीक से प्राप्त, प्रासंगिक सेल प्रकारों के आकृति विज्ञान और फेनोटाइप को फिर से बनाते हैं, नकल करते हैं in vivo ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट, और मॉडल सेल संचार और सिग्नलिंग रास्ते जो ट्यूमर विकास के दौरान चालू होते हैं16,17,18. इसके अलावा, कैंसर जीव विज्ञान की समझ में सुधार करने के लिए, ट्यूमर spheroids/ऑर्गेनॉइड भी एक संभावित रोगी विशिष्ट विरोधी कैंसर चिकित्सा (व्यक्तिगत) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इसकी प्रभावकारिता, विषाक्तता, और दीर्घकालिक प्रभाव का आकलन19,20,21,22. स्पेरोइड्स ने सेलुलर और त्रि-आयामी ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करने की क्षमता के कारण रोगविज्ञान, रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग की जांच करने के प्रमुख अवसर खोले हैं, नकल करने की क्षमता in vivo स्थिति, और सेल सेल बातचीत। हालांकि, किसी को इस प्रणाली की सीमाओं के बारे में भी पता होना चाहिए, जैसे संवहनी/प्रणालीगत घटक की कमी, कार्यात्मक प्रतिरक्षा या तंत्रिका तंत्र, और प्रणाली पशु मॉडलों की तुलना में एक न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है । दरअसल, पशु मॉडल के विपरीत, 3 डी संरचनाएं मानव शरीर के भीतर जीव विज्ञान का केवल एक अनुमान प्रदान करती हैं। 3 डी विधि की सीमाओं को समझने से शोधकर्ताओं को बड़े पैमाने पर एक अंग का बेहतर प्रतिनिधित्व करने वाले गोलाकार उत्पादन के लिए अधिक परिष्कृत और वैध प्रक्रियाओं को डिजाइन करने में मदद मिल सकती है23,24,25.

कैंसर दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है, और स्तन कैंसर महिलाओं में सबसे आम कैंसर है26,27,28। स्तन कैंसर के जटिल माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करने के लिए, स्तन कैंसर स्फेरॉइड कोशिकाओं का उपयोग करके सुसंस्कृत किया जाना चाहिए जो स्तन ट्यूमर में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, यानी, एपिथेलियल कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट, और/या प्रतिरक्षा कोशिकाएं । इसके अलावा, स्तन कैंसर का प्रतिनिधित्व करने वाले एक गोलाकार के लिए, महिला हार्मोन रिसेप्टर्स (एस्ट्रोजन/प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर्स), रोगी ट्यूमर हिस्टोलॉजिकल स्थिति को संरक्षित करने की क्षमता, और चिकित्सा के प्रति प्रतिक्रिया की नकल करने की क्षमता पर भी विचार किया जाना चाहिए। अध्ययनों से पता चला है कि 3 डी सह-संस्कृति प्रणालियों में वीवो मेंप्राथमिक ऊतक के समान एक सेलुलर संगठन होता है, जिसमें उत्तेजनाओं के लिए वास्तविक समय में प्रतिक्रिया करने की क्षमता होती है, और कार्यात्मक एंड्रोजन रिसेप्टर्स29,30,31,32 होतेहैं। इसलिए, इसी तरह का दृष्टिकोण विट्रो मेंस्तन ट्यूमर की नकल करने के लिए उपयोगी हो सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य स्तन कैंसर स्फेरॉइड पैदा करने की एक नई विधि स्थापित करना है। यह विधि एस्ट्रोजन रिसेप्टर-पॉजिटिव एमसीएफ-7 कोशिकाओं (एपिथेलियल कोशिकाओं की एक अमर मानव कोशिका रेखा) और संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीसी) या लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएमवीईसी-DNeo) का उपयोग करता है ताकि एक मॉडल बनाया जा सके जो ट्यूमर के भीतर इन कोशिकाओं के बीच बातचीत को नकल करता है या बारीकी से दर्शाता है। हालांकि एमसीएफ-7 (एस्ट्रोजन-उत्तरदायी) और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग वर्तमान अध्ययन में गोलाकार विकसित करने के लिए किया गया है, लेकिन फाइब्रोब्लास्ट जैसी अन्य कोशिकाएं जो स्तन ट्यूमर द्रव्यमान के ~ 80% का प्रतिनिधित्व करती हैं, को भविष्य में स्तन ट्यूमर का बेहतर प्रतिनिधित्व और नकल करने के लिए भी जोड़ा जा सकता है।

गोलाकार बनाने के कई तरीके हैं, जैसे: 1) फांसी की बूंद विधि जो गुरुत्वाकर्षण33, 34को रोजगार देती है; 2) चुंबकीय उत्तोलन विधि जो एक बाहरी चुंबक35और 3 के संपर्क में चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग करती है, गोलाकार माइक्रोप्लेट विधि जो कम लगाव वाली प्लेटों36, 37पर कोशिकाओं को सीडिंग द्वारा कियाजाताहै। मौजूदा तरीकों के आधार पर, जो केवल एक सेल प्रकार का उपयोग करते हैं, वर्तमान प्रोटोकॉल को एपिथेलियल और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके अनुकूलित किया गया हैताकि वीवो38, 39,40,41में स्तन कैंसर ट्यूमर की वृद्धि स्थितियों की बेहतर नकल की जा सके। इस विधि को प्रयोगशाला में कम लागत पर और न्यूनतम उपकरण आवश्यकताओं के साथ आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। प्रयोगशाला की आवश्यकता/लक्ष्यों के आधार पर, विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग इन स्फेरॉइड से गोलाकार बनाने और प्रासंगिक सेलुलर सामग्री प्राप्त करने के लिए किया जाता था । इस संदर्भ में, डीएनए, आरएनए या प्रोटीन विश्लेषण के लिए, 3 डी स्फेरॉइड हैंगिंग ड्रॉप विधि के साथ एंडोथेलियल और एपिथेलियल कोशिकाओं को सह-संस्कृति द्वारा उत्पादित किया जाता है। हालांकि, कार्यात्मक अध्ययनों के लिए, उदाहरण के लिए, शॉर्ट इंटरफेरिंग (सिरएनए) ट्रांसफैक्शन और/या हार्मोन उपचार के बाद सेल विकास की निगरानी करने के लिए, स्फेरॉइड यू-बॉटम प्लेटों का उपयोग करके उत्पन्न होते हैं ।

इस तकनीकी प्रोटोकॉल का उद्देश्य 1 के लिए एक विस्तृत कदम-दर-कदम विवरण प्रदान करना है) स्तन कैंसर बहुकोशिकीय प्रकार के स्फेरॉइड बनाने, 2) हिस्टोलॉजिकल धुंधला के लिए नमूने तैयार करना, और 3) आरएनए, डीएनए और प्रोटीन निकालने के लिए कोशिकाओं का संग्रह। दोनों सस्ती हैंगिंग ड्रॉप विधि और अधिक महंगी यू-बॉटम प्लेटों का उपयोग गोलाकार बनाने के लिए किया जाता है। यहां, सेल प्रसार, एपोप्टोसिस और एक गोलाकार के भीतर एपिथेलियल और एंडोथेलियल कोशिकाओं के वितरण का आकलन करने के लिए मार्कर के साथ खंडीकरण और बाद में इम्यूनोस्टेटिंग के लिए तैयार करने (फिक्सिंग) स्फेरॉइड के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल डेटा का एक पूर्ण कदम-दर-चरण विश्लेषण दिखाता है। जैविक डेटा की व्याख्या प्रयोग के प्रकार और इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी के आधार पर भिन्न होती है। फिक्स्ड स्फेरॉइड की धाराओं और बाद में अनुभागों का धुंधला एक नियमित पैथोलॉजी लैब (सोफिस्टोलैब: info@sophistolab.ch) द्वारा किया गया था

