母体クリスパントによる初期発生における母体発現遺伝子の役割の決定
Summary
初期の開発は母性遺伝製品に依存しており、これらの製品の多くの役割は現在不明です。ここでは、CRISPR-Cas9を使用して、単一世代で母性効果表現型を特定するプロトコルについて説明しました。
Abstract
初期の発生は、卵形成中に成熟卵母細胞に組み込まれた母性因子のプールに依存し、接合子ゲノムが活性化されるまで発生に必要なすべての細胞機能を実行します。典型的には、これらの母性因子の遺伝的標的化は、母性効果表現型を同定するために追加の世代を必要とし、発生中の母体発現遺伝子の役割を決定する能力を妨げる。CRISPR-Cas9の双対立遺伝子編集機能の発見により、注入された胚または「クリスパント」の体細胞組織における胚表現型のスクリーニングが可能になり、発生プログラムにおいて接合体発現遺伝子が果たす役割の理解が深まりました。この記事では、クリスパントメソッドの拡張であるプロトコルについて説明します。この方法では、生殖細胞の二対立遺伝子編集により、単一世代で母性効果表現型、または「母体クリスパント」を単離することができます。単一の標的への多重化ガイドRNAは、母体クリスパントの効率的な生産を促進し、母体クリスパント一倍体の配列解析は、母体効果表現型を生成する遺伝的病変を裏付ける簡単な方法を提供します。母体クリスパントの使用は、母体発現必須遺伝子の迅速な同定をサポートし、したがって早期発生の理解を容易にする。
Introduction
母体寄託産物(RNA、タンパク質、その他の生体分子など)のプールは、胚の接合子ゲノムが活性化されるまでのすべての初期の細胞プロセスに必要です1。卵母細胞からのこれらの産物の時期尚早の枯渇は、典型的には胚性致死性である。発生におけるこれらの遺伝子の重要性にもかかわらず、多くの母体発現遺伝子の役割は現在不明です。CRISPR-Cas9などのゼブラフィッシュの遺伝子編集技術の進歩により、母体発現遺伝子の標的化が可能になりました2,3,4。ただし、母性効果表現型の同定には、接合子表現型と比較して余分な生成が必要であり、したがって、より多くのリソースが必要です。最近、CRISPR-Cas9の双対立遺伝子編集機能は、「クリスパント」として知られる注射された(F0)胚の体細胞組織における胚表現型のスクリーニングに使用されています5,6,7,8,9,10。クリスパント技術は、体細胞内の候補遺伝子の資源効率の高いスクリーニングを可能にし、発生における特定の側面の理解を容易にします。この論文で説明されているプロトコルは、単一の世代11で母性効果表現型、または「母体クリスパント」の同定を可能にします。このスキームは、ガイドRNAを単一の遺伝子にマルチプレックスし、生殖細胞系列における双対立遺伝子編集イベントを促進することによって達成可能です。これらの母体のクリスパント胚は、肉眼的形態学的表現型によって識別することができ、細胞境界の標識やDNAパターニングなどの一次特性評価を受けることができます11。誘導されたINDELの観察可能な表現型と基本的な分子特性を組み合わせた解析により、初期発生における標的遺伝子の役割を予測することができます。
ゼブラフィッシュでは、受精後最初の24時間(hpf)の間に、細胞の小さなグループが生殖系列12,13,14,15の前駆細胞である始原生殖細胞に発達します。F0雌が産んだクラッチでは、回収される母体のクリスパント胚の割合は、標的遺伝子に双対立遺伝子編集イベントを含む生殖細胞の数によって異なります。一般に、編集イベントが胚で早く発生するほど、生殖系列でCRISPR-Cas9変異が観察される可能性が高くなります。ほとんどの場合、母体のクリスパント胚の表現型は、発生中の卵母細胞に存在する2つの母体の対立遺伝子の機能の喪失に由来します。卵母細胞が減数分裂を終了すると、母体の対立遺伝子の1つが極体を介して胚から押し出され、もう一方の対立遺伝子が母体の前核に取り込まれます。複数の母体のクリスパント一倍体の配列決定は、表現型11に寄与する生殖細胞系列に存在する突然変異(挿入および/または欠失(INDEL))の混合物を表します。
以下のプロトコルでは、母体効果遺伝子にCRISPR-Cas9変異を作成し、母体クリスパントアプローチを使用して対応する表現型を特定するために必要な手順を説明しています(図1)。セクション1では、ガイドRNAを効果的に設計および作成する方法を説明しますが、セクション2と3には、マイクロインジェクションによって母体のクリスパンを作成するための重要なステップが含まれています。CRISPR-Cas9混合物を注入した後、注入された胚はPCRを介して体細胞編集についてスクリーニングされます(セクション4)。注入されたF0胚が発達して性的成熟に達すると、F0メスは野生型のオスに交配され、その子孫は母親効果表現型についてスクリーニングされます(セクション5)。セクション6には、CRISPR-Cas9誘発INDELを特定するためにサンガーシーケンシングと組み合わせることができる母体のクリスパント一倍体の作成に関する指示が含まれています。さらに、ディスカッションには、この方法の感度とパワーを高めるためにプロトコルに加えることができる変更が含まれています。
Protocol
このプロトコルの開発につながる研究では、すべてのゼブラフィッシュの飼育と実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の施設動物管理および使用委員会(IACUC-M005268-R2)によって承認されました。 1. ガイドRNAの合成 注:接合クリスパントは、単一のガイドRNAを使用するか、複数のガイドRNAを単一のターゲットにマルチプレックスして作成?…
Representative Results
このプロトコルに記載されている実験的アプローチにより、母性効果表現型を迅速かつ資源効率の高い方法で同定することができます(図1)。 母体のクリスパントの生成:単一の母体効果遺伝子候補を標的とする4つのガイドRNAを設計する場合、ガイドRNAがDNAに結合する場所に特別な配慮が必要です。一般に、それらはすべて、最初の予…
Discussion
この原稿で提示されたプロトコルは、順方向および逆方向の遺伝学的手法の両方に必要な複数世代ではなく、単一世代における母性効果表現型の同定および一次分子特性評価を可能にする。現在、多くの母体発現遺伝子の役割は不明です。この知識の欠如は、母性効果遺伝子を特定する際に表現型を視覚化するために必要な余分な生成に一部起因しています。過去には、ゼブラフィッシュの?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
過去および現在のペレグリ実験動物飼育スタッフの方々に、水生施設の世話をしてくれたことに感謝します。また、ライアン・トレヴェナとダイアン・ハンソンによる原稿に対するコメントと洞察にも感謝しています。資金はNIH助成金からFPに提供されました(GM065303)
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
| 100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
| 70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
| Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
| Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
| Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
| Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
| Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
| Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
| General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Gloves | Any Maker | ||