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Protocol

1. सेल संस्कृति

नोट: बाँझ परिस्थितियों में सेल हैंडलिंग का संचालन करें।

  1. मानव नाभि नस एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीसी) उपसंस्कृति
    1. कोट 75 सेमी 2 कोलेजन के साथ2 फ्लैक्स (5 μg/सेमी2)(चूहा-पूंछ) रात भर (पर) कमरे के तापमान पर (आरटी) या 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे, पानी से कुल्ला, और फ्लास्क सूखने की अनुमति देते हैं।
    2. विकास माध्यम (ईबीएम-2, एंडोथेलियल बेसल मीडियम-2) में एचएचवीसी को ग्लूटामाइन (1x = 2 mM), एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान (एए; 100 माइक्रोग्राम/स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg/mL, के साथ पूरक किया जाना, पेनिसिलिन का 100 μg/mL और एम्फोटेरिसिन बी का 0.025 μg/mL), एलएसजीएस (2% v/v FCS, हाइड्रोकॉर्टिसोन का 1 μg/mL, मानव एपिडरमल ग्रोथ फैक्टर का 10 एनजी/एमएल, ह्यूमनब्ला बेसिक फाइब्रो बेसिक फाइब्रो ग्रोथ फैक्टर का 3 एनजी/एमएल, मानक ऊतक संस्कृति स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)के तहत 10 μg/ml heparin) और 10% FCS (भ्रूण बछड़ा सीरम) । हर 2 दिन में माध्यम बदलें जब तक कोशिकाएं 70%-80% संगम तक नहीं पहुंच जातीं।
    3. एचबीएसएस के 5 एमएल (सीए2 + और एमजी 2+के बिना) के साथ उप-संकुचित संस्कृतियों को धोएं और 3 मिलीएल ट्रिप्सिन (एचबीबीएस में 0.25% पतला (सीए 2 + और एमजी2 +के बिना) जोड़ें।
      नोट: एचबीएसएस को पीबीएस से भी बदला जा सकता है।
    4. 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (सूक्ष्म रूप से जांचें कि कोशिकाओं को अलग और गोल किया गया है या नहीं) और 10% एफसीएस माध्यम (डीएमईएम-एफ 12 या ईबीएम-2, 10% एफसीएस) के 6 एमएल जोड़कर अलग प्रतिक्रिया को रोकें।
    5. सेंट्रलाइज आरटी में 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेल सस्पेंशन और सुपरनेट को त्यागें।
    6. विकास माध्यम और बीज में कोशिकाओं को 75 सेमी2 फ्लास्क या संस्कृति व्यंजनों में निलंबित करें।
  2. मिशिगन कैंसर फाउंडेशन-7 (एमसीएफ-7, मानव स्तन adenocarcinoma कोशिकाओं) उपसंस्कृति
    1. विकास माध्यम में 75 सेमी2 फ्लैक्स में मानव स्तन कैंसर सेल लाइनें उगाएं (डीएमईएम/एफ12 माध्यम एक वाणिज्यिक ग्लूटामाइन (1x), एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान (ए. ए. के साथ पूरक; स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 माइक्रोग्राम/एमएल, पेनिसिलिन के 100 माइक्रोग्राम/एमएल और एम्फोटेरिसिन बी के 0.025 माइक्रोग्राम/एमएल), और मानक ऊतक संस्कृति स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)के तहत 10% एफसीएस। हर 2-3 दिन में मीडियम बदलें।
    2. एचबीएसएस (सीए2+ और एमजी 2 + के बिना) के 5 एमएल के साथ उप-वर्ती कोशिका संस्कृतियों (70%-80% संगम) को धोएं और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एचबीएसएस (सीए 2 + और एमजी2 +) में 3.5% पतला ट्राइप्सिन (0.5% पतला) जोड़ें (माइक्रोस्कोपिक रूप से सत्यापित करें कि कोशिकाओं को अलग किया जाता है)।
      नोट: एचबीएसएस को पीबीएस से भी बदला जा सकता है।
    3. अलग प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 10% एफसीएस माध्यम के 8 एमएल जोड़ें, आरटी में 5 मिनट के लिए 250 x g पर अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को त्यागें।
    4. 75 सेमी2 फ्लास्क या संस्कृति व्यंजनों में विकास माध्यम और प्लेट में गोली को निलंबित करें।

2. स्फेरॉइड गठन

  1. प्लेट 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल (HUVECs और एमसीएफ-7) एक ३.५ सेमी गोल पकवान और संस्कृति में ४८ घंटे के लिए ।
  2. 24 घंटे या वांछित के रूप में प्लेटेड कोशिकाओं का इलाज या ट्रांसफेक्ट करें।
  3. वैकल्पिक कदम ९६-अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट में प्रदर्शन किया: एचबीबीएस (सीए2 + और एमजी 2+)के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं और नीले रंग के डाई (0.5 माइक्रोग्राम/एमएल) का उपयोग करके दाग HUVECs और एमसीएफ-7 कोशिकाओं को एक हरे रंग की डाई (0.5 माइक्रोन) का उपयोग कर संबंधित विकास माध्यम में पतला और 30-40 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 इनक्यूबेटर में जगह है।
  4. एचबीएसएस के 1 मिलीएल (सीए2 + और एमजी2 +के बिना) के साथ कोशिकाओं को धोएं, एंजाइमैटिक टुकड़ी रिएजेंट के 1 मिलियन (एचयूवीईसी के लिए 0.25% ट्राइप्सिन और एमसीएफ-7 के लिए 0.5% ट्राइपसिन) को पी 1000 पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक राउंड डिश में जोड़ें, और फिर कोशिकाओं को अलग किए जाने तक 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 5 एमएल राउंड-बॉटम पॉलीस्टीरिन ट्यूब में प्रत्येक सेल प्रकार को अलग से इकट्ठा करें और एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए P1000 पिपेट का उपयोग करके 10% एफसीएस माध्यम का 1 मिलियन मिलियन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें।
  6. स्टेरॉयड मुक्त माध्यम (ईबीएम-2, ग्लूटामीन, एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, 0.4% एफसीएस एसएफ (चारकोल-छीन) के 1 मिलीलन में कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक निलंबित करें।
    नोट: स्टेरॉयड मुक्त माध्यम सामान्य विकास माध्यम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
  7. कुल सेल संख्या निर्धारित करने और उपचार माध्यम (ईबीएम-2) की मात्रा की गणना करने के लिए मंद द्वितीय (सामग्री की तालिकादेखें) के 10 एमएल के साथ पतला प्रत्येक कोशिका निलंबन के 100 माइक्रोन का उपयोग करें ग्लूटामाइन, एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, ०.४% एफसीएस एसएफ, वाहन/उपचार) को 5 x 10 3 कोशिकाओं/एमएल या3.4 x 105 कोशिकाओं/एमएल प्रति सेल प्रकार के सेल निलंबन प्राप्त करने की आवश्यकता है ।
    1. सेल काउंट
      1. मशीन को चालू करें और फ़ंक्शन और स्टार्ट बटन (सेट-अप S3) को दबाकर फ्लश करें, जिसमें सेल काउंटर शीशी में पतला II समाधान होता है।
      2. ताजा मंद द्वितीय समाधान के साथ खाली मापने के लिए S4 सेट अप और प्रेस स्टार्ट का उपयोग करें।
      3. डिलुएंंट II समाधान के 10 एमएल में सेल निलंबन के 100 माइक्रोन के साथ प्रस्फुटन शीशी बदलें और नमूनों को मापें: सेट-अप S4 और प्रेस स्टार्ट।
      4. डिजिटल डिस्प्ले पर प्रति एमएल कोशिकाओं की संख्या पर ध्यान दें।
        नोट: सेल काउंटिंग अन्य मैनुअल या स्वचालित प्रणालियों का उपयोग करके भी किया जा सकता है: हेमोसिटोमीटर ग्रिडलाइंस, लाइट-स्कैटर सेल-काउंटिंग तकनीक, विद्युत बाधा, इमेजिंग-आधारित सिस्टम सेल धुंधला का उपयोग करके, उदाहरण के लिए, ट्राइपैन ब्लू।
    2. 96-अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेटें
      1. प्रत्येक कोशिका निलंबन (5 x 10 3 कोशिकाओं/एमएल) के5 एमएल तैयार करें और उन्हें 1:1 के अनुपात में 10 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए मिलाएं।
      2. 96-वेल यू-बॉटम प्लेटों के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 100 माइक्रोन को पिपेट करने के लिए मैन्युअल दोहराने वाले पिपेट का उपयोग करें।
      3. मानक ऊतक संस्कृति स्थितियों के तहत प्लेट को एक इनक्यूबेटर में रखें और 48 घंटे के बाद गोलाकार गठन की जांच करें।
      4. वैकल्पिक कदम: फ्लोरोसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्फेरॉइड (40x) की तस्वीरें लें।
        नोट: यह विधि 48 घंटे (क्षेत्र 1-2 पिक्सेल2)के बाद 96 स्फेरॉइड (एक स्फेरॉइड/वेल) उत्पन्न करती है, और इसका उपयोग आमतौर पर विकास अध्ययन के लिए किया जाता है।
    3. हैंगिंग ड्रॉप
      1. 2 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए 1:1 अनुपात में सेल निलंबन (3.4 x 105 कोशिकाओं/एमएल) को मिलाएं।
      2. 10 सेमी पेट्री डिश के उल्टे ढक्कन पर 15 माइक्रोल बूंदों के रूप में सेल मिश्रण को बीज करने के लिए पी20 पिपेट का उपयोग करें।
      3. बूंदों के साथ ढक्कन को उलटें और बूंदों के वाष्पीकरण से बचने के लिए डिश के नीचे बेस मीडियम (ईबीएम-2) के 5 एमएल जोड़ें।
        नोट: यह विधि 48 घंटे के बाद एक गोलाकार/बूंद उत्पन्न करती है। सुनिश्चित करें कि बूंदें एक दूसरे से पर्याप्त रूप से अलग हैं, ताकि ढक्कन स्विच करते समय वे विलय न हों। जरूरत पड़ने पर एक से ज्यादा 10 सेमी पेट्री डिश का इस्तेमाल करें।

3. स्पेरोइड विकास अध्ययन

  1. 96-वेल यू-बॉटम प्लेट्स में एचयूवीसी और एमसीएफ-7 सेल मिश्रण (5 x10 2 कोशिकाओं/वेल) की प्लेट 100 माइक्रोन और उन्हें इनक्यूबेटर में रखें।
  2. चढ़ाना के बाद 48 घंटे, एक उल्टे माइक्रोस्कोप (उज्ज्वल क्षेत्र) के साथ गोलाकार गठन के लिए जांच करें। तस्वीरें ले लो (उपचार के प्रति कम से कम छह तस्वीरें, 40x) संस्कृति के ९६ घंटे में ।
  3. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चित्रों को खोलें और छवि को 300 पिक्सेल/इंच तक संसाधित करें और छवि को झगड़ा फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  4. इमेजजे सॉफ्टवेयर डाउनलोड कर उसे खोलें। फाइल ऑप्शन पर क्लिक करें और ओपनपर जाएं ।
  5. ब्याज के क्षेत्रों को एक बाइनरी छवि (काले और सफेद) के लिए एक समान तरीके से संतृप्त काले क्षेत्रों में परिवर्तित करें। इसके लिए इमेज ऑप्शन चुनें, टाइप | 8-बिटचुनें। अब, छवि काले और सफेद है।
  6. स्फेरॉइड की सीमा आकर्षित करने के लिए फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें।
  7. रुचि के क्षेत्र की गणना करने और पृष्ठभूमि पिक्सेल से वस्तु या अग्रभूमि पिक्सेल को अलग करने के लिए, दहलीज फ़ंक्शन का उपयोग करें: छवि विकल्प चुनें, सीमापर समायोजित और क्लिक करें।
  8. अब एक थ्रेसहोल्ड पॉप-अप विंडो खुलेगी। शीर्ष बार न्यूनतम सीमा मूल्य को इंगित करता है: मूल्य शून्य पर सेट करें। नीचे बार अधिकतम सीमा मूल्य इंगित करता है: ब्याज के क्षेत्र पूरी तरह से लाल हो जाता है जब तक बार कदम ।
    नोट: यदि रंग लाल नहीं है, तो थ्रेसहोल्ड विंडो से लाल चुनें।
  9. | का विश्लेषण करने के लिए जाओ माप निर्धारित करें और क्षेत्र और परिधिका चयन करें ।
  10. ब्याज के क्षेत्र को मापने के लिए, विश्लेषण विकल्प का चयन करें और विश्लेषण कणों उपकरण का उपयोग करें। विश्लेषण कणों की खिड़की में, आकार को मापने के लिए सेट करें (0.00003-इन्फिनिटी या 3-इन्फिनिटी, स्फेरॉइड के आकार के आधार पर), सारांश और प्रदर्शन परिणामोंका चयन करें। फिर, ठीक परक्लिक करें।
  11. परिणाम एक चार्ट में दिखाई देंगे । डेटा का विश्लेषण करने के लिए माप को स्प्रेडशीट में कॉपी करें।
    नोट: क्षेत्र की गणना कुल पिक्सेल की संख्या के रूप में की जाती है; गणना के लिए कुल क्षेत्र का उपयोग करें।