| Ice Bucket | Any Maker | ||
| Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Female zebrafish | |||
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
| Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
| MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
| Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
| Micropipeters | Any Maker | ||
| Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
| Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
| Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
| Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
| nuclease-free water | Any Maker | ||
| Paper Towel | Any Maker | ||
| Pastro Pipettes | Any Maker | ||
| PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
| Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
| Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
| Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
| Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatula | Any Maker | ||
| Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
| Tape | Any Maker | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
| Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
| UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
| Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
| 1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse free ethanol | any maker | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
| Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agarose | any maker | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | any maker | ||
| Dissecting Forcepts | any maker | ||
| Dissecting Microscope | any maker | ||
| Dissecting Scissors | any maker | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
| Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fish Net | any maker | fine mesh | |
| Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
| Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
| Gel Electropheresis System | any maker | ||
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
| Glass Dishes | any maker | ||
| Gloves | any maker | ||
| Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ice Bucket | any maker | ||
| Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
| In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Male and Female zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Microinjector | |||
| Microneedle Slide | |||
| Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
| Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
| Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
| Microplastic slide | |||
| Microwave | any maker | ||
| MiliQ Water | any maker | ||
| mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Narrow Spatula | any maker | ||
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Paper Towel | any maker | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
| PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
| Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
| Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software for sanger sequencing Analysis | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterlie H2O | any brand | ||
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Tape | any brand | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
| UV lamp | UVP | ||
| UV safety glasses | any maker | ||
| Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
| Zebrafish mating boxes | any maker | ||
| PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |
Referências
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Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).