4. स्पेरोइड इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन

  1. नमूना तैयार करना
    1. एचयूवीईसी और एमसीएफ-7 (5 x 103 कोशिकाओं/वेल) के सेल मिश्रण को 96 घंटे के लिए एचयूवीईसी ग्रोथ मीडियम में 96-वेल यू-बॉटम प्लेट्स में प्लेट करें।
    2. एक P200 μL पिपेट की कटौती टिप के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब में लगभग 50 गोलाकार ले लीजिए; उन्हें गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें, और फिर सुपरनैंट को त्याग दें।
    3. 1 एच, आरटी के लिए 4% पीएफए के 500 माइक्रोन के साथ स्फेरॉइड को ठीक करें।
    4. पीबीएस में 2% नोबेल एगर समाधान उबालें 3-5 मिनट के लिए एक चुंबकीय उभारक के साथ गर्म प्लेट का उपयोग कर एगर उठे पाउडर को पूरी तरह से भंग कर दें और लगभग 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाएं।
    5. पीएफए को पी1000 पिपेट के साथ निकालें, पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ स्फेरॉइड धोएं, और उन्हें तलछट की अनुमति दें। सुपरनेट को त्याग दें।
    6. ध्यान से 1.5 एमएल ट्यूब में एग्राज समाधान के 600 माइक्रोन को स्फेरॉइड के साथ पिपेट करें और ट्यूब को तुरंत 2 मिनट के लिए 177 x ग्राम पर क्षैतिज रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र में रखें।
    7. ट्यूब से प्लग को आसानी से हटाने के लिए एगर उठे समाधान के बीच में एक छोटी स्ट्रिंग जोड़ें।
    8. बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर एगर उठे प्लग को जमना। गोली से बाहर सूखने से बचने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब में पीबीएस के 500 μL जोड़ें।
      नोट: नमूने बाद में निर्जलीकरण, पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्थानांतरित करने, और आईएचसी स्टेनिंग (सोफिस्टोलैब द्वारा किए गए) के लिए तैयार हैं।
  2. छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण
    1. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्फेरॉइड वर्गों की छवियां प्राप्त करें।
    2. फ़ाइलों के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए तीन छवियों .jpg सहेजें।
    3. इमेजजे सॉफ्टवेयर खोलें। जेपीईजी छवि खोलें, फ़ाइल पर क्लिक करें और फिर ओपनपर।
    4. इमेज ऑप्शन में कलर और कलर डेकॉन्वोल्यूशन चुनें।
    5. रंग Deconvolution 1.7 विंडो में एच डीएबी वैक्टर का चयन करें, और तीन छवियों को दिखाई देते हैं।
      नोट: तीन छवियां हैं: रंग 1 केवल हेमटॉक्सीलिन धुंधला (नीला/बैंगनी) का प्रतिनिधित्व करता है, और रंग 2 केवल डीएबी धुंधला (भूरा) का प्रतिनिधित्व करता है । रंग 3 दो धुंधला के साथ छवि विश्लेषण के लिए की जरूरत नहीं है।
    6. रंग 1 विंडो चुनें और सीमा निर्धारित करें: इमेज | पर जाएं समायोजित करें और सीमापर क्लिक करें । थ्रेसहोल्ड विंडो दिखाई देती है।
    7. न्यूनतम सीमा मूल्य शून्य पर सेट छोड़ दें और सही संकेत को प्रभावित किए बिना पृष्ठभूमि संकेत को हटाने के लिए अधिकतम सीमा मूल्य को समायोजित करें। आवेदन पर क्लिक करें।
      1. क्षेत्र माप
        1. विश्लेषणपर क्लिक करें, सेट मापचुनें । क्षेत्र का चयन करें, मतलब ग्रे मूल्य,और मिन और मैक्स ग्रे मूल्य और पुष्टि करने के लिए ठीक पर क्लिक करें ।
        2. विश्लेषण विकल्प का उपयोग कर नाभिक के आकार को मापने, और फिर उपाय का चयन करें।
          नोट: परिणाम विंडो छवि (लेबल), छवि का आकार (क्षेत्र), आईएचसी छवि (मीन) की औसत पिक्सेल तीव्रता और न्यूनतम और अधिकतम ग्रे मान (न्यूनतम, अधिकतम) का नाम देती है। गणना के लिए मतलब मूल्य का उपयोग करें।
        3. रंग 2 (और रंग 3 अगर दोहरी धुंधला है) खिड़की के लिए कदम 4.2.6-4.7.1.2 दोहराएं।
      2. सेल क्वांटिफिकेशन
        1. प्रक्रियापर क्लिक करें, विकल्प बाइनरी चुनें और अलग कोशिकाओं के लिए वाटरशेड का चयन करें।
        2. विश्लेषण करने के लिए जाओ और कणों का विश्लेषणपर क्लिक करें । विश्लेषण कणों पॉप-अप खिड़की पर, अविशिष्ट कणों को बाहर करने के लिए कोशिकाओं के आकार को सेट करें। इसके बाद, शो विकल्प पर, ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर क्लिक करें और रूपरेखा का चयन करें। फिर, ठीक परक्लिक करें।
        3. 2 (और रंग 3 अगर दोहरी धुंधला है) खिड़की के लिए कदम 4.2.6-4.2.7 और सेल मात्राकरण चरण (धारा 4.2.7.2) दोहराएं।
          नोट: अब तीन खिड़कियां दिखाई देंगी: 1) सारांश परिणाम (गणना की गई कोशिकाओं की संख्या, कुल क्षेत्र क्षेत्र, औसत आकार, क्षेत्रफल और मतलब का%), 2) परिणाम (गिना जाने वाली कोशिकाओं से संबंधित), और 3) ड्राइंग विंडो (गिना जाने वाली कोशिकाओं की चित्रित छवि)।

5. स्फेरॉइड में लाइव/डेड स्टेनिंग

  1. डीएमएसओ में कैल्सीन एएम के 4 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें (दाग लाइव सेल ग्रीन) और 1.5 एमएल ट्यूब में डीएमएसओ (दाग मृत कोशिकाओं लाल) में एथिडियम होमोडिम के 2 mm।
  2. ईबीएम-2 में कैल्सीन एएम और एथिडियम होमोडिमर पतला 1:50 के मिश्रण के 10 μL/well जोड़ने के लिए आवश्यक समाधान की मात्रा की गणना करें ।
  3. धुंधला मिश्रण को गोलाकारों में जोड़ें और प्लेट को 30-60 मिनट के लिए मानक ऊतक संस्कृति स्थितियों के तहत इनक्यूबेटर में रखें।
  4. फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्र (40x) प्राप्त करें।

6. स्फेरॉइड प्रोटीन और आरएनए अलगाव

  1. सेल प्रकार प्रति 3.4 x 105 कोशिकाओं/एमएल पर सेल निलंबन तैयार करें, उन्हें 1:1 के अनुपात में मिलाएं, और 10 सेमी पेट्री डिश के ढक्कन पर 15 माइक्रोन ड्रॉप के रूप में P20 पिपेट का उपयोग करके सेल मिश्रण को बीज करें। ढक्कन को उलटें और 96 घंटे के लिए मानक ऊतक संस्कृति स्थितियों के तहत इनक्यूबेटर में रखें।
  2. 5 एमएल बाँझ पॉलीस्टीरिन पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल राउंड-बॉटम पॉलीस्टीरिन ट्यूब में गोलाकार एकत्र करने के लिए पीबीएस के 5-6 एमएल का उपयोग करें।
    नोट: 15 एमएल शंकु नलियों का उपयोग करना भी संभव है।
  3. 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर स्फेरॉइड निलंबन को अपकेंद्रित्र करें, और फिर ध्यान से सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  4. एक सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए 30 एस के लिए P1000 पिपेट का उपयोग करके ट्रिप्सिन (100%) और पिपेट का 500 माइक्रोल जोड़ें।
  5. 10% एफसीएस माध्यम के साथ ट्रिप्पसिन को बेअसर करें, 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल (डीएनए मुक्त आरएनए अलगाव के लिए विशिष्ट किट) के अनुसार, सेल पेलेट को लाइसे करने के लिए आरएनए लाइसिस बफर के 300 माइक्रोन का उपयोग करें।
    नोट: Lysis बफर भी सीधे आरएनए निकालने के लिए बरकरार स्फेरॉइड (कोई ट्रिप्पसिन कदम आवश्यक) में जोड़ा जा सकता है। छर्र स्फेरॉइड में लाइसिस बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें, बर्फ में ट्यूब रखें, और P200 पिपेट का उपयोग करके 10 बार ट्रिट करें। बाद में, ऊपर के रूप में आरएनए अलग। मैट्रिक्स हस्तक्षेप के कारण आरएनए वसूली कम होने पर स्पेरोइड डिससोशिएशन की आवश्यकता हो सकती है।
  7. वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन अलगाव के लिए लाइसिस बफर के 70 माइक्रोन का उपयोग करें। सोनीशन द्वारा 2-4 एस के लिए समरूप और एक बीसीए परख किट का उपयोग कर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करते हैं ।
    नोट: प्रोटीन अलगाव के लिए, पेलेट स्फेरॉइड को सीधे लाइसिस बफर में lysed किया जा सकता है जिसके बाद सोनीशन होता है। पश्चिमी दाग प्रदर्शन करने के लिए कुल प्रोटीन के 25 माइक्रोन का प्रयोग करें।

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Representative Results

एपिथेलियल और एंडोथेलियल सह-संस्कृतियों का उपयोग करने वाले स्फेरॉइड मॉडल को इन विट्रो प्रयोगों के लिए स्तन ट्यूमर की वीवो स्थितियों में बारीकी से नकल करने की आवश्यकता होती है। चित्रा 1 में योजना में स्तन कैंसर एपिथेलियल कोशिकाओं और संवहनी या लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं(चित्रा 1)के साथ गोलाकार बनाने के प्रोटोकॉल को दर्शाया गया है। प्रत्येक कोशिका प्रकार को 3.5 सेमी गोल डिश में अलग से वरीयता प्राप्त किया जाता है और विकास उत्तेजक/अवरोधकों के साथ इलाज किया जाता है या लिपोफेक्टामाइन का उपयोग करके ओलिगोन्यूक्लियोटाइड से संक्रमित होता है। एपिथेलियल या एंडोथेलियल कोशिकाओं के कॉन्फ्लोटेंट मोनोलेयर को ट्राइपसिनाइजेशन के बाद काटा जाता है, धोया जाता है, और 1:1 अनुपात में मिलाया जाता है। कोशिकाओं को बाद में ९६-वेल यू-बॉटम प्लेटों(चित्रा 1A)में या 10 सेमी व्यास गोल कल्चर डिश के उल्टे ढक्कन पर चढ़ाया जाता है ताकि हैंगिंग ड्रॉप कल्चर(चित्रा 1B)की सुविधा मिल सके । सीडिंग के तुरंत बाद, कोशिकाएं प्रत्येक कुएं या बूंद के तल पर कोशिकाओं की सपाट, घने चादरें के रूप में दिखाई देती हैं, और बाद में, वे समय (24-48 एच) के साथ कुल होती हैं, इस प्रकार 48 घंटे पर बरकरार स्फेरॉइड बनाती हैं। शिथिल गठित सेल समुच्चय को किसी भी नुकसान को रोकने के लिए, प्लेटों को कम से कम 24 घंटे के लिए परेशान नहीं किया जाना चाहिए।

यू-बॉटम प्लेटों में, एमसीएफ-7 कोशिकाओं की सीडिंग, लेकिन एंडोथेलियल कोशिकाओं या लिम्फेटिक कोशिकाओं को नहीं, 48 घंटे(चित्रा 2 ए,बी,क्रमशः) के बाद गोलाकार गठन हुआ। इसके अलावा, 1:1 अनुपात में एमसीएफ-7 प्लस एंडोथेलियल कोशिकाओं या लिम्फेटिक कोशिकाओं की सीडिंग के परिणामस्वरूप क्रमशः गोलाकारगठन (चित्रा 2C,D,)भी हुआ। ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में गोलाकार को मान्य करने के लिए, विकास-उत्तेजक समाधान के जवाब में गोलाकार आकार में समय पर निर्भर परिवर्तन मापा/मात्रा निर्धारित किया गया था और अनुपचारित नियंत्रण(चित्रा 2)के साथ तुलना में । चित्रा 2E में फोटोमाइक्रोग्राफ एक प्रतिनिधि एमसीएफ-7 स्फेरॉइड के समय-निर्भर (24-120 एच) अनुक्रमिक वृद्धि दिखाते हैं। चित्रा 2F में लाइन ग्राफ के साथ या एक विकास उत्तेजक के बिना इलाज समय के साथ एमसीएफ-7 spheroids के क्षेत्र में परिवर्तन को दर्शाया गया है । गोलाकार आकार 5 दिनों में ~ 100 माइक्रोन से ~ 200 माइक्रोन तक बढ़ गया; इसके अलावा, विकास उत्तेजक(चित्रा 2F)के साथ इलाज किए गए स्फेरॉइड में बढ़ी हुई वृद्धि दर देखी गई। क्योंकि दीर्घकालिक उपचार (168 एच) के परिणामस्वरूप एमसीएफ-7 व्यवहार्यता कम हो गई, संभावित रूप से स्फेरॉइड(चित्रा 3), 3डी संरचना वृद्धि के केंद्र में हाइपोक्सिक स्थितियों के कारण 96 घंटे तक अध्ययन किया गया। एमसीएफ-7 कोशिकाओं और एचयूवीसी के साथ गठित स्फेरॉइड अकेले एमसीएफ-7 के साथ गठित स्फेरॉइड की तुलना में 168 घंटे में मृत कोशिकाओं की कम संख्या दिखाते हैं।

प्रारंभिक प्रयोगों में, संस्कृति के 4 दिनों के बाद स्फेरॉइड के आकार में केवल एक छोटी सी वृद्धि देखी गई। यह परिकल्पना की गई थी कि यह गोलाकार बनाने के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की उच्च संख्या के कारण हो सकता है। यू-बॉटम कल्चर प्लेट्स में स्फेरॉइड की ग्रोथ कुएं के अवतल आकार से सीमित हो सकती थी । चूंकि विकास वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या पर निर्भर था, इसलिए विभिन्न सेल नंबरों का उपयोग उन स्थितियों का परीक्षण करने और स्थापित करने के लिए स्फेरॉइड बनाने के लिए किया जाता था जो गोलाकार विकास की निगरानी के लिए इष्टतम होंगे। जैसा कि चित्रा 4में दर्शाया गया है, निष्कर्षों से पता चलता है कि स्फेरॉइड विकास अध्ययनों के लिए, 500 कोशिकाओं/अच्छी तरह से स्फेरॉइड बनाने के लिए 4-6 दिनों के लिए गोलाकार के विकास की निगरानी के लिए विश्वसनीय और प्रजनन योग्य था । 5 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से बोने के बाद 4 दिन पर हिस्टोलॉजिकल या प्रतिरक्षा-हिस्टोलॉजिकल टिप्पणियों के लिए सबसे उपयुक्त स्फेरॉइड प्राप्त किए गए थे । यह वही प्रारंभिक एकाग्रता सेल प्रोटीन या आरएनए अर्क के लिए इस्तेमाल किया गया था। 7.5 x 103 कोशिकाओं से अधिक द्वारा प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता में वृद्धि/

सेल संरचना, प्रसार और एपोप्टोसिस स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए, स्तन कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ गठित स्फेरॉइड के हिस्टोलॉजिकल वर्गों की जांच एचएंडई और Ki67 (तनु पड़ने 1:300) और क्लीव्ड कैसपास-3 (कमजोर 1:500) एंटीबॉडी का उपयोग करके की गई थी। अंतिम नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के लिए देखभाल/ध्यान और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है । चित्रा 5A संग्रह के लिए कार्यप्रवाह को दर्शाया गया है और खंड के लिए agarose में गोलाकार के समावेश । चित्रा 5Bमें फोटोमाइक्रोग्राफ-सी उपस्थिति में एमसीएफ-7 स्फेरॉइड गठन में अंतर प्रदर्शित करताहै (चित्रा 5B)और लिपोफेटामाइन (0.17% अंतिम एकाग्रता), एक आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ट्रांसफैक्शन एजेंट की अनुपस्थिति(चित्रा 5C)। हिस्टोलॉजिकल वर्गों की उज्ज्वल-क्षेत्र सूक्ष्म छवियां दो सेल प्रकारों(चित्र 5डी-जी)के समरूप मिश्रण की एक परिपत्र, कॉम्पैक्ट संरचना दिखाती हैं। स्फेरॉइड की संरचना और उनकी कोशिकाओं के आकार ने लिपोफेक्टामाइन(चित्रा 5डी)की उपस्थिति में नियंत्रण ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ ट्रांसफेक्शन के बाद कोई असामान्यताएं नहीं दिखाई दीं। इसके अलावा, प्रोलिफेरेटिव मार्कर, Ki67 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को गोलाकारों में सजातीय रूप से वितरित किया गया; हालांकि, स्फेरॉइड(चित्रा 5E)की सतह पर प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं की एक अंगूठी भी देखी गई थी। क्लीव्ड कैस्पास-3 धुंधला संस्कृति के 4 दिनों(चित्रा 5F)के बाद एपोप्टोटिक कोशिकाओं को दिखाया । हिस्टोलॉजिकल सेक्शन विशिष्ट मार्कर का उपयोग करके स्पेरोइड में एपिथेलियल और एंडोथेलियल कोशिकाओं के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी होते हैं। एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एक विशिष्ट मार्कर के रूप में CD31 का उपयोग करना, 3 डी संरचना के भीतर उनके वितरण का निर्धारण करना संभव है। चूंकि सभी कोशिकाओं को हेमटॉक्सीलिन (कोशिका के नाभिक का नीला धुंधला) से सना हुआ है, इसलिए सीडी 31 अभिव्यक्ति की गणना उपचार या ट्रांसफेक्शन (प्रोटोकॉल धारा 4.2.7.1.) के बाद एंडोथेलियल कोशिकाओं वाले स्फेरॉइड का क्षेत्र प्रदान कर सकती है। इसके अलावा, दोहरी धुंधला परख करके, यह और भी अधिक जानकारी होना संभव है, उदाहरण के लिए, जैसा कि चित्रा 5G,सीडी 31 दाग एंडोथेलियल कोशिकाओं (लाल) और Ki67 दाग प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं (भूरे रंग) में दिखाया गया है। प्रोटोकॉल धारा 4.2.7.2 के बाद, चित्रा 5G से पता चला है कि 55% एपिथेलियल कोशिकाएं हैं, 45% एंडोथेलियल कोशिकाएं हैं, और 25% कोशिकाएं प्रसारित हो रही हैं।

जीवित रंगों के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण का उपयोग करके स्फेरॉइड की संरचना का भी अध्ययन किया जा सकता है। HUVEC और एमसीएफ-7 कोशिकाओं की 2डी संस्कृतियों को अलग से नीले (HUVEC) और हरे रंग (एमसीएफ-7) रंगों से दाग दिया गया था। बाद में, दाग कोशिकाओं को एकत्र किया गया और 1:1 अनुपात पर मिलाया गया और स्फेरॉइड गठन के लिए कुओं में वरीयता प्राप्त किया गया। फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की छवियां दाग बोने के तुरंत बाद लिया गया(चित्रा 6A)और संस्कृति के 3 दिनों के बाद(चित्रा 6B)। जीवित और मृत कोशिकाओं के प्रतिशत का आकलन करने के उद्देश्य से, 4 दिन पुराने स्फेरॉइड कैल्सीन-एएम (ग्रीन) और एथिडियम होमोडिम (लाल)(चित्रा 6C)के साथ दाग रहे थे। एमसीएफ-7 और एचयूवीसी के साथ गठित स्पेरोइड्स को फ्रीजिंग कोशिकाओं के लिए मानक प्रोटोकॉल (10% DMSO और 10% FCS के साथ पूरक विकास माध्यम) का उपयोग करके सफलतापूर्वक जमे हुए/संरक्षित नहीं किया जा सकता है । जमे हुए और गल गए गोलाकार में, सेल समुच्चय का टूटना और कोशिका व्यवहार्यता का नुकसान स्पष्ट था। चित्रा 6 डी में प्रतिनिधि छवि मृत और जीवित कोशिकाओं के लिए एक हौसले से गल गोलाकार दाग दिखाता है । इससे पता चलता है कि स्फेरॉइड ठंड की स्थिति के प्रति बहुत संवेदनशील हैं।

प्रायोगिक परिस्थितियों में संस्कृति के 5 दिनों के बाद, विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रोटीन (~ 3 μg/mL) या आरएनए (~ 60 एनजी/μL) एकत्र करने के लिए लगभग 100 स्फेरॉइड का लाइसिस आवश्यक था। चित्रा 7 आर-गोलाकार संग्रह (लटकती बूंदों विधि के साथ उत्पन्न) से एक कार्यप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है, जो प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सेल लाइसिस के लिए भविष्य में माइक्रोएरी परख या आरटी-पीसीआर द्वारा विश्लेषण के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग या आरएनए अलगाव का प्रदर्शन करता है। माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए एक गोलाकार में एक विषम कोशिका आबादी से आरएनए/डीएनए का अलगाव कुछ उपयोगी जानकारी ला सकता है । हालांकि, प्रमुख सेल-विशिष्ट तंत्र या सेल-सेल इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए, गोलाकार कोशिकाओं को एंजाइमेटिक (ट्राइप्सिन या एक्पुटा) वियोजन के बाद अलग किया जा सकता है, जो माइक्रोएरी विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली विशिष्ट कोशिकाओं से एफएसीएस विश्लेषण और आरएनए का उपयोग करके अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, एंटीबायोटिक प्रतिरोधी सेल लाइनों (उदाहरण के लिए, EGFP और/या puromycin प्रतिरोध सेल लाइनों का उपयोग करके) सेल सेल बातचीत के एक विशिष्ट सेल प्रकार की भूमिका को संबोधित करने के लिए spheroids में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, विशिष्ट सेल-सेल इंटरैक्शन मुद्दों को संबोधित करने के लिए कोशिकाओं को इंजीनियर करने के लिए जीन साइलेंसिंग टूल का उपयोग किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:गोलाकार गठन का कार्यप्रवाह। एमसीएफ-7 और एचयूवीईसी या एचयूवीसी कोशिकाओं को 2डी संस्कृतियों में अलग से उगाया जाता है और विभिन्न वांछित उपचारों के बाद एकत्र किया जाता है। गोलाकार बाद में(ए)96-वेल यू-बॉटम प्लेटों में कोशिकाओं के सीधे मिश्रण से उत्पन्न होते हैं, जो सेल-टू-सेल एकत्रीकरण द्वारा 3 डी संरचना के गठन को बढ़ावा देते हैं, या(बी)लटकती ड्रॉप संस्कृति का उपयोग करके जो गुरुत्वाकर्षण के बल के माध्यम से स्फेरॉइड गठन का समर्थन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:समय के साथ गोलाय गठन और विकास। छवियां एमसीएफ-7 कोशिकाओं(पैनल ए)द्वारा एक गोलाकार के गठन को दर्शाती हैं, एंडोथेलियल या लिम्फेटिक कोशिकाओं (एचयूवीसी) द्वारा स्फेरोइड गठन की कमी; (पैनलबी)) एक ही घनत्व पर चढ़ाया जाता है, और एमसीएफ-7 कोशिकाओं के साथ-साथ एचवीईसी या एलईसी द्वारा 1:1 अनुपात(पैनल सी, डी)पर मिश्रित द्वारा गोलाकार गठन। इसके अलावा चित्रित समय के साथ एक गोलाकार के आकार में वृद्धि (24 घंटे, ४८ एच, ७२ एच, ९६ एच, और १२० घंटे) है । यह स्फेरॉइड एमसीएफ-7 प्लस एचयूवीसी के मिश्रण से 1:1 अनुपात में बनाया गया था और 500 कोशिकाओं के घनत्व पर वरीयता प्राप्त था/ लाइन ग्राफ(पैनल एफ)नियंत्रण के समय पर निर्भर विकास (सीटीआर) बनाम विकास-उत्तेजित (उपचार) स्फेरॉइड दिखाता है। स्फेरॉइड के क्षेत्रों को मापा गया और अनुपचारित और इलाज स्फेरॉइड के बीच तुलना की गई। परिणाम संबंधित नियंत्रण ± तुलना में एसईएम, *** पी < 0.001 का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:गोलाकार दीर्घकालिक संस्कृति और व्यवहार्यता। फोटोमाइक्रोग्राफ 96 एच(पैनल ए)और 168 एच(पैनल सी)पर अकेले एमसीएफ-7 कोशिकाओं के साथ गठित स्फेरोइड में सेल व्यवहार्यता दिखाता है, जबकि पैनल बी और डी एमसीएफ-7 प्लस एचवेक्स (1:1 अनुपात) पर 96 घंटे(पैनल बी)और 168 एच(पैनल डी)(स्केल बार = 100 μm) पर बने स्फेरॉइड में सेल व्यवहार्यता को दर्शाते हैं। कोशिकाओं को कैल्सेइन (लाल, मृत कोशिकाओं) और एथिडियम होमोमर (हरी, जीवित कोशिकाओं) से सना हुआ था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एमसीएफ-7 प्लस एचयूवीईसी स्फेरॉइड का सेल सीडिंग घनत्व और समय पर निर्भर विकास प्रोफ़ाइल। एचयूवीसी और एमसीएफ-7 कोशिकाओं को 1:1 अनुपात में मिश्रित घनत्व (102-104 कोशिकाओं/अच्छीतरह से) में वरीयता प्राप्त किया गया था, और 24-96 घंटे से अधिक गोलाकारों के विकास पर नजर रखी गई थी । समय के साथ गोलाकार विकास का आकलन करने के लिए सूक्ष्म उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (स्केल बार = 200 माइक्रोन, 40x) लिया गया था। 500 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाएं/अच्छी तरह से प्रदान की गई इष्टतम आकार स्फेरॉइड विकास का अध्ययन करने के लिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:खंड और हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग के लिए स्पेरोइड एम्बेडिंग। पैनल ए:एचयूवीसी/एमसीएफ-7 स्फेरॉइड के संग्रह और समावेश के लिए कार्यप्रवाह को दर्शाता कार्टून। एक एगर उठे प्लग और पैराफिन ब्लॉक के खंड में स्फेरॉइड के पैराफिन एम्बेडिंग के बाद, नमूनों का उपयोग मानक हिस्टोलॉजिकल धुंधला के लिए किया गया था। पैनल बी और सी शो प्रतिनिधि एमसीएफ-7 प्लस HUVEC spheroids बिना और Lipofectamine २००० के साथ इलाज किया, क्रमशः (स्केल बार = २०० माइक्रोन, 40x)। पैनल डी-जी विशिष्ट मार्कर के साथ दाग गोलाकार वर्गों के प्रतिनिधि छवियों को दिखाते हैं। पैनल डी गोलाकार संरचना (स्केल बार = 100 माइक्रोन) का आकलन करने के लिए हेमेटॉक्सीलिन-इओसिन से सना हुआ गोलाकार दिखाता है। पैनल ई में धुंधला कोशिकाओं को सकारात्मक Ki67 के साथ दाग दर्शाया गया है । पैनल एफ एक स्फेरोइड में एपोटोटिक कोशिकाओं को दिखाता है जो क्लीव्ड कैस्पेज़-3 (स्केल बार = 50 माइक्रोन) के साथ सकारात्मक रूप से दाग दिया जाता है। पैनल जी दोहरी धुंधला के साथ गोलाकार वर्गों को दर्शाया गया है: सीडी 31 (एंडोथेलियल कोशिकाओं मार्कर) और Ki67 (प्रोलिफेरेटिव मार्कर) (स्केल बार = १०० μm) । स्फेरॉइड और स्टेनिंग की धारा सोफिस्टोलैब (info@sophistolab.ch) द्वारा की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:एमसीएफ-7/HUVEC स्पेरोइड्स की फ्लोरेसेंस छवियां सेल वितरण और व्यवहार्यता दिखा रही हैं । पैनल ए और बी एक हरे रंग की डाई के साथ दाग एक नीले रंग और एमसीएफ-7 कोशिकाओं के साथ दाग HUVECs के साथ प्रतिनिधि गोलाकार चित्रित । स्पेरोइड के भीतर एचयूवीईसी और एमसीएफ-7 का स्थानीयकरण सीडिंग(ए)के तुरंत बाद और स्फेरॉइड गठन(बी)(स्केल बार = 250 माइक्रोन) के तुरंत बाद भिन्न होता है। पैनल सी-डी सामान्य संस्कृति स्थिति(सी)में 3डी संरचनाओं में लाइव (हरे) और मृत कोशिकाओं (लाल) की पहचान करने के लिए Calcein/एथिडियम होमोडिमर के साथ दाग गोलाकार दिखाते हैं और ठंड के बाद(डी)(स्केल बार = 100 माइक्रोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए गोलाकार संग्रह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कार्टून स्फेरॉइड फसल, अलग या रिलीज कोशिकाओं के लिए योजना दिखा रहा है, और उन्हें प्रोटीन विश्लेषण या आरएनए निष्कर्षण के लिए लाइसिस समाधान में निलंबित कर रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

2डी सेल संस्कृतियों की तुलना में, क्रांतिकारी 3 डी स्फेरोइड संस्कृति प्रौद्योगिकी एक अंग के माइक्रोएनवायरमेंट, सेल-सेल इंटरैक्शन और विट्रो मेंदवा प्रतिक्रियाओं के पुनर्निर्माण के लिए एक बेहतर और अधिक शक्तिशाली उपकरण है। यह पहला प्रोटोकॉल है जो स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए बहुकोशिकीय (एपिथेलियल और एंडोथेलियल) सेल लाइनों से स्फेरॉइड के गठन का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल 5 दिनों तक स्फेरॉइड की गोलाकार 3डी वृद्धि सुनिश्चित करता है, और पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग के बाद स्फेरॉइड की जांच की जा सकती है। दिलचस्प बात यह है कि स्फेरॉइड के भीतर सेलुलर तत्व अभी भी रिसेप्टर्स को व्यक्त करते हैं जो सेल विकास को बढ़ावा देते हैं और प्रसार और एपोटोटिक उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी हैं। वर्णित प्रोटोकॉल प्रोटीन या आरएनए/डीएनए विश्लेषण के लिए पर्याप्त जैविक सामग्री उत्पन्न करता है । उपर्युक्त सह-संस्कृति प्रणाली, प्रयोगशाला की स्थिति में आसानी से और कम लागत पर हासिल की गई, भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए एक लाभ हो सकता है, विशेष रूप से स्तन कैंसर चिकित्सा में और नशीली दवाओं की संवेदनशीलता परीक्षण के लिए। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न एपिथेलियल और एंडोथेलियल सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है।

विट्रो में एक जटिल ऊतक की नकल करना बेहद मुश्किल है जो वीवो मेंमौजूद है । इसका कारण यह है कि वीवो ऊतकों में कई बातचीत घटक होते हैं, जिनमें तंत्रिकाएं, रक्त वाहिकाएं, मेसेनचिम और प्रतिरक्षा कोशिकाएं30,42शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वास्तविक ट्यूमर राज्य से संपर्क करने के लिए दो अलग-अलग सेल प्रकारों के साथ 3 डी सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके इनमें से कुछ सीमाओं को दूर करना है। यहां, गोलाकारों का गठन किया गया है, जो एंडोथेलियल कोशिकाओं या लिम्फेटिक कोशिकाओं के संयोजन में एपिथेलियल ट्यूमर कोशिकाओं के साथ मिलकर वीवो स्थिति में यथासंभव नकल करने के लिए है, जिसमें सेल-सेल इंटरैक्शन, कोशिकाओं के मरने से अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में जारी होने वाले एपोबाइटिक कारकों की संवेदनशीलता और गोलाकार के केंद्र में हाइपोक्सिक स्थितियां शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल को विकास कारकों, संकेत कारकों और हार्मोन के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के परीक्षण के लिए अनुकूलित किया गया है, जो तेजी से सिग्नलिंग कैस्केड को सक्रिय करता है और जीन ट्रांसक्रिप्शन को लक्षित करता है और प्रोटीन अभिव्यक्ति और परिवहन को प्रोत्साहित करता है30,31। स्फेरॉइड में, लेकिन वीवो मेंनहीं, उत्तेजनाओं के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं का तेजी से और अक्सर मूल्यांकन किया जा सकता है।

वर्तमान अध्ययन में, गोलाकार में एंडोथेलियल कोशिकाएं केशिका जैसी संरचनाएं नहीं बनाती हैं। चूंकि एंडोथेलियल कोशिकाओं को उच्च घनत्व पर कम घनत्व और मोनोलेयर पर चढ़ाया जाने पर केशिकाओं के रूप में दिखाया गया है, इसलिए यह संभव है कि एमसीएफ-7 को एंडोथेलियल कोशिकाओं के अनुपात में कम करने से गोलाकार के भीतर केशिका गठन हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट मैट्रिक्स प्रोटीन या मैट्रिक्स के अलावा केशिका गठन को बढ़ावा दे सकता है। स्फेरॉइड में केशिका जैसी संरचना की कमी एमसीएफ-7 प्लस एंडोथेलियल कोशिकाओं बनाम एमसीएफ-7 कोशिकाओं के लाभ को कमजोर नहीं करती है, क्योंकि एमसीएफ-7 कोशिकाओं द्वारा जारी कारक एंडोथेलियल सेल प्रसार को बढ़ावा दे सकते हैं और इसके विपरीत; एमसीएफ-7 में केवल स्फेरॉइड जैसी बातचीत का पता नहीं चला।

कई अध्ययनों से पता चला है कि 5 x 10 3 कोशिकाएं / अच्छीतरह से बीज कोशिकाओं को गोलाकार43 , 44,45,46,47बनाने के लिए उपयुक्त एकाग्रता थी । हालांकि, 96-अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेटों में, कोशिकाओं की इस संख्या ने प्रायोगिक परिस्थितियों में गोलाकार के समन्वित विकास को सीमित कर दिया। इसलिए, प्रत्येक नए अध्ययन में, प्रत्येक नए सेल प्रकार के लिए, दवा उपचार के बाद 3 डी प्रणाली के विकास की निगरानी करना महत्वपूर्ण है, ताकि गोलाकार आकार पर उपचार के प्रभावों को निर्धारित किया जा सके।

वर्तमान प्रोटोकॉल की सीमा यह है कि शास्त्रीय डीएमएसओ विधि द्वारा ठंड और विगलन के बाद पहले से गठित स्फेरॉइड की संस्कृति को जारी नहीं रखा जा सकता है। दरअसल, गल जाने पर ज्यादातर कोशिकाएं मर चुकी थीं। विट्रिफिकेशन कोशिकाओं को जीवित रखने के लिए एक विकल्प साबित हो सकता है48.

त्रुटियों से बचने और अच्छी तरह से गठित गोलाकारों का उत्पादन और रखरखाव करने के लिए तकनीकी विवरणों पर सावधानीपूर्वक ध्यान देना आवश्यक है। एक चुनौती इम्यूनोस्टेपिंग (धारा 4.1) के लिए नमूना तैयारी है। 1.5 एमएल ट्यूब में स्फेरॉइड को पाइप करके स्थानांतरण को सुविधाजनक बनाने के लिए, कैंची के साथ पी 200 टिप कट का उपयोग करना महत्वपूर्ण है ताकि छेद का क्षेत्र स्वयं गोलाकार से बड़ा हो। अन्यथा, स्थानांतरण गोले को नष्ट कर सकता है। एक और चुनौती यह है कि कैसे माध्यम के बाद spheroids एक परीक्षण ट्यूब के नीचे करने के लिए बसे है आकांक्षी है । इस संबंध में, स्फेरॉइड की आकांक्षा से बचने के लिए वैक्यूम पंप के बजाय पी1000 पिपेट का उपयोग करना बेहतर है। खंड के लिए स्फेरॉइड तैयार करने में एक महत्वपूर्ण और नाजुक कदम पेलेट स्फेरॉइड में एगर उठे को जोड़ना है। एक बार एगर उठे में निलंबित किए गए स्फेरॉइड को कमरे के तापमान पर क्षैतिज अपकेंद्रित्र का उपयोग करके और एगर उठे बहुलक होने से पहले माइक्रोफ्यूज ट्यूब के नीचे जल्दी से गोली चलाना चाहिए।

कुल मिलाकर, एमसीएफ-7 और एंडोथेलियल कोशिकाओं से बना दो-सेल गोलाकार सेल-सेल इंटरैक्शन और तंत्र की जांच करने के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है जो ट्यूमर के भीतर कैंसर कोशिकाओं या एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकास को ड्राइव करता है। स्फेरॉइड ट्यूमर या कैंसर के विकास को लक्षित करने वाले चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात, इस दो सेल मॉडल आगे ट्यूमर के विकास में प्रासंगिक अन्य सेल प्रकार शामिल करने के लिए तात्कालिक किया जा सकता है। इस संदर्भ में, स्तन ट्यूमर द्रव्यमान का 80% गठन करने वाले फाइब्रोब्लास्ट को एमसीएफ-7, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट स्फेरॉइड बनाने के लिए शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, जीन चुप्पी और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर कोशिकाओं सेल सेल बातचीत, हार्मोन रिसेप्टर्स (एस्ट्रोजन/प्रोजेस्टेरोन), विकास कारकों, और ट्यूमर/कैंसर के विकास पर संकेत रास्ते के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नए कैंसर विरोधी अणुओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने की भूमिका को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को कैंसर रिसर्च फाउंडेशन/स्विस कैंसर लीग ग्रांट केएफएस-4125-02-2017 ने आरकेडी और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट DK079307 को EKJ को समर्थन दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

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